细胞色素P450(cytochrome P450，CYPs)是一类广泛分布于生物体内的超基因家族，其酶系能够催化内源物质的合成、降解以及外源性物质的代谢^[1]，在解毒代谢阶段I起到重要作用^[2]。CYPs基因具有结构多样性，这决定了细胞色素P450酶系可能是自然界最具催化多样性的酶系之一^[3]。NELSON等^[2]基于481个细胞色素P450基因和22个假基因的趋异进化关系以及氨基酸序列相似度将CYPs归为不同的“家族(family)”、“亚家族(subfamily)”，同一家族序列同源性大于40%，同一亚家族序列同源性大于55%^{[2, 4]}。目前无脊椎动物中已发现的CYPs家族数已超过了70多个^[5]，而软体动物中CYPs基因的相关研究基础十分薄弱，仅在栉孔扇贝(Chlamys farreri)^[6]、菲律宾蛤仔(Ruditapes philippinarum)^[7]、翡翠贻贝(Perna viridis)^[8]以及长牡蛎(Crassostrea gigas)^[9]等少数物种有相关基因的研究报道，且缺乏系统的命名。

福寿螺(Pomacea canaliculata)具有适应性强、繁殖力高等特点，严重危害水域生态、农作物及人类健康，是中国恶性外来入侵种之一^[10]。目前普遍采用四聚乙醛(methaldehyde)为有效成分的药物对其进行杀灭防治，然而四聚乙醛的持续重复施用诱导了福寿螺对其产生微弱抗药性^[11-12]。细胞色素P450作为生物体内三大解毒酶系之一，已经被证明是害虫对杀虫剂产生抗性和交互抗性的主要原因之一^[13-14]，研究认为海洋贝类CYPs酶活力与水体有毒有机物代谢密切相关^[7]，而福寿螺耐药机理还不明了，相关研究十分薄弱。基于此，文章克隆分析了福寿螺CYP3192A1，采用荧光定量PCR(real time quantitative PCR，RT-qPCR)检测了CYP3192A1基因表达水平的组织及性别差异性，进而研究浓度及时间维度上四聚乙醛处理与CYP3192A1表达水平的相关性，初步探索CYP3192A1在四聚乙醛代谢中的作用地位，以为研究福寿螺CYPs基因结构与解毒功能，细胞色素P450功能及底物特异性奠定理论基础。

1.   材料与方法

1.1   材料处理

福寿螺采集于中国水产科学研究院珠江水产研究所外来水生生物入侵风险评估中心，螺体质量为9.32~15.28 g，壳高3.5~4.5 cm，取自相同世代群体。分别取雌、雄螺的肝、心、中肠、鳃、胃及腹足等6个组织，每个组织设3个样重复，采用RT-qPCR测定CYP3192A1基因表达水平，每样3个重复。

分别以0.6 mg·L^-1、2.0 mg·L^-1的亚致死浓度四聚乙醛处理福寿螺雌性群体，在用药后第0、第2、第6、第12、第24小时采集样品，选取鳃、肝、肠、胃4个组织，每个组织设3个样重复，RT-qPCR测定CYP3192A1表达水平，每样3个重复。

1.2   总RNA的提取

应用Mollusc RNA Kit R6875-01(OMEGA Bio-TEK)试剂盒提取福寿螺组织中总RNA，以电泳仪(BG-submidi)和核酸蛋白分析仪(东南D30)检测RNA质量与浓度后，置于-80 ℃保存备用。

1.3   细胞色素P450核心区cDNA克隆

应用PrimeScript^TMⅡ1st Strand cDNA synthesis Kit(TaKaRa)试剂盒进行反转录获得cDNA，-20 ℃保存。Primer Premier 5.0软件设计目的片段扩增引物P3-F和P3-R(表 1)，以TaKaRa LA Taq^®(RR02MA)进行PCR，测序；纯化目的片段、连接至pMD19-T载体，转染感受态细胞E.coli DH5α，菌液涂布于SOC培养基上12 h后挑菌落，经克隆、测序、鉴定后与已知序列进行比对。

1.4   cDNA末端快速扩增

以核心区序列为模板设计5′RACE-PCR套式引物P3-5′-1、P3-5′-2(表 1)，应用Clontech SMAR-Ter^® RACE cDNA Amplification Kit试剂盒进行反转录和Outer-PCR，通用引物为UPM；利用LA Taq^®和Ex Taq^®(TaKaRa)进行Inner-PCR，通用引物为NUP，依次进行PCR测序和克隆测序。设计引物P3-3′-1、P3-3′-2、P3-3′-3、P3-3′-4进行3′ RACE-PCR，利用试剂盒3′-Full RACE core Set with Prime Script^TM RTase、LA Taq^®(TaKaRa)、HiFi酶(Tran-sgene bio-tech)获得3′末端序列，通用引物为3′ Outer Primer、3′ Inner Primer，克隆测序。PCR主程序为94 ℃，30 s；退火30 s；72 ℃，30~60 s；30个循环；退火温度值见表 1。

表  1  细胞色素CYP3192A1扩增、RACE-PCR引物及荧光定量PCR引物

Table  1.  Primers used for PCR, RACE-PCR and quatitative real-time PCR

引物名称 primer	引物序列(5′→3′) primer sequence	扩增片段/bp amplified fragment	退火温度/℃ annealing temperature
P3-F P3-R P3-5′-1 P3-5′-2 P3-3′-1 P3-3′-2 P3-3′-3 P3-3′-4 UPM   NUP 3′ Outer Primer 3′ Inner Primer 18S-f 18S-r P3-QT-F P3-QT-R	5′-ATCATCCACACTCTCACTGC-3′ 5′-GAATCGTTACGCCGTTGA-3′ 5′-ATCCTCTGCCTTGGCGTTTTGTTCC-3′ 5′-TAACCGAATGACCTTCCACACAGCC-3′ 5′-ATCCACCCGACAGACTCTCACAGGC-3′ 5′-CTCAGCAAGAGGTTGTCTCCCAGTG-3′ 5′-GCTACCCACGACCCCACCAACTACC-3′ 5′-CTTCCCTTCGGTCTGGGTCCTCGTC-3′ 5′-CTAATACGACTCACTATAGGGCAAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT-3′ 5′-CTAATACGACTCACTATAGGGC-3′ 5′-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGT-3′Control Reagents 5′-TACCGTCGTTCCACTAGTGATTT-3′ 5′-CGCGGATCCTCCACTAGTGATTTCACTATAGG-3′ 5′-AATACATGCAAACCAGCTCC-3′ 5′-ATTTTTCGTCACTACCTCCC-3′ 5′-TTCGGTCTGGGTCCTCGTCA-3′ 5′-TACAGCCCTGGTGGAAGTGG-3′	1 247 1 247 758 672 1 225 1 094 1 010 922 5′ universal Primer mix   nested universal primer universal universal 329 329 322 322	56 56 60 62 60 60 62 62           57 57 57 57

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1.5   实时荧光定量PCR

预实验基础上以18S rDNA为荧光定量表达内参基因。参考福寿螺18S(EU520453.1)设计引物18S-f、18S-r；设计福寿螺CYP3A序列克隆片段引物P3-QT-F、P3-QT-R(表 1)，分别克隆、连接载体、转染感受态细胞制备18S rDNA和CYP3192A1质粒。分别将质粒以10^-1数量级稀释，共稀释6个浓度梯度；分别与SYBR^® Select Master Mix体系混合，置于LightCycler480 Software Setup(Roche罗氏)进行荧光定量PCR，获得荧光信号强度与浓度的标准曲线，结果显示18S内参基因表达的标准曲线为y=-3.404x+38，R²=0.993 3，E=98.4%；CYP3192A1基因的为y=-3.404 262x+34.09，R²=0.990 7，E=101.3%。说明实验数据可靠，可继续进行实验数据的检测。同实验组每个组织3个样品重复，然后每个cDNA样品分别进行荧光定量PCR，测定每个样CYP3192A1绝对定量表达，每个样品3次检测重复。

1.6   序列分析与数据统计

序列拼接与组装，获得CYP3192A1基因cDNA全序列；ORF finder在线工具预测开放阅读框(open reading frame，ORF)序列；NCBI数据库对蛋白序列进行Blastp和SmartBLAST搜索相似序列，MEGA 5.0进行ClustalW比对并构建Neighbor-Joining树；用ProtParam在线工具预测蛋白质的理论等电点pI、分子质量和亲水性等氨基酸特性；Motif Scan工具预测序列的模体结构；TMHMM server.V.2.0预测跨膜结构区；Interpro预测蛋白结构域并归类；SWISS-MODEL Workspace预测蛋白三维结构并分析底物识别位点(substrate recognition sites，SRS)；相似序列比对分析CYP3192A1序列保守位点。

用2^-ΔΔCT法处理分析荧光定量PCR数据^[15]，采用软件Excel 2010作图，SPSS 19.0统计分析性别、组织表达差异性及药物处理与福寿螺CYP3192A1表达水平的相关性。

2.   结果

2.1   CYP3192A1的克隆与鉴定分析

通过PCR和RACE-PCR从福寿螺鳃组织中克隆获得一条长度为2 523 bp的CYPs基因cDNA全序列(GenBank号KU923379)；包含了260 bp的5′非编码区(UTR)和712 bp的3′UTR序列，以及1 551 bp的开放阅读框序列，预测显示其编码517个氨基酸(图 1)，将氨基酸序列提交至细胞色素P450命名委员会，定名为CYP3192A1。预测蛋白质分子量约为58.0 kD，理论等电点为8.61，亲水性较弱，亮氨酸(Leu)含量高达12.6%。

图  1  福寿螺CYP3192A1克隆及氨基酸序列分析

CYP3192A1的核酸及编码氨基酸序列，不同背景颜色氨基酸序列为P450超家族E class的标签序列；蓝色字体标注的序列为跨膜螺旋；红色字体的序列依次为C螺旋(W***R)、I螺旋(AG*ET)、K螺旋(E**R)和血红素结合区F**G*** C*G。

Figure  1.  Cloning and amino acid sequence analysis of P.canaliculata CYP3192A1

The CYP3A-like sequences of nucleic acids and amino acids encoding; the sequence amino acids were marked by different background colors for P450 superfamily E class groupⅠsignature. Blue font tags sequence represent transmembrane helix. Red fonts represent helix C (W***R), I helix (AG*ET), helix K (E**R) and heme combination zone F**G***C*G.

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跨膜结构域预测显示1~11号氨基酸位于生物膜以内，35~517氨基酸位于细胞质内，而12~34氨基酸为一个跨膜螺旋(图 1)，其中12~31氨基酸镶嵌于生物膜内部；蛋白质结构分析显示其归类于细胞色素P450酶，具有P450超家族E类(E class)的标签(signature)序列(PR00463)：69~88氨基酸(amino acid，AA)、93~114 AA、380~398 AA、420~444 AA、452~462 AA以及462~485 AA(图 1)；还具有CYP450高度保守序列血红素结合区F** G***C*G、K螺旋(E**R)、I螺旋(AG*ET)、C螺旋(W***R)(图 1)等，其中亚铁血红素结合区视为CYPs的特征基序，与I螺旋、K螺旋等参与稳定蛋白核心结构^[16]，空间结构如图 2。

图  2  参照CYP3A4构建的福寿螺CYP3192A1蛋白质空间结构图

Figure  2.  Three-dimensional structure model of P.canaliculata CYP3192A1 protein basing on CYP3A4

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2.2   CYP3192A1的序列比对与系统发育分析

以福寿螺CYP3192A1氨基酸进行Blastp同源比对搜索，获得不同物种同源性序列，均为CYP3A亚家族序列；基于不同物种的CYP3A亚家族氨基酸序列同源性构建了系统发育树(图 3)，聚类分析显示福寿螺CYP3192A1与长牡蛎的CYP3A24归为一支，鱼类的CYP3A亚家族序列归为一支，人(Homo sapiens)和印度野牛(Bos taurus)等哺乳动物CYP3A亚家族归为一支，各种鸟的CYP3A亚家族序列归为一支，物种亲缘关系的亲疏符合传统的动物分类学中分类法则。与福寿螺CYP3192A1基因氨基酸序列同源性最高的为长牡蛎的CYP3A24序列，同源性仅为34%；推测福寿螺该CYPs属于细胞色素P450新家族的一个成员；将其序列提交至细胞色素P450命名委员会，正式定名为CYP3192A1。

图  3  基于序列同源性构建蛋白质CYP3192A1系统发育树

图中基因、物种名及对应的登录号见表 2。

Figure  3.  Polygenetic tree of CYP3192A1 based on sequence homology

The genes, Latin names, Chinese names of species and their Accession No. are shown in Tab. 2.

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表  2  图 3中基因、物种名及对应的登录号

Table  2.  Gene, Latin name, Chinese name of species and their Accession No. in Fig. 3

基因gene	物种species	登录号Accession no.
CY3A9	白鹭Egretta garzetta	KFP21783.1
CYP3A21	红蜂虎Merops nubicus	KFQ25408.1
CYP3A24	红冠蕉鹃Tauraco erythrolophus	KFV20621.1
CYP3A24	鹃鴗Leptosomus discolor	KFQ05822.1
CYP3A9	马来犀鸟Buceros rhinoceros silvestris	KFO86946.1
CYP3A9	金领娇鹟Manacus vitellinus	KFW84447.1
CYP3A9	短嘴鸦Corvus brachyrhynchos	KFO59023.1
CYP3A9	刺鹩Acanthisitta chloris	KFP82045.1
CYP3A24	双领鸻Charadrius vociferous	KGL97267.1
CYP3A37	鸵鸟Struthio camelus	BAN33784.1
CYP3A24	南非鸵鸟Struthio camelus australis	KFV75188.1
CYP3A13	小家鼠Mus musculus	NP 031845.1
CYP3A43	智人Homo sapiens	NP 476436.1
CYP3A4	普通牛Bos taurus	NP 001092837.1
CYP3A56	底鳉Fundulus heteroclitus	NP 001296866.1
CYP3A27	安大略鲑Salmo salar	ACI33861.1
CYP3A45	虹鳟鱼Oncorhynchus mykiss	AAK58569.1
CYP3A24	长牡蛎Crassostrea gigas	EKC24008.1

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2.3   CYP3192A1基因表达的性别及组织差异性

福寿螺CYP3192A1表达具有性别差异性，性别对福寿螺肝、肠、鳃和心组织中CYP3192A1表达水平具有极显著影响(P < 0.01)，而对胃及腹足中CYP3192A1表达水平无显著影响(P＞0.05)。肠组织CYP3192A1的表达量表现为雄性高于雌性，而在其他组织中CYP3192A1的表达水平均为雄性低于雌性(图 4)。

图  4  福寿螺CYP3192A1基因在雌雄各组织中的表达情况

A、B表示福寿螺组织CYP3192A1基因表达水平受性别的影响；a、b、c表示福寿螺不同组织CYP3192A1基因表达差异。

Figure  4.  Sex-dependent and tissue-dependent differences of P.canaliculata CYP3192A1 gene expression

A and B represent CYP3192A1 expression level affected by gender in different tissues; a, b and c represent tissue-dependent differences of CYP3192A1 expression in male and female individuals.

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福寿螺CYP3192A1表达具有组织差异性，且在雌、雄个体中的表达有差异。雄螺CYP3192A1在肠组织表达量最高，显著高于其他组织，而其他组织间无显著性差异；雌螺CYP3192A1在肠和鳃组织表达量最丰富，其次是肝和胃组织，心和腹足组织内表达量最低。

2.4   四聚乙醛处理对CYP3192A1基因表达的影响

分别以0.6 mg·L^-1、2.0 mg·L^-1的四聚乙醛处理雌性福寿螺24 h，RT-qPCR检测不同时刻肝、鳃、肠和胃组织的表达情况。结果如图 5所示，四聚乙醛的处理质量浓度为0.6 mg·L^-1时，肝和胃组织CYP3192A1表达量在0~6 h呈逐渐上升趋势；鳃和肠组织CYP3192A1表达量在2~6 h呈逐渐上升趋势。四聚乙醛处理质量浓度为2.0 mg·L^-1时，肝和胃组织CYP3192A1表达量与0.6 mg·L^-1时变化趋势类似，但是表达量上升时间缩短至2 h，表达量峰值降低；鳃和肠组织CYP3192A1表达量实验期间呈持续下降趋势，未检测到CYP3192A1的诱导表达。四聚乙醛诱导福寿螺CYP3192A1表达的持续时间随浓度变化在时间维度上表现出不同的趋势：低浓度诱导期更长，高浓度诱导期缩短甚至在实验时间内未检测到诱导作用。

图  5  CYP3192A1基因在不同浓度四聚乙醛诱导下各组织中表达变化

a.肝；b.鳃；c.肠；d.胃

Figure  5.  CYP3192A1 expression in different tissues of P.canaliculata exposed to various concentrations of methaldehyde

a. liver; b. gill; c. intestine; d. stomach

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3.   讨论

该研究利用在线工具对克隆基因的编码蛋白序列进行分析鉴定，在氨基酸序列中未发现明显的跨膜信号肽，表明该蛋白质不属于分泌蛋白；跨膜结构区分析结果显示CYP3192A1具有由12~34号氨基酸组成的跨膜螺旋，镶嵌于生物膜内，35~517号氨基酸位于细胞质基质内，据此推测CYP3192A1可能依赖于自身的跨膜螺旋锚定于内质网上^[1]。

细胞色素P450是一类含有亚铁血红素的超家族单加氧酶，参与多类底物的不同催化反应类型，但是不同形态的细胞色素P450具有位点特异性、立体结构特异性和底物特异性^[17-18]，引起这种特异性的结构基础归结于氨基酸和核酸序列的差异性。研究认为这种差异性是细胞色素P450超家族通过基因扩增和适应多样化而形成的，另外细胞色素P450也具有特定的保守序列^[19]。细胞色素P450结构的一般特征为C端富集螺旋状物且高度保守，N端富集β折叠物；CYPs标志性的区域为F**G***C*G基序，最保守的部分是围绕血红素的蛋白质中心，该保守中心空间上接近螺旋体I及螺旋K^[20]；CYPs的可变区通常与N端锚定、底物结合和识别有关，具有底物识别位点(SRSs)^[21]。该研究中的蛋白质序列具有Cyt_P450_ E_ grp-I(Cytochorome P450 E class group I)(IPR002401)的特征结构域，由于大多数微粒体细胞色素P450均属于此分类^[2]研究基础，推测CYP3192A1蛋白序列属于微粒体细胞色素P450酶。另外CYP3192A1蛋白序列具有细胞色素P450酶的高度保守区域，空间结构呈球形，具有血红素结合区及蛋白中心区域；N端结构变异性较大，空间上没有结构域包围，易于三维结构的变化，符合细胞色素的一般结构特征。系统发育分析显示，与福寿螺CYP3192A1同源性最高的序列是长牡蛎的CYP3A24，同源性仅为34%，并未达到同家族序列同源性所规定的40%；但GenBank数据库中与此同源性较高的其他物种CYPs序列均为CYP3A亚家族的成员，且空间结构高度保守，而研究认为细胞色素P450超家族的多样性是基因扩增进化而来的^[4]，推测福寿螺CYP3192A1基因可能是由CYP3A进化而来，其在蛋白结构上呈现高度相似性，因此CYP3192A1在结构及功能研究上可以参考CYP3A亚族基因的研究成果。研究认为CYP3A亚家族酶系是药物代谢中最重要且唯一具多个底物识别位点的CYP亚家族同工酶，其代谢底物种类繁多^[13]；目前，在人、老鼠、鱼类等多种生物体内已发现与药物代谢相关的CYP3A亚家族成员^[22-24]。因此福寿螺CYP3192A1序列结构特征的克隆与鉴定，与CYP3A亚家族结构与功能研究相互促进，为福寿螺细胞色素P450酶学特性及药物代谢研究提供重要理论基础。

细胞色素P450广泛存在于不同的生物个体中，且同种基因在不同生物、不同组织中分布具有差异性^[25]；水生动物研究显示鳃是异源物质吸收、生物转化及代谢物排泄的重要器官^[26]，消化器官因其细胞色素P450的高水平表达而作为主要的解毒器官研究^[27]，因此该实验以鳃和消化系统作为实验研究对象组织。研究认为细胞色素P450基因的表达是在体内的信号或外界异生物质的复杂而精确地调控下进行的，其表达水平除了与物种和组织有关，还应考虑其性别及其所处环境条件等情况^[19]。该研究中，性别和组织特异性对福寿螺CYP3192A1的表达水平有显著影响。整体表现为雌性表达量高于雄性，这可能与体内激素分泌相关；不同性别个体的CYPs的表达量不同，并且特定CYPs在体内的表达及其活性也存在性别差异性^[28-29]；而在组织间，表现为表达量最丰富的组织是肠和鳃，肝和胃次之，在心和腹足中表达最少。这与常见水生动物组织特异性研究有相似之处，但也有诸多差异性；如异育银鲫(Carassius auratus gibelio)CYP3A亚家族基因在肝和肠组织中转录水平最高，在肾和鳃中次之，在其余组织较低^[30]。

检测代谢酶系的cDNA表达水平是研究化合物对CYPs的抑制或诱导效应的常用方法之一^[31]。为了解福寿螺CYPs表达水平与四聚乙醛处理的相关性，文章在四聚乙醛对福寿螺急性攻毒实验的基础上，参考韩文素等^[32]的实验方法选取不同倍数LC₅₀的亚致死浓度的四聚乙醛处理福寿螺，检测了四聚乙醛处理后CYP3192A1基因表达的变化。研究认为胁迫环境下福寿螺几乎不活动，新陈代谢维持在很低水平^[33]，而该实验结果显示在福寿螺受到四聚乙醛胁迫后活力下降的同时，不同组织均出现了CYP3192A1表达量一定时期内升高的现象，说明四聚乙醛能增强福寿螺组织CYP3192A1的表达，总体表现为“低浓度诱导，高浓度缩短诱导期”；另外，随着四聚乙醛浓度的升高，福寿螺CYP3192A1表达水平也发生显著的变化，证明了四聚乙醛处理与福寿螺CYP3192A1表达量变化具有密切相关性。可能由于四聚乙醛在福寿螺体内存在药物的“首过效应”^[34]，最新接触到药物的组织对药物存在吸收和稀释作用，鳃和肠诱导期更早出现；最后所有组织CYP3192A1表达量均表现为持续下降的趋势，可能是由于福寿螺自身解毒系统并不能完全消除四聚乙醛的毒害作用，机体生命活动状态趋向衰竭，高浓度四聚乙醛能够增强四聚乙醛作用效果。

总体来说四聚乙醛能够诱导福寿螺组织内CYP3192A1表达水平的增加，研究认为由表达增加或活力增强等引起的代谢酶酶活性增加一般会促使药物代谢增加^[35]，因此CYP3192A1在药物胁迫下的诱导表达可能在增强四聚乙醛代谢中起到作用，然而这需要对四聚乙醛在福寿螺体内代谢途径及CYP3192A1底物特异性进行深入研究验证。