Effect of carotenoids on expression of heat shock protein 22 gene in pearl oyster (Pinctada fucata)
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摘要: 该研究获得了合浦珠母贝(Pinctada fucata)热休克蛋白22 (heat shock protein 22，PfHSP22)基因cDNA序列，全长2 187 bp，其中开放阅读框699 bp，预测编码232个氨基酸。结构预测显示PfHSP22具有小热休克蛋白家族典型结构域“α-晶体结构域”(ACD)。氨基酸序列比对结果显示，PfHSP22与缢蛏(Sinonovacula constricta)的HSP22相似性最高(54%)。进化分析显示，PfHSP22与软体动物的亲缘关系较近。实时荧光定量PCR结果分析表明，常温条件下，PfHSP22在类胡萝卜素含量高的橘色组和含量低的白色组的各组织中均有表达，足中表达量最高，且橘色组均显著高于白色组(P<0.05)，表明类胡萝卜素含量高低可能影响PfHSP22的基础表达量。高温胁迫时，橘色组和白色组各组织的PfHSP22表达量在前3 h基本呈现下降趋势，之后呈现出或升高或下降的复杂变化；其中橘色组一些组织的PfHSP22表达量显著升高时间晚于白色组，这可能是由类胡萝卜素含量差异引起。Abstract: We obtained the full-length cDNA sequence of heat shock protein 22 gene (GenBank accession No.: MG013985, named PfHSP22) from pearl oyster (Pinctada fucata). The full length of PfHSP22 cDNA was 2 187 bp, including a 699 bp ORF (open reading frame) which encoded 232 amino acid residues. PfHSP22 was predicted to contain the "α-crystal domain" (ACD), a typical domain of the small heat shock protein family. The amino acid sequence alignment results show that PfHSP22 had the highest similarity (54%) with HSP22 of Sinonovacula constricta. The phylogenetic analysis shows that PfHSP22 was closely related with molluscs. The qRT-PCR (quantitative real-time PCR) analysis reveals that PfHSP22 gene was expressed in various tissues of orange adductor muscle individuals with high carotenoids content and white adductor muscle individuals with low carotenoids content. The highest expression of PfHSP22 was observed in foot, and the expression of PfHSP22 in orange group was significantly higher than that in white group at normal temperature (P<0.05). It is indicated that the level of carotenoids might affect the basic expression of PfHSP22 gene. During the high temperature stress process, the expression of PfHSP22 in each tissue generally showed a downward trend in the first 3 h, and then showed a complex change of increase or decrease. There were several tissues whose time for PfHSP22 gene expression to rise significantly was later in orange group than in white group, which might be caused by the difference in the carotenoid content.
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Keywords:
- Pinctada fucata /
- HSP22 /
- carotenoids /
- expression analysis /
- small heat shock protein
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随着大黄鱼(Pseudosciaena crocea Richardson)网箱养殖的蓬勃发展，各种病虫害的发生也越来越频繁。近年来，浙江省沿海各大黄鱼养殖场相继发生了一种溃疡病，该病发病率高、流行范围广，危害非常严重。为了搞清浙江沿海养殖大黄鱼溃疡病的病原，找到有效的防治方法，本文以典型症状的病鱼作为材料，通过菌株的分离鉴定、人工感染试验、电镜观察等手段，对大黄鱼溃疡病的致病菌进行了研究，并分析了致病菌的胞外产物，进行了药物抑菌试验，以期为大黄鱼病害的防治提供科学依据。
1. 材料与方法
1.1 材料
病鱼取自浙江宁波象山和温州洞头养殖海区，健康鱼取自浙江宁波奉化养殖海区。
1.2 病原菌分离鉴定
取症状典型的濒死病鱼，无菌条件下从病鱼肝、肾、脾等组织取样，划线接种于普通营养琼脂培养基、IP培养基[1]和TCBS培养基上，27℃恒温培养24 h后，挑取形态特征一致的优势菌落进行克隆培养，转接斜面保存备用。
按照常见细菌系统鉴定手册[2]、伯杰细菌鉴定手册(第9版)[3]的方法进行细菌学鉴定。
1.3 人工感染试验
用60 cm×50 cm×40 cm水体的玻璃缸，每缸放养体长15~20 cm的健康大黄鱼10尾，连续充气，暂养1 d后进行感染试验。试验菌株培养18~24 h，菌悬液浓度按McF浊度管结合活菌计数方法确定。
1.3.1 注射感染试验
将培养好的菌株以无菌生理盐水制成浓度为7.51×107 CFU · mL-1的菌悬液，以肌肉注射(0.3 mL · 尾-1)的方法进行人工感染试验。对照组注射等量无菌生理盐水。
1.3.2 创伤感染试验
以无菌针头对试验鱼体进行穿刺、刮鳞创伤，然后置于试验菌浓度为7.51×104 CFU · mL-1的海水中，对照组不加菌液。
1.3.3 浸泡感染试验
以体表无损伤的健康大黄鱼进行，置于试验菌浓度为7.51×104 CFU ·mL-1的海水中，对照组不加菌液。
1.4 病原菌胞外产物分析
挑取单菌落接种于IP斜面活化24 h，用磷酸盐缓冲液(PBS)pH 7.0洗下，取菌悬液涂于同样的平板培养基上，25℃培养24 h，每皿中加入PBS 5 mL将菌洗入无菌三角瓶中，磁力搅拌器搅拌30 min，4℃，12 000 rpm离心20 min除去菌体，上清液经孔径0.22 μm的纤维素膜过滤，滤液置4℃冰箱保存备用。胞外产物活性分析采用杯碟法进行[4]。
1.5 药敏试验
在IP固体培养基上以纸片法测定病原菌对不同药物的敏感性，经28℃恒温培养24 h，观察抑菌圈的有无及大小。药敏纸片(直径6 mm)购自上海疾病控制中心。
1.6 中草药抑菌作用
15种中草药均为市售，按照文献[5]制成中药原汁(W/V)。将培养24 h的病原菌以无菌生理盐水制成菌悬液(约107 CFU · mL-1)，取0.1 mL菌液于无菌平皿中，将IP培养基灭菌冷却后加入不同体积药液倒入含菌平皿制成平板，25℃恒温培养24 h，观察计数细菌生长情况，能够完全抑制细菌生长的最大稀释度即为该药的最小抑菌浓度(MIC)。继续培养48 h，以无菌生长的最低浓度为最小杀菌浓度(MBC)。
2. 结果与分析
2.1 病鱼临诊症状
患病大黄鱼前期症状不明显。中后期主要症状为：鱼体表脱鳞、溃疡，吻部充血，有的鱼吻部断裂，烂鳍、烂尾；解剖后可见肝肿大，有块状斑，略带土黄色；肾肿；肠空，无食物，有少量液体，肠壁无充血。
在典型的发病网箱内，从出现少量病鱼到大部分发病死亡历时约1周，发病死亡率一般为20%~60%。流行时间以夏季高温期为主，7~8月份为高峰期。发病范围大，感染率高，鱼种和成鱼均能感染发病。在同一养殖海区当年鱼种比2龄以上成鱼更易发病，死亡率明显偏高。
2.2 病原菌的致病性
从患病大黄鱼体内分离到1株优势菌824-1进行人工感染试验，结果见表 1。菌株824-1对健康鱼的肌肉注射感染和创伤浸泡感染的死亡率均为100%，但单纯浸泡感染不能使健康鱼发病。健康鱼经人工感染后出现的症状与自然发病鱼症状基本一致。从发病鱼的血液、肾等处可分离到与试验菌株形态特征、理化性状完全一致的菌株，表明分离菌株是大黄鱼的致病菌。
表 1 人工感染试验结果Table 1. Results of artificial infection test感染方式
method of infection菌液浓度/CFU·mL-1
bacterial concentration注射量/mL
injection volume试验数/尾
total number of
fish challenged累计死亡数/尾
number of mortality死亡率/%
mortality rate肌肉注射
intramuscular injection7.51×107 0.3 10 10 100 对照(生理盐水) 0.3 10 0 0 创伤浸泡
injured immersion7.51×104 - 10 10 100 对照(海水) - 10 0 0 单纯浸泡
immersion7.51×104 - 10 0 0 对照(海水) - 10 0 0 2.3 病原菌的鉴定
菌株824-1的基本特征为革兰氏阴性短杆菌，菌体直或稍弯曲，两端钝圆，单个。极生单鞭毛，具运动性，无荚膜，无芽孢。在IP培养基上27℃培养24 h菌体大小为(0.6~0.9)μm×(1.2~1.5)μm，菌落直径为2 mm左右。圆形白色透明隆起，周缘光滑，无色素。TCBS培养基上呈黄色圆形菌落，表面光滑。根据菌株824-1的生理生化反应(表 2)，该菌株应归属于弧菌属中的溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)[2-3]。
表 2 分离菌株的生理生化特性Table 2. Physiological and biochemical characteristics of the isolated bacterium鉴定项目item 824-1 鉴定项目item 824-1 鉴定项目item 824-1 鉴定项目item 824-1 4℃生长
4℃ growth－ 甲基红
MR－ 柠檬酸盐利用
utilization of itrate－ 甘露糖
mannose+ 43℃生长
43℃ growth+ V.P. + 液化明胶
liquefying glutin+ 纤维二糖
cellobiose+ 0%NaCl生长
0%NaCl growth－ 产硫化氢
produce H2S－ 水解淀粉
hydrolyzing amylum+ 阿拉伯糖
Arabinose－ 6%NaCl生长
6%NaCl growth+ 产氨
produce NH3－ 葡萄糖产酸
produce acid of glucose+ 麦芽糖
maltose+ 10%NaCl生长
10%NaCl growth+ 赖氨酸脱羧酶
lysine decarbxylase+ 葡萄糖产气
produce gas of glucose－ 半乳糖
galactose+ 0/129(10μg) + 精氨酸双水解酶
arginine dihydrolase－ 肌醇
inositol－ 鼠李糖
rhamnose－ 0/129(150μg) + 鸟氨酸脱羧酶
ornithine decarbxylase+ 山梨醇
sorbitol－ 甘露醇
mannitol+ 氧化酶
oxidase+ 脲酶
urease－ 蔗糖
sucrose+ 密二糖
melibiose－ 接触酶
catalase+ β-半乳糖甙酶
ONPG－ 乳糖
lactose－ 苦杏仁甙
amygdalin+ 吲哚
indole+ 硝酸盐还原
nitrate deoxidizing+ 果糖
fructose+ 2.4 胞外产物
以杯碟法测定溶藻弧菌胞外产物的酶活性表明(表 3)，该细菌的胞外产物具有明胶酶、淀粉酶、酪蛋白酶、脂肪酶、卵磷脂酶、几丁质酶等多种酶活性，但没有脲酶活性。相同体积的胞外产物提取液中，淀粉酶、明胶酶的活性最高；其次是酪蛋白酶；脂肪酶、卵磷脂酶和几丁质酶的活性较低。另外，该菌株对兔红细胞具有一定的溶解能力以及溶血活性。
表 3 溶藻弧菌胞外产物的酶活性Table 3. The enzymatic activities of ECP of V.alginolyticus胞外产物
ECP明胶酶
gelatinase淀粉酶
amylase酪蛋白酶
casease脂肪酶
lipase卵磷脂酶
lecithinase几丁质酶
chitinase脲酶
urease溶血活性
haemolysin活性
ECP activity+++ +++ ++ + + + - + 2.5 药敏试验
药敏实验结果见表 4。20种化学药物中，有13种对病原菌具有明显抑制作用，其中以复方新诺明、磺胺+TMP、庆大霉素等3种药物的抑菌作用较强，妥布霉素、多粘菌素等次之，而以前水产养殖中常用的四环素等药物对此病原菌无抑菌作用或不明显，提示病原菌对其可能已具有抗性。
表 4 不同药物对菌株824-1的抑菌作用Table 4. The activities of the 20 antimicrobial agents on strain 824-1药品
antimicrobial agent含药量/μg或
IU·片-1
content抑菌圈直径/mm
inhibitory ring
diameter药品
antimicrobial agent含药量/μg或
IU·片-1
content抑菌圈直径/mm
inhibitory ring
diameter阿莫西林
moxycillin10 0 磺胺+TMP
sulfarmehoxazole/TMP25 25 新生霉素
neomycin30 10 卡那霉素
kanamycin30 16 氟哌酸
norfloxacin10 10 麦迪霉素
midecamycin30 0 庆大霉素
gentamycin10 20 丁胺卡那霉素
amikacin30 15 吡哌酸
pipemidic acid30 12 头孢孟多
cefamandole30 16 青霉素G
penicillin G10 0 妥布霉素
tobradistin10 17 强力霉素
doxycycline30 12 链霉素streptomycin 10 14 克林霉素
clindamycin2 0 四环素tetracycline 30 0 多粘菌素
polymycin300 15 氨苄青霉素
ampicillin10 0 复方新诺明
Co. SMZ25 26 磺胺甲基异噁唑
sulfamethoxazole10 0 2.6 中草药的抑菌作用
15种中草药对病原菌824-1菌株的抑菌效果见表 5。不同药物对病原菌的抑制作用相差较大，其中以石榴皮、地榆、五味子、大黄等4种药物的抑菌能力最强，其最小抑菌浓度(MIC)和最小杀菌浓度(MBC)分别为1∶ 640、1∶ 640、1∶ 320、1∶320和1∶ 320、1∶ 160、1∶ 160、1∶ 160。乌梅、公丁香、连翘、板蓝根等也有较强的抑菌作用；而大青叶、木瓜、威灵仙、地丁等只有在较高浓度时才有抑菌作用。
表 5 中草药对824-1菌株的最小抑菌浓度(MIC)和最小杀菌浓度(MBC)Table 5. MICs and MBCs of the eater extracts of Chinese herbal medicines evaluated药名CHM MIC MBC 药名CHM MIC MBC 药名CHM MIC MBC 乌梅
Fructus prunusis1∶160 1∶80 大黄
Rheum officinale1∶320 1∶160 木瓜
Fructus chaenomelesis1∶20 1∶20 黄芩
Radix scutellariae1∶80 1∶40 白芍
Rhizoma paeoniae1∶20 1∶20 威灵仙
Radix clematidis1∶10 1∶10 地榆
Rhizoma sanguisorbae1∶640 1∶160 大青叶
Folium polygoni1∶20 1∶10 地丁
Corydalis bungeana1∶10 1∶5 石榴皮
Pericarpium granati1∶640 1∶320 五味子
Fructus schizandrae1∶320 1∶160 黄芪
Radix astragalus1∶20 1∶20 公丁香
Flos caryophyllum1∶160 1∶80 连翘
Fructus forsythiae1∶160 1∶160 板蓝根
Rhizoma isatidis1∶160 1∶80 3. 讨论
菌株824-1的生理生化特性虽然与文献上对溶藻弧菌的描述略有差异，文献上溶藻弧菌能利用柠檬酸盐[2-3]，而分离菌株却对柠檬酸盐不利用。推测其原因与同一种菌内不同个体之间的差异有关。按照细菌学分类原理，这种微小差异并不影响该种的分类地位的确立。另外，根据全自动细菌鉴定仪VITEK32的鉴定结果，分离菌株归属于溶藻弧菌的可信度在92%以上，因此可将分离菌株鉴定为溶藻弧菌(Vibrio aiginolyticus)。
溶藻弧菌广泛存在于自然海区的海水中，是一种条件致病菌，能引起海水鱼类、贝类、对虾[6-8]等发生疾病，但其致病性取决于宿主的健康状况、环境条件、海水中细菌数量、海水的理化物质等因素。
人工感染试验结果表明，溶藻弧菌对大黄鱼的致病途径不是经口，可能是鱼体受伤后，菌体通过创伤面进入体内，产生毒素，使病灶出血溃烂，造成死亡。对病原菌胞外产物的研究表明，其胞外产物含脂肪酶、蛋白酶、淀粉酶、明胶酶及溶血因子等成分，这与以往的报道基本一致[9]。由于淀粉酶有分解糖原的作用；明胶酶、酪蛋白酶等能分解胶原等蛋白成分；脂肪酶可分解脂类；而溶血因子又能使大黄鱼的血细胞溶解，所以推测胞外产物在溶藻弧菌侵染大黄鱼的过程中起到了一定的作用。因此，在夏季高水温期时，养殖海域中弧菌大量增殖，而由于网箱养殖密度过高，鱼碰撞受伤的机率大大增加，同时还由于寄生虫造成鱼体表损伤，继发细菌感染，进一步导致鱼体受多种因素的侵害而死亡。
药敏试验结果表明，病原菌对复方新诺明、磺胺+TMP、庆大霉素等3种药物较为敏感，可从中进一步筛选预防和治疗药物。
中草药抑菌试验表明，所使用的15种中草药对溶藻弧菌均有不同程度的抑制作用，其中石榴皮、地榆、五味子、大黄等4种药物的抑菌作用尤其显著。
由于抗菌药的大量使用，不但会提高病原菌的抗药性，还可能因为药物残留导致水产品质量安全下降，而中草药具有低毒、低残留、副作用小、不易产生抗药性等特点，且药中某些成分既有抗菌作用，又有免疫作用，能改善机体的免疫状态，提高自身抗菌能力[10]，因此，可将上述中草药配制成抗病药物饵料来代替抗生素应用于海水网箱大黄鱼养殖生产。
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图 1 PfHSP22 cDNA及编码氨基酸序列
起始密码子(ATG)和终止密码子(TAA)序列字体加粗显示；灰色背景序列表示sHSP结构域；图形框表示磷酸化位点；圆形框表示糖基化位点
Figure 1. Predicted amino acid and nucleotide sequence of PfHSP22 cDNA
The sequences of start codon (ATG) and stop codon (TAA) are in bold; the sequences in grey represent the sHSP domain; the hosphorylation sites are framed by box; the glycosylation site is surrounded by a circle.
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图 3 PfHSP22蛋白序列和不同物种热休克蛋白22的多重比对结果
Figure 3. Multi-alignment of heat shock protein 22 between PfHSP22 and other species
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图 4 基于NJ法构建的HSP22家族成员进化树
分支旁边的数值表示在bootstrap测验中相关分类群聚成一支的复制树的百分比(1 000次重复)
Figure 4. A phylogenetic tree of HSP22 family members constructed with neighbor-joining method in MEGA software
The percentage of replicate trees in which the associated taxa clustered together in the bootstrap test (1 000 replicates) are shown next to the branches.
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图 5 常温条件下橘色和白色闭壳肌合浦珠母贝不同组织PfHSP22 mRNA表达比较
*. 橘色组和白色组差异显著(P<0.05)
Figure 5. Comparison of PfHSP22 mRNA expression in different tissues of P.fucata in orange group and white group at normal temperature
*. significant difference between orange group and white group (P<0.05)
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图 6 高温胁迫下橘色组和白色组各组织PfHSP22 mRNA在不同时间的表达比较
相同颜色组内不同小写字母表示不同时间的PfHSP22 mRNA表达量差异显著(P<0.05)
Figure 6. Comparison of PfHSP22 mRNA expression in different tissues of orange group and white group at different time under high temperature stress
Different lowercase letters in the same color group indicate significant difference in the expression of PfHSP22 mRNA at different time (P<0.05).
表 1 合浦珠母贝HSP22基因氨基酸序列与其他物种HSP22的比较
Table 1 Comparison of amino acid sequence of HSP22 gene of P.fucata with other species
物种 species 一致性/% identity 相似性/% similarity 序列登录号 accession No. 缢蛏 Sinonovacula constricta 43 54 AGM14597.1 菲律宾帘蛤 Ruditapes philippinarum 44 53 ACU83231.1 紫贻贝 Mytilus galloprovincialis 39 51 AEP02967.1 人 Homo sapiens 22 38 NP_055180.1 黑猩猩 Pan troglodytes 22 38 XP_509417.1 家鼠 Mus musculus 23 37 NP_109629.1 原鸡 Gallus gallus 22 37 XP_415280.1 褐家鼠 Rattus norvegicus 23 37 NP_446064.1 黄牛 Bos taurus 23 37 NP_001014955.1 致倦库蚊 Culex quinquefasciatus 25 35 EDS45823.1 栉孔扇贝 Azumapecten farreri 18 35 AAR11780.1 海湾扇贝 Argopecten irradians 20 35 ACA23998.1 斑马鱼 Danio rerio 25 34 NP_001094427.2 中国蛤蜊 Mactra chinensis 22 31 ALT66173.1 非洲爪蟾 Xenopus tropicalis 21 31 NP_001005658.1 扰血蝇 Haematobia irritans 16 31 JAV17626.1 果蝇 Drosophila melanogaster 19 30 NP_001027115.1 河蚬 Corbicula fluminea 22 28 AGW82232.1 
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