合浦珠母贝(Pinctada fucata)是培育海水珍珠的主要贝种，隶属于软体动物门、双壳纲。该物种在中国主要分布在广东、广西、海南等地，所产珍珠为著名的“南珠”^[1]，具有重要的经济价值。目前，合浦珠母贝主要为海区吊养，容易受到外界环境的影响。海水温度急剧升高可导致机体产生大量活性氧^[2]，研究发现随海水温度骤升合浦珠母贝死亡率升高^[3]。温室效应引发养殖海域水温升高^[4]，严重影响合浦珠母贝的生长、免疫和存活。因此研究高温对合浦珠母贝的影响有重要的应用价值。

热休克蛋白(heat shock proteins，HSPs)是生物遭到环境中物理、化学、生物等刺激时产生应激反馈而合成的一类蛋白质，其在生物体内广泛存在，进化保守^[5]。根据相对分子质量大小差异划分，热休克蛋白家族现包括HSP90 (83~90 kD)、HSP70 (66~78 kD)、HSP60、HSP47和小热休克蛋白家族(small heat shock protein，sHSP) (12~43 kD)^[5-6]。热休克蛋白HSP22 (heat shock protein 22)因分子量约22 kD，被归为sHSP家族，也被称为HSPB8、E2IG1或H11激酶^[7]。HSP22具有抗氧化、生物耐热^[8]、分子伴侣^[9]、调节细胞凋亡^[10]和抗衰老^[11-12]等功能，是唯一能在体外以单体形式存在的sHSP。HSP22在机体受刺激后的主要作用机理是结合并分解变性及异常蛋白，修复蛋白的错误折叠，维持细胞内蛋白动态平衡，降低机体损伤^[7]。目前在海湾扇贝(Argopecten irradians)^[13]和栉孔扇贝(Azumapecten farreri)^[14]中已克隆出HSP22的基因序列，并在重金属胁迫、抗热性和鳗弧菌(Vibrio anguillarum)刺激方面进行了研究。在合浦珠母贝的热休克蛋白研究中，HSP20^[15]、HSP40^[16]、HSP60^[17]、HSP70^[18-19]和HSP90^[20-21]的基因序列已被成功克隆，并对温度、盐度、细菌等方面的胁迫进行了研究，但有关HSP22的研究尚未见报道。

类胡萝卜素(carotenoids)作为维生素A的前体，是动物体内维生素A的最主要来源，且可以提高动物系统的抗氧化及免疫能力^[22]。贝类可以通过食物积累类胡萝卜素，类胡萝卜素含量不同，贝类的壳和闭壳肌也呈现不同颜色^[23]。类胡萝卜素能帮助华贵栉孔扇贝(Chlamys nobilis)应对低温胁迫^[24]，且能增强免疫对副溶血性弧菌(V.parahaemolyticus)的免疫刺激^[25-26]。合浦珠母贝个体间闭壳肌颜色存在多态性，从白色到橘色深浅不一。本实验室测得橘色闭壳肌个体的类胡萝卜素含量较高，白色闭壳肌个体类胡萝卜素含量较低^[27]，并探讨了类胡萝卜素对合浦珠母贝高温适应性的影响^[3]，发现高类胡萝卜素含量个体抗氧化性更强、死亡率更低。已有类胡萝卜素和HSP22在部分生物机体中的研究报道，但在合浦珠母贝中类胡萝卜素和HSP22是否有关系还未见报道。

本研究获得了合浦珠母贝热休克蛋白22的基因PfHSP22 cDNA序列，通过生物信息学方法分析了基因序列、编码蛋白结构、蛋白相似性及与其他物种间的进化关系；通过实时荧光定量PCR检测了PfHSP22基因在类胡萝卜素含量不同的2组合浦珠母贝的组织差异性表达；对2组合浦珠母贝进行30 ℃高温胁迫，并检测了96 h内PfHSP22基因在各组织中的表达量变化，旨在探究类胡萝卜素对PfHSP22表达的影响。

1.   材料与方法

1.1   实验材料

合浦珠母贝来源于本实验室构建的不同颜色闭壳肌家系和未选育家系。实验组为橘色闭壳肌家系，类胡萝卜素含量高；对照组为未选育的白色闭壳肌家系，类胡萝卜素含量低。在2个家系中分别选取规格相近、性腺成熟、活力较强的20月龄合浦珠母贝各200只，实验前在海水温度(26±0.5) ℃、盐度30的水泥池中暂养1周，期间在每天喂食前换过滤海水2次，每次换1/2水量，分别于09:00和18:00投喂适量1∶1的扁藻(Platymonas subcordiformis)和小球藻(Chlorella vulgari)^[3]。实验时，从实验组和对照组挑选规格相近、有活力的个体各120只，在1 m³的水泥池(养殖水体0.8 m³)中进行高温胁迫实验。实验水温为(30±0.5) ℃，盐度为30，溶解氧不低于5 mg·L^–1。实验后于第0、第3、第6、第12、第24、第48和第96 小时，在每个组随机选取3个个体，取鳃、外套膜、闭壳肌、肝胰腺、性腺和足等组织。第0小时样品组织为未胁迫对照。用0.1%的焦磷酸二乙酯水(即DEPC水)冲洗后立即置于RNA保护液(TaKaRa)中，随后放置在液氮中保存备用。

1.2   总RNA提取和cDNA合成

按照说明书用Trizol (Invitrogen，USA)提取上述样品总RNA，RNA完整性用1%的琼脂糖凝胶电泳检测，总RNA浓度、纯度和A260/A280值用NanoDrop 2000核酸微量定量仪检测。用反转录试剂盒(M-MLV，TaKaRa)以总RNA为模板合成cDNA链用于cDNA序列扩增。用试剂盒PrimeScript^TM RT reagent Kit with gDNA Eraser (TaKaRa)得到各样品cDNA链供实时荧光定量PCR使用。

1.3   目的基因cDNA的获得

从本实验室的合浦珠母贝转录组数据库中筛选出HSP22基因片段。用引物HSP22-F：5'-AGCCACACATTACAACAACT-3'和HSP22-R：5'-ACTCAGGCAATACGATACAC-3'对HSP22基因进行PCR扩增验证。PCR反应程序为94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，49 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，35个循环；72 ℃ 10 min。cDNA模板用量1 μL，正反向引物各0.8 μL，反应总体系为20 μL。扩增片段用1%的琼脂糖凝胶进行电泳检测，并用DNA纯化回收试剂盒(Magen)对目的片段进行胶回收^[28]。将回收纯化的目的片段按说明书与pM-D^TM18-T载体(pMD^TM18-T Vecotr Cloning Kit，TaKaRa)进行连接、转化^[28-29]，挑选单克隆，送擎科生物(广州)有限公司测序。

1.4   序列分析

对获得的目的基因PfHSP22 cDNA序列，用ORF finder (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/)在线查找开放阅读框。编码蛋白PfHSP22的理化性质通过ProtParam (https://web.expasy.org/protparam/)预测。蛋白磷酸化位点和糖基化位点分别通过NetPhos 3.1 Sever (http://www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/)和NetNGlyc 1.0 Server (http://www.cbs.dtu.dk/services/NetNGlyc/)预测。PfHSP22蛋白结构域通过ScanProsite (http://prosite.expasy.org/)预测。是否含信号肽通过SignalP 4.1 Server (http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)分析。PfHSP22的三维结构通过SWISS-MODEL (https://swissmodel.expasy.org/)进行预测，并用NCBI网站BLAST中的Global Align (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PAGE_TYPE=BlastSearch&PROG_DEF=blastn&BLAST_PROG_DEF=blastn&BLAST_SPEC=GlobalAln&LINK_LOC=BlastHomeLink)分析不同物种HSP22序列相似性；用Clustal X和Bioedit软件进行多重序列比对，并运用TEX shade软件对比对结果进行编辑。用MEGA 7.0软件^[30]，以NJ (neighbor-joining)法构建系统进化树，bootstrap值设为1 000。

1.5   目的基因的表达分析

荧光定量引物为HSP22-qPCR-F：5'-CCCGGAAAGAAGGTATATCG-3'和HSP22-qPCR-R：5'-GCTTGGATCGTTAAAACACC-3'。选择合浦珠母贝18S为内参基因，引物为18S-F：5'-TGTCTGCCCTATCAACTTTC-3'和18S-R：5'-TGTGGTAGCCGTTTCTCA-3'^[31]。用SYBR^®Premix Ex Taq^TMKit (TaKaRa)进行实时荧光定量PCR反应，反应体系按试剂盒说明书配制，操作方法参考周代志等^[32]，反应程序为95 ℃ 2 min；95 ℃ 10 s，49 ℃ 30 s，退火步骤采集荧光信号，45个循环。各组织及各胁迫时间点样品取3个重复，加样时设3个复孔。实时荧光定量PCR数据通过2^–ΔΔCt法计算PfHSP22在实验组和对照组各组织及各时间点的相对表达量。用SPSS 23.0软件分析实验数据，表达量用“平均值±标准误($\overline X \pm {\rm SE}$)”表示^[28]，并用SigmaPlot 12.5软件对数据结果进行绘图。

2.   结果

2.1   PfHSP22生物信息学分析

将验证基因片段的测序结果与转录组数据筛选的合浦珠母贝HSP22序列进行比对，发现3个碱基位点变异，按照测序结果对变异位点进行了修正。由此获得合浦珠母贝热休克蛋白22基因核苷酸序列，命名为PfHSP22，GenBank登录号为MG013985。PfHSP22 cDNA全长2 187 bp (图1)，包括开放阅读框(ORF) 699 bp，5'非编码区322 bp，3'非编码区1 166 bp。预测PfHSP22编码氨基酸232个，分子量为25.614 kD，等电点(pI)为5.57。分析结果显示该蛋白无跨膜结构，且不含信号肽。功能结构域分析发现PfHSP22具有典型的小热休克蛋白家族sHSP (121~228 aa)结构域。预测显示PfHSP22含27个磷酸化位点和1个糖基化位点，其中丝氨酸位点有20个，苏氨酸位点有6个，酪氨酸位点仅1个(图1)。使用SWISS-MODEL同源建模法，将PfHSP22蛋白序列和搜索到的模板匹配，预测出合浦珠母贝小热休克蛋白PfHSP22的三维空间结构(图2)。发现PfHSP22蛋白以β折叠构象为主，且在N端有约3个α螺旋，其余为无规则卷曲。

图  1  PfHSP22 cDNA及编码氨基酸序列

起始密码子(ATG)和终止密码子(TAA)序列字体加粗显示；灰色背景序列表示sHSP结构域；图形框表示磷酸化位点；圆形框表示糖基化位点

Figure  1.  Predicted amino acid and nucleotide sequence of PfHSP22 cDNA

The sequences of start codon (ATG) and stop codon (TAA) are in bold; the sequences in grey represent the sHSP domain; the hosphorylation sites are framed by box; the glycosylation site is surrounded by a circle.

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图  2  PfHSP22三维立体结构预测

Figure  2.  Predicted three-dimensional structure of PfHSP22

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将PfHSP22蛋白序列与其他物种的HSP22蛋白序列进行多重序列比对(图3)，发现PfHSP22与其他物种HSP22序列的保守性不高。序列相似性分析显示PfHSP22蛋白序列与缢蛏(Sinonovacula constricta)的HSP22相似性最高(54%)；与河蚬(Corbicula fluminea)的相似性最低(28%)；全部比对序列相似性为28%~54% (表1)。

图  3  PfHSP22蛋白序列和不同物种热休克蛋白22的多重比对结果

Figure  3.  Multi-alignment of heat shock protein 22 between PfHSP22 and other species

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表  1  合浦珠母贝HSP22基因氨基酸序列与其他物种HSP22的比较

Table  1.  Comparison of amino acid sequence of HSP22 gene of P.fucata with other species

物种 species	一致性/% identity	相似性/% similarity	序列登录号 accession No.
缢蛏 Sinonovacula constricta	43	54	AGM14597.1
菲律宾帘蛤 Ruditapes philippinarum	44	53	ACU83231.1
紫贻贝 Mytilus galloprovincialis	39	51	AEP02967.1
人 Homo sapiens	22	38	NP_055180.1
黑猩猩 Pan troglodytes	22	38	XP_509417.1
家鼠 Mus musculus	23	37	NP_109629.1
原鸡 Gallus gallus	22	37	XP_415280.1
褐家鼠 Rattus norvegicus	23	37	NP_446064.1
黄牛 Bos taurus	23	37	NP_001014955.1
致倦库蚊 Culex quinquefasciatus	25	35	EDS45823.1
栉孔扇贝 Azumapecten farreri	18	35	AAR11780.1
海湾扇贝 Argopecten irradians	20	35	ACA23998.1
斑马鱼 Danio rerio	25	34	NP_001094427.2
中国蛤蜊 Mactra chinensis	22	31	ALT66173.1
非洲爪蟾 Xenopus tropicalis	21	31	NP_001005658.1
扰血蝇 Haematobia irritans	16	31	JAV17626.1
果蝇 Drosophila melanogaster	19	30	NP_001027115.1
河蚬 Corbicula fluminea	22	28	AGW82232.1

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系统进化分析显示合浦珠母贝PfHSP22单独聚为一支，并与紫贻贝(Mytilus galloprovincialis)、缢蛏、河蚬和菲律宾帘蛤(Ruditapes philippinarum)的亲缘关系较近(图4)。

图  4  基于NJ法构建的HSP22家族成员进化树

分支旁边的数值表示在bootstrap测验中相关分类群聚成一支的复制树的百分比(1 000次重复)

Figure  4.  A phylogenetic tree of HSP22 family members constructed with neighbor-joining method in MEGA software

The percentage of replicate trees in which the associated taxa clustered together in the bootstrap test (1 000 replicates) are shown next to the branches.

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2.2   常温条件下PfHSP22 mRNA组织差异表达分析

实时荧光定量PCR结果显示，常温条件下PfHSP22在合浦珠母贝的6个组织中均有表达，橘色和白色闭壳肌组中，足中的相对表达量均最高(图5)。各组织相对表达量高低顺序2组情况基本相同，橘色组为足>性腺>闭壳肌>鳃>外套膜>肝胰腺，白色组的差别是鳃的表达量高于闭壳肌。相同组织中橘色组PfHSP22的相对表达量均显著高于白色组(P<0.05)。

图  5  常温条件下橘色和白色闭壳肌合浦珠母贝不同组织PfHSP22 mRNA表达比较

*. 橘色组和白色组差异显著(P<0.05)

Figure  5.  Comparison of PfHSP22 mRNA expression in different tissues of P.fucata in orange group and white group at normal temperature

*. significant difference between orange group and white group (P<0.05)

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2.3   高温胁迫下PfHSP22在2组类胡萝卜素含量不同个体中的表达情况

高温胁迫下，96 h内各组织PfHSP22 mRNA相对表达量总体变化趋势均为先出现下降，随后部分组织的表达量持续升高，而部分组织表达量升高后又出现下降和再升高(图6)。足组织中橘色组表达量先降低而后持续升高，白色组总体表达变化也是先降低后升高，在第6小时出现首次升高；闭壳肌组织中橘色组表达量先骤降后升高，白色组表达量升高后又持续下降，第24小时两组表达量均出现显著升高(P<0.05)；肝胰腺和外套膜中，橘色组个体表达量分别在第24和第12小时出现骤升，白色组个体表达量分别在第6和第24小时出现骤升，2种组织的橘色和白色组表达量在其他时间点的总体变化趋势都是先下降再升高，且都在第96小时显著升高(P<0.05)；鳃组织中，橘色组表达量先骤降至较低相对表达量，而后在第96小时显著升高(P<0.05)，白色组表达量在第24小时显著升高，其他时间点表达量相对较低且变化不大；性腺组织中，橘色组表达量先骤降，在第24小时升高后，又出现降低和升高变化，白色组表达量先降低，并在第24小时显著升高(P<0.05)后持续降低。

图  6  高温胁迫下橘色组和白色组各组织PfHSP22 mRNA在不同时间的表达比较

相同颜色组内不同小写字母表示不同时间的PfHSP22 mRNA表达量差异显著(P<0.05)

Figure  6.  Comparison of PfHSP22 mRNA expression in different tissues of orange group and white group at different time under high temperature stress

Different lowercase letters in the same color group indicate significant difference in the expression of PfHSP22 mRNA at different time (P<0.05).

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3.   讨论

合浦珠母贝PfHSP22蛋白具有sHSP家族标志性的“α-晶体结构域”(ACD)^[33]，且含有多个功能性位点，这些位点在特征结构域外分布较密集，而在结构域内分布较分散(图1)。HSP22能够行使多种功能^[8-12]，与其自身结构特点关系密切，PfHSP22的功能位点及其分布可能与识别结合靶蛋白^[33]或调节信号通路^[34]有关。有研究显示，HSP22属于热诱导的sHSP，与α晶状体蛋白一样表现出温度依赖性分子伴侣性质，以此阻止靶蛋白的聚集，在哺乳动物中，HSP22随着表面疏水性和分子伴侣活性增加，表现出热诱导的构象变化^[35]；也有研究发现HSP22基因能和HSP17、HSP21、HSP27等基因共同作用，帮助摇蚊(Chironomus riparius)应对镉(Cd)胁迫^[36]，维持蛋白质动态平衡；还有研究发现HSP22蛋白可通过模块化脚手架因子BAG3^[37]同时结合HSP70、HSP27或α晶状体蛋白，物理性的将分子伴侣家族成员结合成复合体，行使特定功能。因此今后可从基因互作或蛋白互作等方面继续探究合浦珠母贝PfHSP22基因的结构与功能关系。

PfHSP22与其他物种的HSP22氨基酸序列相似性不高(28%~54%)，但与缢蛏、菲律宾帘蛤和紫贻贝的相似性相对较高，分别为54%、53%和51%；与栉孔扇贝、海湾扇贝、中国蛤蜊(Mactra chinensis)的HSP22序列相似性则分别为35%、35%和31%；与河蚬的相似性最低(28%)，原因是河蚬HSP22的氨基酸数目较小，只有94个残基。不同物种间HSP22系统进化分析显示，PfHSP22单独聚为一支，并与软体动物中紫贻贝、缢蛏、菲律宾帘蛤和河蚬的亲缘关系较近。系统进化分析结果基本与传统生物分类学结果相同，但也显示出HSP22在软体动物中的进化保守性不高。

常温条件下，PfHSP22在合浦珠母贝6个组织中均有表达，在足中表达量最高，性腺次之，而在肝胰腺中的表达量最低，表明PfHSP22在合浦珠母贝各组织的表达具有一定的组织特异性。软体动物的足有助于运动和附着，而PfHSP22在足中高表达，可能是PfHSP22参与了足的细胞生理代谢，与足丝细胞的生成、凋亡等关系密切。性腺是生殖器官，PfHSP22在性腺的高表达表明其可能与合浦珠母贝的生殖细胞代谢有关，有研究发现HSP90在合浦珠母贝的性腺组织中也呈现高表达^[20]，可能说明性腺在进行某种生理活动时需要这2种基因均高表达。肝胰腺是重要的免疫器官，而PfHSP22在肝胰腺中的基础表达量却最低，可能表明在常温条件下，合浦珠母贝的基础免疫防御由PfHSP22基因发挥较小作用，而在合浦珠母贝基础免疫防御中发挥较大作用的可能包括HSP20^[15]、HSP60^[17]和HSP90^[21]，有研究检测到这3种热休克蛋白基因在肝胰腺中的基础表达量均为最高。另外，栉孔扇贝和海湾扇贝的HSP22基因分别在肝胰腺和心脏组织中被检测到表达量最高^[14]，这与合浦珠母贝的情况存在明显差异，可能由于在研究表达量时不同物种所测组织不同，另外也可能因为它们之间亲缘关系较远，HSP22基因在不同物种组织间表达情况差异大。栉孔扇贝和海湾扇贝亲缘关系较近，而且研究发现HSP22基因在其各组织的表达量顺序基本相同^[14]，这也间接支持了上述观点。常温条件下合浦珠母贝各组织的PfHSP22相对表达量均为橘色组显著高于白色组(P<0.05)，而橘色组来源于实验室构建的橘色闭壳肌家系，其个体总类胡萝卜素含量高于未经选育的白色组个体，这可能表明PfHSP22的基础表达量与个体总类胡萝卜素含量高低相关。本实验室曾对相同实验材料各组织的类胡萝卜素含量进行测定^[27]，经过比较第0小时各组织数据发现，橘色组各组织的类胡萝卜素含量均高于白色组，且为白色组的5.04~9.67倍，进一步表明类胡萝卜素含量高低可能影响PfHSP22的基础表达量。

本实验室所测相同实验材料的类胡萝卜素含量数据显示^[27]，高温胁迫下，橘色组和白色组各组织的类胡萝卜素含量在96 h内整体保持持续消耗，但橘色组各组织的类胡萝卜素含量始终高于白色组，且各组织类胡萝卜素消耗总量占初始含量的比例为橘色组84.32%~96.24%，白色组98.71%~99.67%。表明合浦珠母贝在响应高温胁迫时体内大量类胡萝卜素得到了利用，已有研究表明其具体功用之一是提高抗氧化能力^[3]。类胡萝卜素是一类脂溶性生物色素^[38]，在大量的生物体内都有分布。研究表明合浦珠母贝体内的类胡萝卜素从环境中吸收积累，它的转运和代谢与清道夫受体SR-BI^[23,39]及细胞内视黄酸结合蛋白CRABP^[40]有关。对比图6中各组织PfHSP22基因相对表达量发现，各组织都存在一些时间点的PfHSP22相对表达量白色组高于橘色组的现象，而并不是类胡萝卜素含量高的橘色组总高于白色组。这表明高温胁迫时，类胡萝卜素的含量高低不能单独解释PfHSP22的表达量变化，类胡萝卜素在物质功能方面对PfHSP22表达量的可能影响有待进一步探究。

高温胁迫开始的3 h内，除白色组鳃的表达量变化不明显外，橘色组和白色组各组织的PfHSP22相对表达量都迅速下降。表明高温胁迫开始后，合浦珠母贝各组织对胁迫进行了响应。表达量下降的原因可能是高温胁迫前期合浦珠母贝对PfHSP22蛋白的需求减少，这为今后探究PfHSP22蛋白在高温胁迫过程中可能发挥的具体作用提供了参考。随着胁迫过程的持续，PfHSP22基因表达量变化在橘色组和白色组的各组织中或升高或下降也有不明显变化。白色组中，肝胰腺的PfHSP22表达量在第6小时首先显著升高(P<0.05)，这一显著升高的时间早于闭壳肌、外套膜、鳃和性腺的第24小时，足中的表达量虽然在第6小时已有升高，但显著升高的时间是第96小时；橘色组中，肝胰腺和闭壳肌的PfHSP22表达量在第24小时首先显著升高(P<0.05)，这一显著升高时间早于足、外套膜和鳃的第96小时，而性腺在胁迫开始3 h后至第96小时的表达量无显著变化。以上结果表明，在高温胁迫下，各组织的PfHSP22表达变化具有组织特异性。在应对胁迫过程中，当需要增加PfHSP22表达量时，白色组和橘色组肝胰腺组织发生显著改变的时间均相对早于其他组织，这可能体现了其免疫防御功能的重要地位。进一步比较发现，橘色组有3个组织(肝胰腺、鳃和外套膜)的PfHSP22表达量显著升高时间比白色组晚，显著升高时间相同的是足和闭壳肌，而白色组的性腺有显著升高，橘色组的未出现显著升高。这说明一些组织调节PfHSP22表达量显著升高的进程在橘色组和白色组中存在差异，且橘色组进程相对晚于白色组，这可能与橘色组中这些组织的类胡萝卜素含量高有关，但具体原因和机理有待深入探究，以解释其他组织的不同表现。

本研究获得了合浦珠母贝热休克蛋白22的基因PfHSP22全长，分析了常温条件和高温胁迫下PfHSP22基因在类胡萝卜素含量不同的2组合浦珠母贝中的组织表达差异性，发现各组织PfHSP22表达量及变化具有组织特异性，类胡萝卜素含量高低可能影响PfHSP22的基础表达，但不能单独解释高温胁迫下PfHSP22的表达量变化。