Study on transdermal penetration effects of Acorus tatarinowii essential oil and water soluble azone to fish anesthetics
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摘要:
文章研究了石菖蒲 (Acorus tatarinowii) 挥发油和水溶性氮酮2种常见透皮促进剂 (PE) 的4种不同质量分数 (1%、4%、7%、10%和1%、3%、5%、10%) 对中国花鲈 (Lateolabrax maculatus) 幼鱼药浴吸收MS-222和丁香酚的促透效果。结果显示：1) 2种PE可显著减少入麻和复苏时间，并降低丁香酚或MS-222的使用剂量以达到相似的麻醉效果；2) 2种PE的促透效果随质量分数增加先增强后减弱；3) 石菖蒲挥发油与水溶性氮酮对丁香酚或MS-222的最佳促透质量分数分别为7%和3%。分析鳃组织抗氧化指标发现：1) 丁香酚和MS-222浸泡对中国花鲈鳃组织造成一定程度的氧化应激，表现为鳃组织中过氧化物酶 (POD)、超氧化物歧化酶 (SOD)、过氧化氢酶 (CAT) 活性和谷胱甘肽 (GSH)、丙二醛（MDA） 浓度显著 (P<0.05) 升高；2) 协同使用PE，可减少麻醉剂用量，进而降低鳃组织氧化应激，表现为麻醉协同组鳃中SOD、CAT活性和MDA、GSH浓度显著 (P<0.05) 低于麻醉对照组。
Abstract:This study compared the penetration effects of two common penetration enhancers (PE) (Acorus tatarinowii essential oil and water soluble azone) with different mass fractions (1%, 4%, 7%, 10% and 1%, 3%, 5%, 10%) on the juvenile Lateolabrax maculatus absorbing eugenol and MS-222. The results show that: 1) PEs could reduce the time of anaesthesia and recovery significantly, and reduce the dosage of anesthetics to achieve similar anesthetic effects. 2) With increasing mass fraction of PE, the penetration effect first enhanced and then weakened. 3) The optimal mass fraction of penetration of A. tatarinowii essential oil and water soluble azone on eugenol or MS-222 were 7% and 3%, respectively. According to the antioxidant index of the gill tissue, we found that: 1) After soaking the fish in the anesthetics, the activities of peroxidase (POD), superoxide dismutase (SOD), catalase (CAT) and the concentrations of malonaldehyde (MDA), glutathione (GSH) increased in the gill tissue of L. maculatus (P<0.05). 2) The activities of SOD, CAT and the concentrations of MDA and GSH in the gill tissue of the PE anesthesia group were significantly lower than those of the control group (P<0.05).
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蛋白质是鱼体生长、繁殖和维持生命所必需的营养成分[1]。为了促进动物的营养需求，必须提供足够的蛋白质，以满足生长、组织修复和维持最佳健康状态等[2]。鱼类是人类的一种重要蛋白质来源，对全球人口的营养供给具有重要作用[3]。鲤 (Cyprinus carpio) 对饲料蛋白质的需求量因受温度[4]、体质量[5]、日粮中蛋白质含量[6]等环境因素影响而存在差异。近年来，鲤配合饲料的蛋白质原料如鱼粉、豆粕等资源匮乏[7]，价格不断攀升，因此不少学者从营养学角度积极探索用高效且低成本的蛋白源代替鱼粉[8-9]。也有学者从遗传育种角度出发，确定不同鲤种质对饲料蛋白质的需求，进而培育出对蛋白质需求量低的种质，从根本上解决鱼粉资源匮乏、价格昂贵等难题[10-11]。
2022年，我国鲤养殖产量高达284.3万吨，占全国淡水鱼总产量的10.49%[12]。黄河鲤 (C. carpio haematopterus) 是我国黄河流域长期自然形成的特有重要淡水经济鱼类，具有金鳞赤尾、体型梭长、肉质鲜美等特点[6]。前期研究表明，黄河鲤较其他鲤的饲料蛋白需求量相对较低[13]。本研究以黄河鲤为实验材料，进一步测定不同饲料蛋白水平对黄河鲤生长性能、血清生化、肝肠酶活力及mRNA表达水平的影响，确定黄河鲤对饲料蛋白水平的需求；以期为低氮饲料的研究与开发奠定理论基础，为优化鲤配合饲料的营养配比提供理论依据。
1. 材料与方法
1.1 饲料配方和制剂
饲料配方按《鲤鱼配合饲料》(GB/T 36782—2018) 设计，实验饲料以鱼粉和酪蛋白为主要蛋白源，鱼油、豆油为主要脂肪源，配制蛋白质质量分数为22%、25%、28%、31%、34%的饲料。各饲料原料按饲料配方精确称取后，过60目筛，按逐级放大的原则将原料混合均匀，后依据配方比例加入鱼油、豆油，充分混合后，制成直径为3 mm的饲料颗粒，自然风干后于−20 ℃保存备用。饲料组成及营养成分见表1。
表 1 实验饲料组成及营养水平 (干物质)Table 1 Formulation and proximate composition of experimental diet (Dry matter)% 原料名称
Ingredient蛋白质质量分数 (组别) Mass fraction of protein (Group) 22.63% (D1) 25.32% (D2) 28.15% (D3) 31.43% (D4) 34.18% (D5) 鱼粉 Fish meal 20.00 20.00 20.00 20.00 20.00 酪蛋白 Casein 4.50 9.30 14.00 19.00 23.70 鱼油 Fish oil 2.00 2.00 2.00 2.00 2.00 豆油 Soybean oil 2.30 2.30 2.30 2.30 2.30 次粉 Wheat meal 20.00 20.00 20.00 20.00 20.00 玉米淀粉 Cornstarch 20.00 20.00 20.00 20.00 20.00 维生素预混料 Vitamin premix 0.50 0.50 0.50 0.50 0.50 矿物质预混料 Mineral premix 0.50 0.50 0.50 0.50 0.50 氯化胆碱 Choline chloride 0.30 0.30 0.30 0.30 0.30 磷酸二氢钙 Ca(H2PO4)2 2.00 2.00 2.00 2.00 2.00 纤维素 Cellulose 23.60 19.60 15.50 11.20 7.20 DL-蛋氨酸 DL-Met 0.80 0.60 0.50 0.40 0.30 L-苏氨酸 L-Thr 1.20 1.00 0.80 0.60 0.40 赖氨酸 L-Lys 2.30 1.90 1.60 1.20 0.80 总计 Total 100.00 100.00 100.00 100.00 100.00 营养水平 Nutrient level 粗蛋白 Crude protein 22.63 25.32 28.15 31.43 34.18 粗脂肪 Crude lipid 6.50 6.60 6.30 6.60 6.50 赖氨酸 Lys 3.12 3.14 3.17 3.28 3.07 蛋氨酸 Met 0.91 0.99 0.93 0.99 0.92 苏氨酸 Thr 1.83 1.70 1.70 1.71 1.70 总磷 Phosphorus 1.13 1.00 0.97 0.95 1.15 注：每千克日粮中预混料提供以下成分：维生素 A 120 000 IU；维生素 D3 40 000 IU；维生素 E 1 400 mg；维生素 K3 350 mg；维生素 B1 200 mg；维生素 B2 200 mg；维生素 B6 270 mg；维生素 B12 1.2 mg；维生素 C 3 500 mg；D-泛酸钙 850 mg；烟酰胺 1 000 mg；叶酸85 mg；D-生物素 4.0 mg；肌醇 1 400 mg；镁850 mg；锌700 mg；锰 370 mg；铜136 mg；铁 3 100 mg；钴 33 mg；碘 20 mg；硒10 mg。 Note: The premix provides the following per kg of diets: Vitamin A 120,000 IU; Vitamin D3 40000 IU; Vitamin E 1, 400 mg; Vitamin K3 350 mg; Vitamin B1 200 mg; Vitamin B2 200 mg; Vitamin B6 270 mg; Vitamin B12 1.2 mg; Vitamin C3500 mg; Calcium D-pantothenate 850 mg; Nicotinamide1000 mg; Folic acid 85 mg; D-biotin 4.0 mg; Inositol 1, 400 mg; Magnesium 850 mg; Zinc 700 mg; Manganese 370 mg; Copper 136 mg; Iron 3, 100 mg; Cobalt 33 mg; Iodine 20 mg; Selenium 10 mg.1.2 实验鱼及饲养管理
实验鱼来自中国水产科学研究院黑龙江水产研究所宽甸水产试验站，暂养于水产养殖基地的室内循环水系统中。将平均体质量为 (360.22±1.02) g的黄河鲤 (120 尾)，随机分配到15个玻璃水箱 (46 cm×32 cm×52 cm)，每组设3个重复，每个重复8尾鱼。实验之前饥饿24 h，实验为期56 d。每天定时投喂3次，日投喂量为体质量的5%，根据体质量调整饲料量。养殖水源为曝气自来水，全程水温控制在 (25±1) ℃，每2 d换水1次，每次换1/3。
1.3 样品采集与处理
养殖结束后，统计每个鱼缸投喂的饲料量、成活率并计算饲料转化率，同时将鱼饥饿24 h，用200 mg·L−1的MS-222做快速深度麻醉，称量每条鱼的体质量，用于计算体质量增长率、特定生长率、蛋白质效率。每个平行随机取3尾鱼，每个处理组共9尾，用于血清和样品采集。将血液于4 ℃静置2 h，在4 ℃、
3500 r·min−1离心20 min制备血清，上清液分装于2 mL的冻存管中，移置 −80 ℃冰箱中保存，用于血清生化分析。取血后立即解剖，采集肠、肝脏立即放入液氮中，随后存放于−80 ℃冰箱中，用于肠道消化酶和肝脏抗氧化酶活性的分析。取脑、肠、鳃组织放入RNAlater (Thermo，美国)保存液，4 ℃放置24 h后，更换RNAlater保存液，于 −20 ℃保存，用于目的基因表达分析。1.4 生长性能与计算公式
根据初始个体数和末个体数之差计算成活率 (Survival rate, SR)，根据初、末体质量计算体质量增长率 (Weight gain rate, WGR) 和特定生长率 (Specific growth rate, SGR)，根据体质量与饲料量计算饲料系数 (Feed coefficient, FCR)和蛋白质效率 (Protein efficiency, PER)：
$$ \mathrm{S}\mathrm{R}{\text{=}}{N}_{t}/{N}_{0}\times 100\text{%} $$ (1) $$ \mathrm{W}\mathrm{G}\mathrm{R}{\text{=}}({W}_{t}{\text{−}}{W}_{0})/{W}_{0}\times 100\text{%} $$ (2) $$ \mathrm{S}\mathrm{G}\mathrm{R}{\text{=}}\left[(\mathrm{ln}{W}_{t}{\text{−}}\mathrm{ln}{W}_{0})/{t}\right]\times 100\text{%} $$ (3) $$ \mathrm{F}\mathrm{G}\mathrm{R}{\text{=}}\left[F/({W}_{t}{\text{−}}{W}_{0})\right]\times 100\text{%} $$ (4) $$ \mathrm{P}\mathrm{E}\mathrm{R}{\text{=}}\left[\left({W}_{t}{\text{−}}{W}_{0}\right)/\left(F\times P\right)\right]\times 100\text{%} $$ (5) 式中：Nt为成活尾数；N0为初始尾数；W t为终末体质量 (g)；W0为初始体质量 (g)；F为摄食量 (g)；t为养殖周期 (d)；p为饲料中粗蛋白质量分数 (%)。
1.5 血清生化与酶活测定
采用深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司生产的生化试剂盒，用 (BS-350E，中国) 生化自动分析仪测定血清中的生化指标：谷丙转氨酶 (ALT)、谷草转氨酶 (AST)、球蛋白 (GLO)、总蛋白 (TP)、白蛋白 (ALB)、总胆固醇 (TC)、甘油三酯 (TG)、碱性磷酸酶 (ALP)、高密度胆固醇 (HDL-C)、尿酸 (UA)，具体方法参照说明书。
肠道中胰蛋白酶 (TPS)、脂肪酶 (LPS)、α-淀粉酶 (α-AMS) 和肝脏中超氧化物歧化酶 (SOD)、过氧化氢酶 (CAT) 等酶活性和丙二醛 (MDA)、微量还原性谷胱甘肽 (GSH) 含量均采用南京建成生物工程研究所有限公司提供的试剂盒测定，参照试剂盒说明书测定。
1.6 相对基因表达的测定
利用RNA提取试剂盒 (Qiagen，德国) 提取各组织中肠、鳃和脑的总RNA。采用Prime ScriptTM RT reagent Kit with gDNA Eraser (Perfect Real Time) (Taraka，中国) 进行RNA反转录。根据NCBI数据库获得生长相关基因生长激素 (GH)、类胰岛素生长因子 (IGF-1)，蛋白质合成相关基因雷帕霉素靶蛋白(TOR)、真核细胞翻译起始因子4E结合蛋白2 (4EBP2)及氨代谢基因Rh蛋白家族 (Rhag、Rhbg和Rhcg1) 基因序列，并利用NCBI数据库的Primer-BLAST程序设计引物，委托生工生物工程 (上海) 股份有限公司合成引物。以β-actin为参考基因，采用实时荧光定量PCR，反应总体系20 μL，采用SYBR Green染料法，以Agilent Mx3005P实时定量PCR仪进行mRNA相对定量表达分析，每组至少重复3次。所用引物如表2所示。
表 2 荧光定量PCR引物Table 2 Primers used in quantitative real-time PCR基因名称
Gene name引物序列 (5'—3')
Sequences of primers (5'–3')GH① F: GGGGAGAGCATCAGACAACC R: CAGGCTGTCCTCAAAGTCGT IGF-1② F: GGCGCCTCGAGATGTATTGT R: TCCTTGGGCTGTCTGTATGC TOR③ F: AGCTAAGCCAAGATGAAGCCA R: ACTATGGCCAGGATACCACCT 4EBP2④ F: CCTCACGACTATTGCACCACT R: CTGGGCGATGGGTGAGTTA Rhag⑤ F: AAAGAAAGACAATGTTACGGCCA R: AATCAGGCCTGTGATCAACCC Rhbg⑥ F: TCGCAGCCTTTTCCCTACAG R: CTAGTCACGCCAACGTGGAT Rhcg1⑦ F: GTTCCTCCAGTCCTGGCTTAT R: ACGCTGCTCCACGAAGTTT β-actin F: GCCGTGACCTGACTGACTACCT R: GCCACATAGCAGAGCTTCTCCTTG 注：① 生长激素；② 类胰岛素生长因子；③ 雷帕霉素靶蛋白；④真核细胞翻译起始因子4E结合蛋白2；⑤—⑦ Rh蛋白家族 (Rhag、Rhbg和Rhcg1)。 Note: ① Growth hormone; ② Insulin-like growth factor 1; ③ Rapamycin target protein; ④ Eukaryotic translation initiation factor 4e binding protein 2; ⑤–⑦ Rh protein family (Rhag, Rhbg and Rhcg1). 1.7 数据统计与分析
使用Excel 2016软件和2−ΔΔCt法进行实时荧光定量PCR实验数据分析，并使用Excel 2016 软件绘制图表。采用SPSS 21.0软件进行数据分析 (单因素方差分析One-way ANOVA)，Duncan's检验进行多重比较，实验数据以“平均值±标准误 ($\overline { x}\pm s_{\overline { x}} $)”表示，p<0.05表示差异显著，p<0.01表示差异极显著，具有统计学意义。利用 Excel 2016软件制作回归方程来拟合生长指标与饲料蛋白含量间的相关关系，确定饲料蛋白质需求量。
2. 结果
2.1 饲料蛋白质水平对黄河鲤生长性能的影响
不同饲料蛋白质水平对黄河鲤生长性能的WGR、PER、SGR、FCR、SR的影响见表3。随着饲料蛋白质水平增加，WGR、SGR和PER均呈先升后降的趋势，均在D3组达到最高值，极显著高于其他组 (p<0.01)；而FCR呈先降后升的趋势，在28.15%时D3组极显著低于其他组 (p<0.01)。
表 3 饲料蛋白质水平对黄河鲤生长性能的影响Table 3 Effects of different protein contents on growth performance of Yellow River carp生长性能
Growth performance蛋白质质量分数 (组别) Mass fraction of protein (Group) 22.63% (D1) 25.32% (D2) 28.15% (D3) 31.43% (D4) 34.18% (D5) 初始体质量 Initial body mass/g 357.30±0.92 360.30±3.01 363.23±0.52 362.04±2.14 358.23±1.76 终末体质量 Final body mass/g 650.31±0.33d 703.12±4.82c 765.01±7.27a 729.81±9.51b 654.48±0.72d 体质量增长率WGR/% 82.01±0.46d 95.15±0.41c 110.60±2.08a 101.56±1.87b 82.71±0.86d 特定生长率SGR/(%·d−1) 1.07±0.00d 1.19±0.00c 1.33±0.02a 1.25±0.02b 1.08±0.01d 蛋白质效率PER/% 1.58±0.01c 1.70±0.02b 1.80±0.01a 1.50±0.05c 1.15±0.02d 饲料系数FCR 2.87±0.01a 2.35±0.03c 1.97±0.01d 2.16±0.07c 2.57±0.05b 成活率SR/% 100.00 100.00 100.00 100.00 100.00 注：同行数据中上标字母不同表示差异显著(p<0.05)。 Note: The values with different superscript letters within the same line are significantly different (p<0.05). 以SGR、FCR为因变量y，以蛋白质水平为自变量x，分别进行二次回归方程拟合，得到方程y= −71.533x2+40.874x−
4.5322 (r²=0.9556 ) 和y = 211.3x2 −122.74x +19.838 (r2=0.9896 )；当x=28.57%时，SGR最大 (图1)；当x=29.04%时，FCR最小 (图2)；因此，黄河鲤SGR 和FCR的最佳蛋白质质量分数分别为28.57%和29.04%。![]()
图 1 不同饲料蛋白质水平与特定生长率的关系Fig. 1 Relationship between different dietary protein content and specific growth rate![]()
图 2 不同饲料蛋白质水平与饲料转化系数的关系Fig. 2 Relationship between different dietary protein content and feed coefficient2.2 饲料蛋白质水平对黄河鲤血清生化指标的影响
不同饲料蛋白质水平条件下，黄河鲤血清生化指标活性变化情况见表4。随着饲料蛋白质水平的增加，ALT和AST呈先降后升的趋势，在D3组达到最低，显著低于D1和D5组 (p<0.05)；而ALP呈先升后降的趋势，在D3组达到最高，显著高于D1和D5组 (p<0.05)。
表 4 饲料蛋白质水平对黄河鲤血清生化的影响Table 4 Effects of different protein contents on serum biochemical of Yellow River carp血清生化
Serum biochemical蛋白质质量分数 (组别) Mass fraction of protein (Group) 22.63% (D1) 25.32% (D2) 28.15% (D3) 31.43% (D4) 34.18% (D5) 谷丙转氨酶 ALT/(U·L−1) 18.40±1.31a 15.10±1.41ab 12.60±1.03b 13.63±0.97ab 17.63±1.08a 谷草转氨酶 AST/(U·L−1) 100.77±4.36a 80.93±1.05bc 69.50±4.27c 77.10±2.81bc 89.53±3.91ab 碱性磷酸酶 ALP/(U·L−1) 29.53±2.38b 37.33±2.39ab 45.47±2.77a 37.73±2.98ab 29.33±2.36b 总蛋白 TP/(g·L−1) 33.40±0.91 32.80±0.79 33.40±0.08 33.23±0.21 34.03±0.41 白蛋白 ALB/(g·L−1) 12.20±0.54 12.23±0.27 12.30±0.25 11.97±0.30 12.43±0.07 总胆固醇 TC/(mmol·L−1) 5.81±0.17 5.56±0.16 5.36±0.09 5.21±0.21 5.23±0.37 甘油三酯 TG/(mmol·L−1) 1.07±0.12 1.24±0.12 1.04±0.07 1.04±0.15 1.14±0.10 高密度胆固醇 HDL-C/(mmol·L−1) 2.78±0.02 2.72±0.06 2.69±0.02 2.69±0.03 2.70±0.07 尿酸 UA/(μmol·L−1) 33.73±2.41 33.77±0.69 34.90±1.27 30.10±1.35 32.33±1.12 球蛋白 GLO/(g·L−1) 1.07±0.00 1.19±0.00 1.33±0.02 1.25±0.02 1.08±0.01 注：同行数据中上标字母不同表示差异显著(p<0.05)。 Note: The values with different superscript letters within the same line are significantly different (p<0.05). 2.3 饲料蛋白质水平对黄河鲤肠道消化酶的影响
不同饲料蛋白质水平条件下，黄河鲤肠道的 ɑ-AMS、LPS和TPS活性变化见表5。随着饲料蛋白质水平的增加，ɑ-AMS、LPS和TPS活性均呈先升后降的趋势，均在D3组达到最高值；其中，ɑ-AMS活性极显著高于D1和D5组 (p<0.01)；LPS和TPS活性显著高于D1和D5组 (p<0.05)。
表 5 饲料蛋白质水平对黄河鲤消化酶的影响Table 5 Effects of different protein contents on digestive enzyme of Yellow River carp消化酶
Digestive enzyme蛋白质质量分数(组别) Mass fraction of protein (Group) 22.63% (D1) 25.32% (D2) 28.15% (D3) 31.43% (D4) 34.18% (D5) α-淀粉酶 α-AMS/(U·mg−1) 0.38±0.01c 0.42±0.01ab 0.44±0.01a 0.42±0.01ab 0.39±0.01bc 脂肪酶 LPS/(U·g−1) 0.52±0.03b 0.63±0.01ab 0.70±0.02a 0.62±0.04ab 0.50±0.08b 胰蛋白酶 TPS/(U·g−1) 0.38±0.05b 0.47±0.03ab 0.59±0.06a 0.49±0.04ab 0.38±0.03b 注：同行数据中上标字母不同表示差异显著(p<0.05)。 Note: The values with different superscript letters within the same line are significantly different (p<0.05). 2.4 饲料蛋白质水平对黄河鲤肝脏抗氧化酶的影响
不同饲料蛋白质水平条件下，黄河鲤肝脏SOD、CAT活性和GSH、MDA含量变化情况见表6。随着饲料蛋白水平的增加，SOD、CAT活性和GSH含量均呈先升后降的趋势，均在D3组达到最高；MDA含量呈先降后升的趋势，且在D3组达到最低。D3组的SOD、CAT、GSH、MDA相较于D1和D5组有显著性差异 (p<0.05)。
表 6 饲料蛋白质水平对黄河鲤抗氧化酶的影响Table 6 Effects of different protein contents on antioxidant oxidase of Yellow River carp抗氧化酶
Antioxidant oxidase蛋白质质量分数(组别) Mass fraction of protein (Group) 22.63% (D1) 25.32% (D2) 28.15% (D3) 31.43% (D4) 34.18% (D5) 超氧化物歧化酶 SOD/(U·mg−1) 85.24±0.11c 96.21±0.95b 101.73±0.44a 97.50±0.97ab 82.70±2.45c 过氧化氢酶 CAT/(U·mg−1) 1.85±0.06c 2.67±0.29ab 3.14±0.16a 2.48±0.24abc 2.02±0.11bc 还原性谷胱甘肽 GSH/(μmol·mg−1) 5.13±0.23c 7.23±0.09b 9.82±0.55a 7.83±0.64b 5.60±0.35c 丙二醛 MDA/(nmol·mg−1) 0.55±0.06a 0.34±0.05ab 0.28±0.05b 0.40±0.02ab 0.53±0.09a 注：同行数据中上标字母不同表示差异显著(p<0.05)。 Note: The values with different superscript letters within the same line are significantly different (p<0.05). 2.5 饲料蛋白质水平对黄河鲤生长基因相对表达量的影响
不同饲料蛋白质水平条件下，黄河鲤的GH和IGF-1基因相对表达量变化情况见图3。随着饲料蛋白质水平的增加，GH和IGF-1基因相对表达量均呈先升后降的变化规律，且均为D3组显著高于其他实验组 (p<0.05)。
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图 3 饲料蛋白质水平对脑GH、IGF-1基因相对表达量的影响注：同色方柱上不同字母表示差异显著(p<0.05)。Fig. 3 Effects of different protein contents on relative expressions of GH and IGF-1 in brainNotes: Different letters on the same colored square column representsignificant differences (p<0.05).2.6 饲料蛋白质水平对黄河鲤的蛋白质合成基因相对表达量的变化
不同饲料蛋白质水平条件下，黄河鲤TOR和4EBP2基因相对表达量变化情况见图4。随着饲料蛋白质水平的增加，TOR和4EBP2基因相对表达量均呈先升后降的变化规律，且在D3组的表达量显著高于D1、D4和D5组 (p<0.05)。
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图 4 饲料蛋白质水平对肠TOR、4EBP2基因相对表达量的影响注：同色方柱上不同字母表示差异显著(p<0.05)。Fig. 4 Effects of different protein contents on relative expressions of TOR and 4EBP2 in intestinesNotes: Different letters on the same colored square column representsignificant differences (p<0.05).2.7 饲料蛋白质水平对黄河鲤代谢基因相对表达量的变化
不同饲料蛋白质水平条件下，黄河鲤Rhag、Rhbg和Rhcg1基因相对表达量变化情况见图5。随着饲料蛋白质水平的增加，Rhag、Rhbg和Rhcg1基因相对表达量均呈逐渐上升的趋势。D4和D5组的Rhag基因相对表达量显著高于D1组 (p<0.05)，D3、D4和D5组的Rhbg和Rhcg1基因相对表达量显著高于D1和D2组 (p<0.05)。
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图 5 饲料蛋白质水平对鳃Rhag、Rhbg、Rhcg1基因相对表达量的影响注：同色方柱上不同字母表示差异显著(p<0.05)。Fig. 5 Effects of different protein contents on relative expressions of Rhag, Rhbg and Rhcg1 in gillNotes: Different letters on the same colored square column representsignificant differences (p<0.05).3. 讨论
3.1 饲料蛋白质水平对黄河鲤生长和蛋白合成的影响
WGR、SGR通常是鱼类营养学研究中用于评价生长速率的重要指标，PER和FCR是评价饲料利用率的重要指标[14]。本研究发现，不同饲料蛋白质水平对黄河鲤的SR无显著性影响，但对SGR和FCR影响显著，SGR总体呈先升后降的趋势，而FCR的变化趋势则相反；拟合分析得出黄河鲤生长最佳饲料蛋白质需求量为28.57%~29.04%。已有研究表明，以小麦粉、白鱼粉为蛋白源，水温26 ℃时，体质量为 (165.24±5.08) g的松浦镜鲤 (C. carpio Songpu)[15]的生长最适饲料蛋白质需求量为31.46%，表明不同鲤鱼品种的饲料蛋白质需求量存在差异。与其他鲤类群相比，黄河鲤对蛋白质的需求量相对较低，也可能与本研究所选的规格、实验水温等有关。而以豆粕为主要蛋白源，水温22.34 ℃时，体质量为 (160.24±15.56) g的黄河鲤[16]的生长最适饲料蛋白质需求量为25%，推测不同实验水温、规格的黄河鲤对饲料蛋白质的需求量存在差异。此外，研究发现热带鲶鱼 (Mystus nemurus)[17]、团头鲂 (Megalobrama amblycephala)[18]、方正银鲫 [Caucian carp gibelio (Bloch)][19]的饲料蛋白质水平超过最佳水平后SGR降低，这与本研究结果一致，表明鱼体需要消耗更多的能量来代谢体内多余的饲料蛋白质，进而造成用于生长的能量大大减少，导致生长受阻。
GH、IGF-I基因是生物体内蛋白质合成贮存的关键影响因子[20]，TOR和4EBP2基因在细胞生长和蛋白质生物合成中发挥极其重要的作用[21-22]。本研究表明饲料蛋白质质量分数为25.32%~28.15%时，GH、IGF-1和TOR、4EBP2基因相对表达量较高，这与SGR的变化趋势一致，在草鱼 (Ctenopharyngodon idella)[3]中也观察到了类似趋势，推测鲤的生长和蛋白质合成相关基因的高水平表达促进和积累了更多的内源性途径和蛋白质合成，它们不仅控制着鱼类生长、性腺发育、蛋白质的合成，还会显著影响SGR和FCR。
3.2 饲料蛋白质水平对黄河鲤生理代谢的影响
血清的ALT和AST是影响动物体内氨基酸代谢的重要酶类，可作为判断肝脏是否损伤的指示物。ALT作为肝脏中连接糖、脂质和蛋白质代谢的重要酶，应激可导致血清ALT活性在短期内升高[23]。动物在营养不良或胁迫状态下，可提高肝细胞的产酶活性或增加细胞膜通透性与细胞坏死，使AST大量进入血液，导致血清中酶活性升高[24]。本研究表明不同饲料蛋白质水平对黄河鲤血清中ALT和AST活性有显著性影响，短期投喂过低或过高蛋白质水平的饲料可能有助于提高其自我保护能力，降低细胞膜的通透性，阻抑细胞内ALT的溢出。
ALP是动物体内重要的代谢调控酶，直接参与磷酸基团的转移和钙磷代谢，作为评价机体免疫能力、代谢水平的指标，可提高机体免疫力[25-26]。本研究表明不同饲料蛋白质水平对黄河鲤血清中ALP指标有显著影响，发现ALP总体呈先升后降的趋势。在吉富罗非鱼 (Oreochromis niloticus)[27]和脊尾白虾 (Exopalaemon carinicauda)[28]中观察到相同变化趋势，表明适宜的饲料蛋白质水平可以使ALP活性增加，进而提升自身免疫力；而当饲料蛋白质水平高于或低于适宜范围时，可能会增加肝脏负担，降低鱼体免疫能力。
鳃是鱼体进行气体交换的主要场所，鱼体通过鳃丝表皮细胞进行离子平衡调节、氨氮(NH+ 4-N)排泄等重要生理过程[29]。为缓解体内的高浓度氨 (NH3) 的毒害作用，鱼体内可能存在尿素代谢和谷氨酰胺代谢2种氨代谢途径，谷氨酰胺代谢是主要的氨代谢途径，能够在鳃组织中将谷氨酰胺还原成NH3排出体外，目前Rh蛋白家族基因 (Rhag、Rhbg、Rhcg1) 被认为直接参与了NH3在鳃中的主动外排过程[30]和氨代谢过程[31]。刘梦梅[32]和付锦锋[33]研究发现，适量降低饲料中蛋白质水平能显著降低草鱼幼鱼、虹鳟 (Oncorhynchus mykiss) 的NH+ 4-N排放。赵兰等[34]研究发现，鲤鱼Rh家族基因mRNA表达水平随着碱度升高而上升，表明NH3排泄对于鲤适应碱胁迫环境、维持体内渗透压平衡有重要作用。本研究发现随着饲料蛋白质水平的增加，Rh家族基因相对表达量呈逐渐上升的趋势，表明高饲料蛋白质水平能够显著增加黄河鲤的NH+ 4-N排泄率，进而增加了鱼体的蛋白质代谢负担，超过适宜蛋白质水平反而会降低其生长性能。推测过高的饲料蛋白质水平不仅给鱼体带来氨代谢负担，导致其生长缓慢，更会污染环境，增加养殖成本。
3.3 饲料蛋白质水平对黄河鲤免疫酶活的影响
鱼体消化酶活性与摄取的饲料营养水平关系密切，其活性的高低决定着鱼类对营养物质的消化吸收，进而影响鱼类的生长速度[35]。肠道是α-AMS的主要消化场所，对黄河鲤[36]、黑脊倒刺鲃 (Spinibarbus caldwelli)[37]和点带石斑鱼 (Epinephelus coioiaes)[38]等的研究发现，随饲料蛋白质水平的增加，肠道的α-AMS、TPS、LPS活性在一定范围内均呈先升后降的趋势，本研究中黄河鲤肠道上述酶活性随饲料蛋白质水平增加呈先升后降的趋势，与上述研究结果一致，推测适当的饲料蛋白质水平可增加鱼肠道消化酶活性，但过量的蛋白质摄入会影响黄河鲤的消化功能，进而导致其生长性能下降。
鱼类机体细胞生存需保持适度的氧化与抗氧化平衡，如SOD和CAT等抗氧化酶及非酶性抗氧化物GSH在清除活性氧和防止机体受损伤方面具有重要作用[39-41]，适当的饲料蛋白质水平可以提高鱼体抗氧化能力。本研究显示，随着饲料蛋白质水平的增加，肝脏SOD和CAT活性和GSH含量呈先升后降的趋势，MDA含量则呈现相反趋势。MDA作为一种典型的氧化产物，能够反映机体的氧化损伤程度[42-43]。上述结果表明，适当的饲料蛋白质水平可提高机体抗氧化能力，同时减少氧化产物，进而提高机体的免疫力，但饲料蛋白水平过高会导致机体氧化损伤。本研究结果与松浦镜鲤[2]、黄河鲤[16,44-45]等的研究结果一致，表明饲料蛋白质水平与鲤的抗氧化能力具有一定相关性，对维持细胞和机体的常规生理生化活动有重要作用[46]。
4. 结论
综上所述，适当的饲料蛋白质水平对黄河鲤的生长性能及消化酶活性有明显促进作用，能够增强黄河鲤的免疫功能和抗氧化能力。在本研究的实验条件下，黄河鲤对饲料蛋白质的最佳需求量为28.57%~29.04%。
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图 1 中国花鲈达到镇静、麻醉和完全复苏的时间 (n=10)
a. 丁香酚 (E) +石菖蒲挥发油 (S)；b. MS-222 (M) +石菖蒲挥发油 (S)；c. 丁香酚 (E) +水溶性氮酮 (D)；d. MS-222 (M) +水溶性氮酮 (D)；组间字母不同者差异显著 (P<0.05)
Figure 1. Time to achieve sedation, anesthesia and complete resuscitation of L. maculatus (n=10)
a. Eugenol (E) + A. tatarinowii essential oil (S); b. MS-222 (M) + A. tatarinowii essential oil (S); c. Eugenol (E) + water soluble azone (D); d. MS-222 (M) + water soluble azone (D); values with different letters were significantly different (P<0.05).
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图 2 中国花鲈达到镇静、麻醉和完全复苏的时间 (n=10)
E. 丁香酚；S. 石菖蒲挥发油；D. 水溶性氮酮；M. MS-222；组间字母不同者差异显著 (P<0.05)；N. 未观察到
Figure 2. Time to achieve sedation, anesthesia and complete resuscitation of L. maculatus (n=10)
E. Eugenol; S. A. tatarinowii essential oil; D. Water soluble azone; M. MS-222; values with different letters were significantly different (P<0.05); N. Not observed
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图 3 鳃组织抗氧化指标 (n=5)
a. 过氧化物酶；b. 超氧化物歧化酶；c. 过氧化氢酶；d. 丙二醛；e. 谷胱甘肽；AC. 对照组；EC. 10 mg·L−1丁香酚；ES. 8 mg·L−1丁香酚+7%石菖蒲挥发油；ED. 8 mg·L−1丁香酚+3%水溶性氮酮；MC. 50 mg·L−1 MS-222；MS. 40 mg·L−1 MS-222+7%石菖蒲挥发油；MD. 40 mg·L−1 MS-222+3%水溶性氮酮；组间大写或小写字母不同者差异显著 (P <0.05)
Figure 3. Antioxidant indices of gill tissue (n=5)
a. POD; b. SOD; c. CAT; d. MDA; e. GSH; AC. Control group; EC. 10 mg·L−1 eugenol; ES. 8 mg·L−1 eugenol + 7% A. tatarinowii essential oil; ED. 8 mg·L−1 eugenol + 3% water soluble azone; MC. 50 mg·L−1 MS-222; MS. 40 mg·L−1 MS-222 + 7% A. tatarinowii essential oil; MD. 40 mg·L−1 MS-222 + 3% water soluble azone; values with different uppercase or lowercase letters were significantly different.
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