Cloning and expression profiling of gsdf and amh genes in large yellow croaker (Larimichthys crocea)
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摘要:
该研究克隆了大黄鱼（Larimichthys crocea）gsdf （gonadal soma derived factor）和amh （anti-Müllerian hormone）基因的开放阅读框序列并对它们的表达进行分析。大黄鱼gsdf基因cDNA序列开放阅读框长为618 bp，可编码205个氨基酸，含有信号肽和TGF-β结构域。系统进化分析显示，大黄鱼Gsdf与其他鱼类Gsdf聚为一枝，而与TGF-β超家族其他成员分开。Amh基因cDNA序列开放阅读框为1 563 bp，可编码520个氨基酸，含有信号肽、AMH-N区域和TGF-β保守结构域。系统进化分析显示，大黄鱼Amh与舌齿鲈(Dicentrarchus labrax)Amh进化关系最近。荧光定量PCR表达分析显示，gsdf和amh基因主要在大黄鱼性腺表达，在精巢中的表达量显著高于卵巢（P < 0.05），2个基因都在性腺分化前开始表达，在雄鱼精巢中表达量呈现先升高后下降的趋势，在卵巢的表达量很低。此外，相比于正常雌鱼，gsdf和amh基因在伪雄鱼（遗传性雌鱼）性腺中的表达量显著上调。这些结果表明，gsdf和amh基因在大黄鱼性腺分化过程中起到重要的作用。
Abstract:In this study, the gonadal soma derived factor (gsdf) and anti-Müllerian hormone (amh) were cloned from Larimichthys crocea, and their expression patterns were analysed by qRT-PCR. The results shows that the open reading frame (ORF) of gsdf gene spaned a region of 618 bp and coded 205 amino acids with a signal peptide and a conserved domain of the TGF-β superfamily. Sequence alignment analysis reveals that the gsdf of L.crocea and Dicentrarchus labrax shared the highest homology. Phylogenetic analysis shows that the fish Gsdf proteins had a clade separated from the rest members of the TGF-β superfamily. The ORF of amh gene spaned a region of 1 563 bp and coded 520 amino acids that contained a signal peptide, an AMH-N domain and a TGF-β conserved domain. Phylogenetic analysis shows that Amh proteins of L.crocea and D.labrax had the nearest relationship. The qPCR analysis reveals that gsdf and amh genes were expressed mainly in gonad, and the expression levels in testis were significantly higher than that in ovary (P < 0.05). Before the gonad differentiation, gsdf and amh genes had already expressed, and the expression levels of two genes showed an increase-decrease trend in testis whereas the expression levels were very low in ovaries. Besides, compared with normal females, the expressions of two genes had more significant expression in gonad of pseudo-males (genetic females). It is indicated that gsdf and amh genes play a very important role in the process of L.crocea gonad differentiation.
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草鱼(Ctenopharyngodon idellus)，隶属硬骨鱼纲、鲤形总目、鲤科、雅罗鱼亚科、草鱼属，是中国特有的淡水饲养鱼类，以其营养丰富、肉味鲜美等优点深受国内外消费者的喜爱。但是草鱼的肉质比较松软，加热后更易煮烂。1973年中山市通过将草鱼脆化养殖，即用普通饲料将普通草鱼养殖到一定质量后，再以天然植物蚕豆为主的饲料喂养至120 d左右[1]，即成为一种新兴的淡水养殖鱼，取名“脆肉鲩”(C.idellus C.et V)，具有肉质紧硬、爽脆、久煮不烂等特点，并且明显改善了草鱼的肌肉品质。鱼肉的基本营养成分、质构特性等是评价肌肉品质的重要指标。目前虽然有很多相关的研究报道，但对这些重要的肌肉品质指标尚存在较大的争议。甘承露[2]指出脆肉鲩的肌肉蛋白质、粗脂肪和灰分质量分数均比普通草鱼高，而水分质量分数低于普通草鱼；但也有研究者指出脆肉鲩肌肉的水分和粗蛋白质量分数与普通草鱼并无显著性差异[3]，而粗脂肪质量分数显著下降[4]。饲喂蚕豆后的草鱼肌肉口感发生变化，其质构指标也相应地发生了变化。LIN等[5]认为脆肉鲩的弹性、回复力显著高于普通草鱼；而关磊等[6]认为脆肉鲩的肌肉弹性和回复力均与普通草鱼无显著性差异。因此，为了避免由于饲料投喂方式、投喂周期不同对结果造成的影响，笔者对来自同一养殖场的草鱼在其脆化养殖过程进行采样，测定不同脆化期草鱼的一般营养成分(水分、粗灰分、粗蛋白和粗脂肪)的质量分数、鱼肉氨基酸组成、质构特性及不同蛋白组分等的变化，研究草鱼脆化过程中肌肉品质的变化规律，并以此来探讨肌肉成分对脆肉鲩脆性形成规律的影响。
1. 材料与方法
1.1 材料
不同养殖期的脆肉鲩均来自于广东省中山市坦洲镇某养殖场，2013年6月至11月共定期采样6次，脆化时间间隔为20 d左右。活鱼充氧包装运回实验室，清水室温暂养，冰晕之后去头、去鱼鳞和去内脏，用流动水清洗干净，将鱼背两侧的肌肉切成肉片放入保鲜袋中，然后置于冰鲜条件下供试验分析。
1.2 主要仪器及设备
QTS-25质构仪(英国CNS FARNELL公司出品)；KjeltecTM2300蛋白自动分析仪、SoxtecTM脂肪自动分析仪(丹麦FOSS公司出品)；Alpha1-4冷冻干燥机(德国Christ公司出品)；3-550A高温马弗炉(美国Ney VULCAN公司出品)；DKN612C干燥箱(日本YAMATO公司出品)；T50均质机(德国IKA公司出品)；3K30高速冷冻离心机(德国SIGMA公司出品)。
1.3 肌肉一般营养成分的测定
将鱼背部的肌肉搅碎并混合均匀，备用。水分质量分数测定采用常压烘箱干燥法，参照GB 5009.3-1985；蛋白质质量分数测定采用微量凯氏定氮法，参照GB 5009.5-1985；脂肪质量分数测定采用索氏抽提法，参照GB 5009.6-1985；灰分质量分数测定采用直接灰化法，参照GB 5009.4-1985。
1.4 质构特性的测定
采用英国产的QTS-25质构仪进行测定。测定时取鱼身背部的鱼片，切成2.0 cm×2.0 cm×1.5 cm规格进行测定。测定条件为探头是直径6 mm的圆柱形不锈钢探头；测试速率30 mm·min-1；压缩距离为4 mm；测试模式为TPA；触发值5 g；循环2次，间隔0 s；压缩比50%；触发类型为自动。所有样品平行测定18次。
1.5 肌肉氨基酸质量分数的测定
鱼肉经过前处理，用6 mol·L-1盐酸于110 ℃水解24 h，脱酸后用蒸馏水定容至5 mL，上Hitachi835-50氨基酸自动分析仪测定。
1.6 肌肉营养评价方法
根据FAO/WHO(1973)[8]提出的氨基酸评分标准模式和全鸡蛋蛋白质的氨基酸模式分别按以下公式计算氨基酸评分(AAS)、化学评分(CS)和必需氨基酸指数(EAAI)：
$$ \begin{aligned} & {\mathrm{AAS}}=\frac{{\mathrm{aa}}}{{\mathrm{AA}}({\mathrm{FAO}} / {\mathrm{WHO}})} \quad C S=\frac{{\mathrm{aa}}}{{\mathrm{AA}}({\mathrm{egg}})} \\ & {\mathrm{EAAI}}=\sqrt[n]{{\frac{100 {\mathrm{~A}}}{{\mathrm{AE}}} \times \frac{100 {\mathrm{~B}}}{{\mathrm{BE}}} \times \frac{100 {\mathrm{C}}}{{\mathrm{CE}}} \times \ldots \times \frac{100 {\mathrm{I}}}{{\mathrm{IE}}}}} \end{aligned} $$ 式中aa为试验样品蛋白质氨基酸质量分数(mg·g-1)；AA(FAO/WHO)为FAO/WHO评分标准中同种氨基酸质量分数(mg·g-1)；AA(egg)为全鸡蛋蛋白质中同种氨基酸质量分数(mg· g-1)；n为比较的必需氨基酸个数；A、B、C、……、I为等评蛋白质的必需氨基酸质量分数(mg·g-1)；AE、BE、CE、……、IE为全鸡蛋蛋白质的必需氨基酸质量分数(mg·g-1)。
1.7 蛋白质成分的分离和测定
参照HASHIMOTO等[9]的测定方法并作部分改动，具体步骤为称取30 g搅碎的鱼肉，加入10倍体积的冷磷酸盐缓冲液A(0.05 mol·L-1，pH=7.5)均质2 min，4 ℃抽提90 min，间断搅拌，然后再10 000 g、4 ℃离心30 min，残渣加入5倍体积的磷酸盐缓冲液A重复上面的操作3次，合并3次离心得到的上清液1和残渣1，在上清液1中加入5倍体积冷的10%三氯乙酸溶液，静置90 min，10 000 g、4 ℃离心30 min，得到上清液2即为非蛋白氮组分和沉淀2即为肌浆蛋白组分。在残渣1中加入含有高浓度的盐溶液(氯化钾或氯化钠)的缓冲溶液B(0.1 mol·L-1，pH=7.5)，4 ℃条件下静置90 min，间断搅拌，然后均质2 min、10 000 g、4 ℃离心30 min，重复上面的操作3次得到上清液3即为肌原纤维蛋白和沉淀3。在沉淀3中加入5倍体积冷的0.1 mol·L-1的氢氧化钠，4 ℃均质2 min，然后在4 ℃磁力搅拌18 h后，以10 000 g、4 ℃离心40 min，得到上清液4即为碱溶性蛋白组分和沉淀4即为肌浆蛋白组分。最后将分离提取的4种蛋白液体缓慢倒入透析袋中，不应超过透析袋的2/3，然后经排气后用透析夹夹好，放入超纯水中，4 ℃透析36 h，并且每隔6 h换一次水。将透析好的蛋白液体放在冷冻干燥机中冻干得到成品。测定4种蛋白质量分数均采用半微量凯氏定氮法。
1.8 数据处理
采用SPSS 19.0和Excel 2010进行数据处理，结果采取均值±标准差(X±SD)形式。指标内部的均值比较采用最小显著差异法(least significant difference，LSD)，取95%置信度(P < 0.05)。
2. 结果与讨论
2.1 草鱼脆化过程中肌肉基本营养成分变化
随着脆化时间的不同，肌肉的4种基本营养成分均有所变化(表 1)。其中脆肉鲩的水分和粗脂肪质量分数均显著低于普通草鱼(P < 0.05)，而粗蛋白质量分数随着脆化时间不同质量分数显著增加(P < 0.05)。在脆化初期(30 d)，脆肉鲩的水分和粗脂肪质量分数分别比普通草鱼低2.79%(P < 0.003)和37.94%(P < 0.02)，而粗蛋白和灰分质量分数分别比普通草鱼的高43.34%(P < 0.001)和14.89%(P>0.05)。随着投喂蚕豆时间的延长，脆化时间越长，脆肉鲩(120 d)与普通草鱼的4种基本营养成分差异越显著，其中脆化草鱼(120 d)比普通草鱼的水分和粗脂肪质量分数分别低8.99%(P < 0.001)和73.33%(P < 0.001)，粗蛋白质量分数高49.93%(P < 0.001)。值得一提的是脆化时间不同，脆肉鲩的这4种营养成分之间也存在差异显著性(P < 0.05)。脆化120 d的脆肉鲩与脆化30 d的相比，前者的水分和粗脂肪质量分数分别比后者低6.38%(P < 0.001)和55.41%(P < 0.020)，灰分和粗蛋白质量分数分别高37.96%(P < 0.001)和4.59%(P < 0.015)。从试验结果来看，脆化时间不同，脆肉鲩的灰分质量分数比普通草鱼高，但未达到显著性差异(P>0.05)，说明投喂蚕豆时间不同，普通草鱼与脆肉鲩的无机元素质量分数并无显著性差异(P>0.05)。
表 1 不同脆化周期的鱼肉基本营养成分Table 1. Nutrition composition of grass carp muscle in different crisping periods% 项目
item水分
moisture粗脂肪
crude fat粗灰分
crude ash粗蛋白
crude protein普通草鱼 grass carp 79.34±0.94a 2.53±0.77a 0.94±0.02c 14.12±0.79d 脆化时间/d
crisping time30 77.13±0.64b 1.57±0.50b 1.08±0.06c 20.24±0.28c 50 76.30±0.08bc 1.22±0.08bc 1.01±0.07c 20.46±0.21c 70 75.77±0.16c 0.99±0.02bc 1.05±0.11c 21.13±0.07b 90 73.40±0.34d 0.77±0.10c 1.28±0.06b 22.71±0.19a 120 72.21±1.22d 0.70±0.11c 1.49±0.17a 21.17±0.21b 注：同一列右上角字母不同表示差异性显著(P < 0.05)，下表同此
Note：Values with different letters at top right corner in the same column are significantly different (P < 0.05)；the same case in the following tables.GRIGORAKIS和ALEXIS [10]认为肌肉品质与水分和粗脂肪质量分数密切相关，这在其他的研究中也有相关报道[11-13]。肌肉的风味和嫩度随着脂肪质量分数的增加而改善，肌肉脂肪质量分数的下降使得肌束之间的摩擦力增大，并且降低了肌肉嫩度，但同时也增加了肌肉的咀嚼性和硬度，使肌肉品质上升。在笔者试验中发现脆化时间越长，2种鱼的水分和粗脂肪质量分数有显著的降低，这与李宝山等[4]、KUANG等[14]的研究结果一致，而与朱志伟等[7]、林婉玲等[15]的结果不同，这可能与脆化时间长短和养殖的方式不同有关[4]。水分质量分数下降说明固形物质量分数有所上升，而粗脂肪质量分数下降，这可能是草鱼养殖成脆肉鲩之后肌肉变脆的原因之一。
2.2 草鱼脆化过程中肌肉蛋白质组分质量分数变化
在该试验中，脆化时间为120 d的脆肉鲩的肌原纤维蛋白(56.14%)、肌浆蛋白(17.07%)和基质蛋白(4.08%)的质量分数分别比普通草鱼增加了10.88%(P < 0.001)、15.41%(P < 0.001)和80.53%(P < 0.001)，但碱溶性蛋白的质量分数却下降了46.34%(P < 0.001)。随着脆化时间的不同，120 d的脆肉鲩相比于30 d脆肉鲩的这4种蛋白质量分数均有极显著差异(P < 0.001)(表 2)。
表 2 不同脆化周期的肌肉蛋白质成分占粗蛋白的质量分数Table 2. Proportion of protein components to crude protein in grass carp muscle in different crisping periods% 项目
item肌浆蛋白
sarcoplasmic protein肌原纤维蛋白
myofibrillar protein基质蛋白
stromal protein碱溶性蛋白
alkali-soluble protein普通草鱼 grass carp 14.79±0.53d 50.63±0.28c 2.26±0.41b 20.61±0.25a 脆化时间/d
crisping time30 15.58±0.30bc 51.97±0.93c 2.46±0.42b 18.18±0.80b 50 15.38±0.26cd 53.39±0.95b 2.88±0.37b 17.56±0.32b 70 16.04±0.23b 53.49±0.56b 2.77±0.48b 17.06±0.81b 90 16.77±0.47a 55.77±1.03a 3.72±0.18a 12.45±0.48c 120 17.07±0.10a 56.14±0.54a 4.08±0.06a 11.06±0.87d 普通草鱼和脆肉鲩的肌肉蛋白质组分主要包括4种：肌原纤维蛋白、肌浆蛋白、基质蛋白和碱溶性蛋白。这几种蛋白对肌肉结构和功能起着很重要的作用，一般鱼肉蛋白中质量分数最高的为肌原纤维蛋白。肌原纤维蛋白是支撑肌肉运动的结构蛋白质，其质量分数越高，鱼肉的弹性较好[7, 16]。4种蛋白中质量分数最低的是基质蛋白，其主要成分是胶原蛋白和弹性蛋白，而胶原蛋白是构成肌肉结缔组织的重要蛋白，对保持肌肉韧性、完整性和肌肉品质有重要作用[17]。基质蛋白质量分数高，鱼肉硬度也较高[7, 15]。肌浆蛋白是由肌原纤维细胞质存在的蛋白质和代谢中的各种蛋白酶组成[7]，GODIKSEN等[18]发现在虹鳟(Oncorhynchus mykiss)中，来源于肌浆蛋白中的组织蛋白酶质量分数与鱼肉质构存在相关性。该试验在脆化过程中，肌原纤维蛋白、基质蛋白和肌浆蛋白的质量分数均有所上升，因此可以推测蛋白质组分质量分数的变化可能是引起脆肉鲩鱼肉脆性改变的另一重要原因(表 2)。
2.3 草鱼脆化过程中鱼肉质构特性比较
鱼肉的质构指标，特别是硬度、弹性等是评价肌肉品质的重要特性。投喂蚕豆时间不同，肌肉口感和脆性发生变化，其质构指标也发生相应的变化。普通草鱼与脆化期为30 d的脆肉鲩的硬度、咀嚼性和粘着性并无显著性差异(P>0.05)，但是脆化时间到50 d左右时，脆肉鲩与普通草鱼相比，硬度、咀嚼性、弹性和粘着性的绝对值分别增加了87.20%(P < 0.004)、368.46%(P < 0.001)、145.93%(P < 0.002)和45.34%(P < 0.020)(表 3)。当脆化时间达到120 d左右时，其硬度、咀嚼性、弹性和粘着性的绝对值比普通草鱼的分别提高了429.17%(P < 0.001)、982.10%(P < 0.001)、302.22%(P < 0.001)和128.90%(P < 0.001)。脆化期为120 d与30 d、50 d、70 d的脆肉鲩相比，TPA指标值均存在显著差异(P < 0.05)，这与LIN等[5]的研究结果一致。综合表 1和表 2的结果可以推测正是由于脆化过程中，水分和粗脂肪质量分数显著下降、粗蛋白质量分数显著上升、肌原纤维蛋白、肌浆蛋白和基质蛋白质量分数均显著增加，导致鱼肉在脆化过程中质构特性，特别是硬度指标表现出显著差异，这说明脆肉鲩脆性改变与脆化过程中低水分和脂肪质量分数、高蛋白质量分数、高肌原纤维蛋白质量分数、高基质蛋白质量分数和高肌浆蛋白质量分数等肌肉品质指标有关。
表 3 不同脆化周期的肌肉TPA指标值(n=18)Table 3. TPA values of grass carp muscle in different crisping periods项目
item硬度/g
hardness咀嚼性/gmm
chewiness弹性/mm
springiness粘着性/gs
adhesiveness普通草鱼 grass carp 381.67±40.52e 128.85±15.71d 1.35±0.47d -90.58±11.14d 脆化时间/d
crisping time30 592.67±57.86de 257.91±34.82d 2.75±0.21c -110.98±5.88cd 50 714.50±77.62cd 603.61±86.99c 3.32±0.51c -131.65±34.29c 70 831.67±88.75c 817.86±37.64b 3.63±0.52bc -173.14±41.53b 90 1 307.17±282.33b 873.54±67.78b 4.58±1.42ab -204.97±32.08ab 120 2 019.67±308.41a 1 394.28±241.91a 5.43±1.55a -207.34±25.83a 2.4 草鱼脆化过程中肌肉氨基酸组成
蛋白质的营养价值主要取决于其氨基酸的质量分数和组成。普通草鱼和脆肉鲩的肌肉氨基酸组成种类相同，均包含16种常见氨基酸，并且质量分数最高的均为谷氨酸(Glu)，其次为天冬氨酸(Asp)、赖氨酸(Lys)、亮氨酸(Leu)、丙氨酸(Ala)和精氨酸(Arg)，这与刘邦辉等[1]得出的结论一致(表 4)。但普通草鱼与脆肉鲩在氨基酸总量(TAA)、必需氨基酸(EAA)总量、鲜味氨基酸(UAA)总量上均存在显著差异(P < 0.05)，并且可以明显看出，当脆化到50 d左右时的TAA最高(203.5 g·L-1)，比普通草鱼的TAA高10.81%(P < 0.001)，比120 d的高4.67%(P < 0.002)。而EAA总量最高的是脆化期为90 d的脆肉鲩，高出普通草鱼13.32%(P < 0.001)。
必需氨基酸占氨基酸总量的比值(EAA/TAA)和必需氨基酸占非必需氨基酸的比值(EAA/NEAA)随着脆化时间不同有所差异。普通草鱼的EAA/TAA为40.88%，EAA/NEAA为69.15%，当脆化时间约90 d时，这2个比值均达到最大(42.27%和73.22%)，分别比普通草鱼高出1.39%和4.07%。根据FAO/WHO的理想模式，质量较好的蛋白质其氨基酸组成为EAA/TAA在40%左右，而EAA/NEAA在60%以上[19]。由此可见，普通草鱼和脆肉鲩的氨基酸平衡效果较好，均属于优质蛋白质，且脆肉鲩的营养价值高于普通草鱼。
鱼类的鲜美程度主要取决于肌肉中Asp、甘氨酸(Gly)、Glu和Ala的含量和组成[20]。其中质量分数最高的为Glu，其次为Asp，这2种氨基酸为呈鲜味的特征氨基酸，分别占草鱼总氨基酸质量分数的15.81%和10.74%，有研究指出，Glu不仅是呈鲜味氨基酸，还在人体代谢中具有重要意义，能够参与多种生理活性物质的合成[21]。脆肉鲩与草鱼在UAA上有显著性差异(P < 0.05)，普通草鱼的UAA分别比脆化期为30 d和120 d脆肉鲩的低4.93%(P < 0.002)、6.06%(P < 0.001)(表 4)。这说明脆化后的鱼肉鲜味明显提高。
表 4 不同脆化周期的肌肉氨基酸质量分数(湿质量)Table 4. Amino acid contents in grass carp muscle in different crisping periods (wet weight)g·L-1 氨基酸
amino acid草鱼
grass carp脆化时间/d crisping time 30 50 70 90 120 天冬氨酸** Asp 19.5±0.10 21.3±0.40 21.9±0.11 17.3±0.11 22.2±0.10 21.5±0.20 苏氨酸* Thr 8.3±0.11 9.0±0.30 8.9±0.11 7.3±0.10 8.7±0.12 8.5±0.12 丝氨酸 Ser 7.3±0.10 7.8±0.10 6.4±0.12 5.4±0.10 6.3±0.14 6.7±0.13 谷氨酸** Glu 28.7±0.11 31.5±0.60 31.4±0.10 26.0±0.22 32.4±0.15 31.1±0.21 脯氨酸 Pro 5.9±0.12 5.2±0.21 7.5±0.41 5.5±0.40 6.0±0.12 6.3±0.13 甘氨酸** Gly 10.8±0.11 9.4±0.13 12.4±0.11 8.4±0.10 10.4±0.10 10.4±0.11 丙氨酸** Ala 12.1±0.20 12.4±0.34 13.5±0.14 10.3±0.21 12.9±0.20 12.5±0.21 缬氨酸** Val 9.9±0.11 10.8±0.25 11.8±0.13 9.3±0.11 12.2±0.30 11.3±0.20 蛋氨酸* Met 5.7±0.31 6.2±0.11 6.3±0.20 5.1±0.12 6.4±0.13 6.1±0.11 异亮氨酸* Lle 8.7±0.21 9.6±0.40 10.3±0.22 8.2±0.14 10.7±0.32 10.0±0.12 亮氨酸* Leu 15.1±0.22 16.4±0.34 16.8±0.22 13.7±0.45 17.4±0.21 16.2±0.32 酪氨酸 Tyr 6.3±0.15 6.8±0.10 6.9±0.10 5.7±0.10 7.2±0.00 6.9±0.01 苯丙氨酸* Phe 8.3±0.20 8.5±0.31 9.2±0.11 7.2±0.00 9.4±0.10 8.9±0.14 赖氨酸* Lys 18.4±0.13 20.7±0.42 20.7±0.14 16.7±0.02 21.0±0.01 20.2±0.01 组氨酸 His 5.3±0.11 6.3±0.10 6.7±0.50 4.9±0.21 7.0±0.50 6.1±0.10 精氨酸 Arg 11.8±0.22 12.3±0.13 13.2±0.10 10.2±0.13 12.8±0.14 11.7±0.15 TAA 181.5±1.10c 194.0±2.28b 203.5±0.70a 161.0±1.14d 202.5±0.70a 194.0±1.40b EAA总量 total EAA 74.2±0.41d 81.0±1.40c 83.8±0.40b 67.3±0.55e 85.6±0.50a 81.0±0.71c NEAA总量 total NEAA 107.3±0.60 113.0±1.44 119.7±0.15 93.7±0.96 116.9±0.22 113.0±0.77 UAA总量 total UAA 71.0±0.48c 74.5±1.12b 79.1±0.15a 61.7±0.46d 77.9±0.70a 75.3±0.45b EAA/TAA/% 40.88 41.75 41.18 41.80 42.27 41.75 EAA/NEAA/% 69.15 71.68 70.01 71.82 73.22 71.68 UAA/TAA/% 39.12 38.40 38.87 38.32 38.47 38.81 注：*.必需氨基酸；* *.鲜味氨基酸；TAA.氨基酸总量；EAA.必需氨基酸；NEAA.非必需氨基酸；UAA.鲜味氨基酸
Note: *. essential amino acids; * *. umami amino acids；TAA. total amino acids；EAA. essential amino acids；NEAA. non-essential amino acids；UAA. umami amino acids2.5 肌肉氨基酸营养价值评价
将表 4中必需氨基酸的质量分数都换算成每克蛋白质中所含的氨基酸毫克数(表 5)后，按照氨基酸质量分数和FAO/WHO评分模式分别计算出氨基酸评分(表 6)、化学评分和必需氨基酸指数(表 7)。根据AAS可知，虽然脆化时间不同，但普通草鱼和脆肉鲩的第一限制性氨基酸均为蛋氨酸(Met)，第二限制性氨基酸均为苏氨酸(Thr)(脆化期为30 d的脆肉鲩除外)；根据CS可知，普通草鱼和不同脆化期的脆肉鲩的第一限制性氨基酸均为Met，但第二限制性氨基酸出现了2种，即缬氨酸(Val)和Thr，这与其他研究者的结果[1, 7]稍有不同，但第一、第二限制氨基酸基本上在Met、Met+胱氨酸(Cys)、Thr、Val和亮氨酸(Leu)之间。对于以谷类食品为主食的中国人而言，可以通过在这些鱼类加工生产过程中添加相应的限制氨基酸，从而弥补谷物食品的不足，改善其必需氨基酸的平衡效果，提高蛋白利用率[1]。
表 5 不同脆化周期的肌肉蛋白必需氨基酸组成Table 5. Composition of essential amino acids of muscle protein in different crisping periodsmg·g-1 项目
item苏氨酸
Thr缬氨酸
Val蛋氨酸
Met异亮氨酸
Lle亮氨酸
Leu赖氨酸
Lys苯丙氨酸+酪氮酸
Phe+Tyr普通草鱼 grass carp 58.78 70.11 40.37 61.61 106.94 130.31 103.40 脆化时间/d
crisping time30 44.47 53.36 30.63 47.43 81.03 102.27 75.59 50 43.50 57.67 30.79 50.34 82.11 101.17 78.69 70 34.55 44.01 24.14 38.81 64.84 79.03 61.05 90 38.31 53.72 28.18 47.12 76.62 92.47 73.10 120 40.15 53.38 28.81 47.24 76.52 95.42 74.63 鸡蛋蛋白模式 egg protein pattern 52 68 50 50 92 56 91 FAO/WHO模式 FAO/WHO pattern 40 50 35 40 70 55 60 表 6 不同脆化周期的肌肉蛋白必需氨基酸评分Table 6. AAS for muscle protein in different crisping periods项目
item苏氨酸
Thr缬氨酸
Val蛋氨酸
Met异亮氨酸
Lle亮氨酸
Leu赖氨酸
Lys苯丙氨酸+酪氮酸
Phe+Tyr普通草鱼 grass carp 1.470 1.402** 1.153* 1.540 1.528 2.369 1.723 脆化时间/d
crisping time30 1.112 1.067** 0.875* 1.186 1.158 1.859 1.260 50 1.088** 1.153 0.880* 1.259 1.173 1.839 1.312 70 0.864** 0.880 0.690* 0.970 0.926 1.437 1.018 90 0.958** 1.074 0.805* 1.178 1.095 1.681 1.218 120 1.004** 1.068 0.823* 1.181 1.093 1.735 1.244 注：*. 第一限制性氨基酸；* *. 第二限制性氨基酸，下表同此
Note: *. the first limiting amino acids；* *. the second limiting amino acids；the same case in the following table.表 7 不同脆化周期的肌肉蛋白必需氨基酸指数和化学评分Table 7. EAAI and CS for muscle protein in different crisping periods项目
item苏氨酸
Thr缬氨酸
Val蛋氨酸
Met异亮氨酸
Lle亮氨酸
Leu赖氨酸
Lys苯丙氨酸+酪氮酸
Phe+Tyr必需氨基酸指数
EAAI普通草鱼 grass carp 1.130 1.031** 0.807* 1.232 1.162 2.327 1.136 119.88 脆化时间/d
crisping time30 0.855 0.785** 0.613* 0.949 0.881 1.826 0.831 91.13 50 0.837** 0.848 0.616* 1.007 0.893 1.807 0.865 93.28 70 0.664 0.647** 0.483* 0.776 0.705 1.411 0.671 72.71 90 0.737** 0.790 0.564* 0.942 0.833 1.643 0.803 85.72 120 0.772** 0.785 0.576* 0.945 0.832 1.704 0.820 87.20 脆肉鲩的AAS多数大于1或接近1，这说明脆肉鲩肌肉氨基酸组成与人体需求模式基本平衡，是理想的蛋白质来源[7]，虽然脆化时间不同，但普通草鱼和脆肉鲩中AAS和CS最高的均为Lys(最高的分别为2.369和2.327)，远高于其他鱼类[22-23](表 6和表 7)。EAAI是评价蛋白质营养价值最常用的指标之一，它以鸡蛋蛋白质必需氨基酸为参评标准，通过计算，脆肉鲩的EAAI最高达93.28，远高于其他鱼类[22, 24]，这说明脆肉鲩的营养价值较高。
3. 结论
1) 比较普通草鱼和脆化时间不同的脆肉鲩的肌肉营养成分发现，经过一定的脆化时间，脆肉鲩的水分和粗脂肪质量分数显著下降(P < 0.05)，而粗蛋白质量分数显著增加(P < 0.05)，但是灰分质量分数差异并不显著(P>0.05)；脆肉鲩和普通草鱼的蛋白组分相似，但是随着脆化时间的增加，脆肉鲩的肌原纤维蛋白、肌浆蛋白和基质蛋白质量分数要显著高于普通草鱼(P < 0.05)。经过脆化养殖后，脆肉鲩肌肉的硬度、弹性、咀嚼性和粘着性均显著增加(P < 0.05)。
2) 脆化时间不同，普通草鱼和脆肉鲩肌肉TAA、EAA总量和UAA总量上均存在差异显著性(P < 0.05)。普通草鱼的EAAI为119.88，比脆肉鲩(93.28)高22.19%；脆肉鲩肌肉中TAA最高为203.5 g·L-1，比普通草鱼(181.5 g·L-1)高22 g·L-1(P < 0.05)，脆肉鲩的EAA组成模式要优于FAO/WHO推荐的模式，是一种具有较高营养价值的蛋白来源。
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图 2 大黄鱼Gsdf氨基酸序列和其他鱼类Gsdf氨基酸序列的比较
箭头代表信号肽切割位点，黑色上画线为TGF-β结构域，9个保守的半胱氨酸残基用星号表示
Figure 2. Alignment of amino acid of L.crocea gsdf with other vertebrate fishes
The arrow indicates the putative cleavage sites of the signal peptide. The TGF-β domain is labeled with black overline. The nine positions with conserved cysteines are marked by asterisks.
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图 3 大黄鱼Gsdf与其他物种TGF-β超家族成员系统进化分析
Figure 3. Phylogenetic analysis of L.crocea Gsdf and other species TGF-β superfamily members
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图 4 大黄鱼Amh氨基酸序列和其他鱼类Amh氨基酸序列的比较
箭头代表信号肽切割位点，灰色上画线为AMH-N区域，黑色上画线为TGF-β结构域，10个保守的半胱氨酸残基用星号表示
Figure 4. Alignment of amino acid of L.crocea Amh with other vertebrate fishes
The arrow indicates the putative cleavage sites of the signal peptide. The AMH-N domain and the TGF-β domain that characterized this family are labelled with gray and black overline, respectively. The ten positions with conserved cysteines are marked by asterisks.
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图 5 基于Amh氨基酸序列的大黄鱼与其他物种系统发育分析
Figure 5. Phylogenetic analysis based on Amh amino acid sequences in L.crocea and other species
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图 6 gsdf（a）和amh（b）基因在大黄鱼不同组织中的表达
eye.眼；brain.脑；heart.心脏；liver.肝；spleen.脾；kidney.肾；headkidney.头肾；gonad.性腺；muscle.肌肉；stomach.胃；intestine.肠; *表示性腺表达量差异显著（P<0.05），且标在表达量较高的一侧
Figure 6. Expressions of gsdf (a) and amh (b) genes in different L.crocea tissues
"*"indicates significant difference between gonads and appears above the higher expression (P<0.05) and was marked on the higher expression value.
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图 7 gsdf（a）和amh（b）基因在大黄鱼不同发育时期性腺中的相对表达
Figure 7. Expressions of gsdf (a) and amh (b) genes in L.crocea gonads during different post-embryonic stages
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图 8 gsdf（a）和amh（b）基因在大黄鱼正常雌雄鱼和伪雄鱼性腺中的相对表达
Figure 8. Expressions of gsdf (a) and amh (b) genes in different L.crocea gonads from females, males and pseudo-males
表 1 相关引物及其碱基序列
Table 1 Primers and sequences used in the study
引物名
primer name引物序列（5′-3′）
primer sequence作用
functionmark-F TGGCTCTGTGAGGCGTCT 性别鉴定 mark-R ATACAATGATGACATCAATCCTGAT gsdf-O-F ATGTCCTTTACGTTCATTGTCATG 开放阅读框扩增 gsdf-O-R TTACTCTTCGCTGGGCTGCT amh-O-F ATGTTGTCGGTGGATGTCTTCTG amh-O-R TTAGCGGCATCCGCACTC gsdf-Q-F CTGATGGTGGAAACAGTACGAGCC 荧光定量PCR gsdf-Q-R AGAGTGCACACTGAACGACAGTC amh-Q-F AGCCAACATCAACAACTGCC amh-Q-R TTCATCCAAGTCCACCACCT β-actin-F TTATGAAGGCTATGCCCTGCC β-actin内参引物 β-actin-R TGAAGGAGTAGCCACGCTCTGT 
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表 2 大黄鱼Gsdf氨基酸序列的同源性分析
Table 2 Homology of L.crocea Gsdf amino acid sequence with other species
物种
species基因
gene相似性/%
similarity舌齿鲈Dicentrarchus labrax gsdf1 69 赤点石斑鱼Epinephelus akaara gsdf 67 舌齿鲈Dicentrarchus labrax gsdf2 66 黄鳝Monopterus albus gsdf 63 裸盖鱼Anoplopoma fimbria gsdf 62 黄鳍棘鲷Acanthopagrus latus gsdf 61 斑马宫丽鱼Maylandia zebra gsdf 60 尼罗罗非鱼Oreochromis niloticus gsdf 60 莫桑比克罗非鱼Oreochromis mossambicus gsdf 59 大菱鲆Scophthalmus maximus gsdf 59 三斑海猪鱼Halichoeres trimaculatus gsdf 58 红鳍东方鲀Takifugu rubripes gsdf 53 青鳉Oryzias latipes gsdf 52 虹鳟Oncorhynchus mykiss gsdf 43 斑马鱼Danio rerio gsdf 33
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表 3 大黄鱼Amh氨基酸序列的同源性分析
Table 3 Comparative identity of L.crocea Amh amino acid sequence with other species
物种
species相似性/%
similarity舌齿鲈Dicentrarchus labrax 76 裸盖鱼Anoplopoma fimbria 71 金钱鱼Scatophagus argus 70 奥利亚罗非鱼Oreochromis aureus 67 银汉鱼Odontesthes bonariensis 61 三斑海猪鱼Halichoeres trimaculatus 60 青鳉Oryzias latipes 53 虹鳟Oncorhynchus mykiss 49 斑马鱼Danio rerio 42
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