嗜水气单胞菌与温和气单胞菌的LAMP检测方法的建立

李嘉彬, 马艳平, 柯浩, 郝乐, 刘振兴, 马江耀, 梁志凌, 李玉谷

李嘉彬, 马艳平, 柯浩, 郝乐, 刘振兴, 马江耀, 梁志凌, 李玉谷. 嗜水气单胞菌与温和气单胞菌的LAMP检测方法的建立[J]. 南方水产科学, 2014, 10(5): 8-16. DOI: 10.3969/j.issn.2095-0780.2014.05.002
引用本文: 李嘉彬, 马艳平, 柯浩, 郝乐, 刘振兴, 马江耀, 梁志凌, 李玉谷. 嗜水气单胞菌与温和气单胞菌的LAMP检测方法的建立[J]. 南方水产科学, 2014, 10(5): 8-16. DOI: 10.3969/j.issn.2095-0780.2014.05.002
LI Jiabin, MA Yanping, KE Hao, HAO Le, LIU Zhenxing, MA Jiangyao, LIANG Zhiling, LI Yugu. Loop-mediated isothermal amplification for detection of Aeromonas hydrophila and A.sobria[J]. South China Fisheries Science, 2014, 10(5): 8-16. DOI: 10.3969/j.issn.2095-0780.2014.05.002
Citation: LI Jiabin, MA Yanping, KE Hao, HAO Le, LIU Zhenxing, MA Jiangyao, LIANG Zhiling, LI Yugu. Loop-mediated isothermal amplification for detection of Aeromonas hydrophila and A.sobria[J]. South China Fisheries Science, 2014, 10(5): 8-16. DOI: 10.3969/j.issn.2095-0780.2014.05.002

嗜水气单胞菌与温和气单胞菌的LAMP检测方法的建立

基金项目: 

广东省科技攻关项目 2010B020307003

广东省海洋渔业科技推广专项 A201201C01

详细信息
    作者简介:

    李嘉彬(1987-),男,硕士研究生,从事鱼类病害与免疫学研究。E-mail: bigben.e071@163.com

    通讯作者:

    柯浩(1965-),男,硕士,研究员,从事鱼类病害与免疫学研究。E-mail: keha@tom.com

    李玉谷(1963-),男,博士,教授,从事动物组织与胚胎学研究。E-mail: liyugu@scau.edu.cn

  • 中图分类号: S941.4

Loop-mediated isothermal amplification for detection of Aeromonas hydrophila and A.sobria

  • 摘要:

    利用环介导等温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)分别建立嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila,AH)与温和气单胞菌(A.sobria,AS)的快速检测方法。针对嗜水气单胞菌pilin基因、温和气单胞菌zipA基因设计特异性LAMP引物。在恒温条件下利用实时浊度仪对2组引物进行特异性和灵敏度试验,并以琼脂糖凝胶电泳和核酸染料颜色变化对扩增结果进行判定。结果显示,LAMP实时浊度法能够特异地检测嗜水气单胞菌和温和气单胞菌,最低检出限分别为46 fg·mL-1和320 fg·mL-1,是普通PCR方法的104倍和102倍;并能应用于已知临床样品检测。该研究建立的嗜水气单胞菌与温和气单胞菌LAMP快速检测方法具有高效、特异、灵敏的特点。

    Abstract:

    The study established a loop-mediated isothermal amplification (LAMP) technology for Aeromonas hydrophila and A.sobria. We designed the primers based on the sequences of the pilin gene of A.hydrophila and the zipA gene of A.sobria, respectively, and conducted specificity and sensitivity tests by real-time turbidimeter under isothermal conditions, which were detected by agarose gel electrophoresis test and change of SYBR Green I colour. The results show that the LAMP method was effective for rapid detection of A.hydrophila and A.sobria with limit of detections of 46 fg·mL-1 and 320 fg·mL-1, 104 and 102 times more sensitive than the conventional PCR, respectively. In conclusion, the LAMP detective method for A.hydrophila and A.sobria which we established was specific, sensitive, effective and rapid.

  • 中华白海豚(Sousa chinensis)是国家一级重点保护野生动物[1],也在国际濒危野生动植物国际贸易公约的保护名录内[2],并于2008年被世界自然保护联盟濒危物种红色名录定为“近危(NT)”级别[3]。主要分布于西太平洋和印度洋的沿岸水域,归为暖水性种类[4-6],在中国黄海至南海海域均有分布[7-15]。国内外学者对中华白海豚的保护、分布、栖息环境、重金属污染、遗传结构、声音、解剖学、饵料与食物以及人类活动对其影响等方面已有不少系统的研究,并总结出Sousa属至少有中华白海豚、铅色白海豚 (S.plumbea) 和大西洋白海豚 (S.teuszii) 3个种[16],但是国内外关于中华白海豚骨骼方面的研究甚少见到。中华白海豚骨骼全标本的首次详细描述由Flower[17]在1870年完成。Jefferson[18]对中华白海豚的头骨进行分析,结果表明可能仅分为东印度太平洋、西印度洋和西非太平洋3类。李莉好等[19]对其特定基因序列进行分析,显示中国的中华白海豚与其他国家的有所不同。中国关于中华白海豚骨骼的详细测量和比较研究始于1996年,王丕烈和韩家波[20]通过对不同地区多个标本进行对比研究,发现标本之间的差异不明显。

    刘文华等[21-23]对厦门港中华白海豚标本的颅骨、耳骨、舌骨、牙齿、年龄、脊柱、肋骨、胸骨、肢带骨进行了详尽描述。黄海北部、珠江口等地的中华白海豚标本也有此类关于骨骼的描述[24-25]。由于标本稀缺等原因,以上研究仅是描述,没有严谨的统计分析和计算。关于中华白海豚脊椎骨的尺寸变化及其与质量的关系研究,目前仅见李娜等[26]对珠江口的1副雌性成年中华白海豚骨骼进行的全面测量和统计分析,得到椎体质量和长度的关系。

    本文研究对象是2009年2月在广东阳江闸坡海边搁浅死亡的1副中华白海豚标本,对其骨骼数据进行了全面测量和相关统计分析,可用于推算中华白海豚的生长曲线,并为建立以骨骼为基础的中华白海豚生长特征函数奠定理论基础。

    本研究对象为来自于2009年2月在广东阳江闸坡海边搁浅死亡的一头成年中华白海豚,体长2.77 m,体质量242 kg。缺失数据视为无效数据,不进行统计计算。

    测量方法按照常用的形态学指标进行。各部位的测量由测量、核对数据和记录的3人同时完成。利用不锈钢卷尺和游标卡尺进行测量,不锈钢卷尺规格为0~2 m,精度为1 mm,游标卡尺为三量品牌的111-103型号,规格为0~300 mm,分辨率为0.01 mm。用Excel 2016和SPSS 19.0软件对测量所得的有效数据进行统计分析,用Excel 2016做散点图分布,然后添加趋势线,并通过R2的大小决定函数方程。通过SPSS 19.0软件中的图标构建程序选项,做各椎体数据的散点分布图,以观测分布趋势[26-27]

    颈椎共7枚(图1-a)。详细测量数据见表1。前2枚椎体完全愈合,比其他椎体明显大,愈合的棘突较粗大;第3~第5枚椎体最薄;第6~第7枚椎体略增厚;第3~第7枚的棘突都很小,并依次增高;第3、第4枚椎体的横突形成中间有空环的薄片;第5~第7枚椎体的横突上下分离,分离趋势依次明显;第7枚椎体下横突突然消失。椎体高/长、椎体宽/长以及带棘突高/长的值均呈现先增后减的趋势,带横突宽/长以及带横突宽/宽的值呈现先增后减再增的趋势,带棘突高/高的值呈现先减后增的趋势。

    表  1  颈椎测量
    Table  1.  Cervical vertebra measurement
    项目
    item
    颈椎 cervical vertebra
    C1~C2 C3 C4 C5 C6 C7
    高/mm height 48 41 42 42 41 37
    宽/mm width 108 42 38 38 39 45
    长/mm length 34 11 9 9 10 12
    带棘突高/mm height with spine 116 79 80 86 99 89
    带横突宽/mm width with spine 155 70 57 55 68 107
    质量/g mass 131.2 14.1 13.0 13.3 19.1 21.2
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    图  1  中华白海豚的颈椎、胸椎、腰椎、尾椎和V型骨
    a. 颈椎;b. 胸椎;c. 腰椎;d. 尾椎;e. V型骨
    Figure  1.  Cervical vertebra, thoracic vertebra, lumbar vertebra and caudal vertebra of S.chinensis
    a. cervical vertebra; b. thoracic vertebra; c. lumbar vertebra; d. caudal vertebra; e. V type skeleton

    胸椎共12枚(图1-b), 与12对肋骨相对应。胸椎各椎体测量资料见表2。椎体高度小于椎体宽度,二者变化幅度不明显,呈现随机变化。胸椎的椎体长度向尾部方向逐渐变大(图2)。棘突显著,均向尾侧倾斜。椎体高/长、椎体宽/长以及带棘突高/长的值均呈现先减后增的趋势。椎体高/长和椎体宽/长的比值变化范围分别为1.65~0.91和2.2~0.98,呈现逐渐变小到1左右并保持稳定的变化趋势。胸椎的椎体质量与椎体高度之间有明显的二次函数关系(R2=0.919 2),胸椎质量与椎体长之间也有明显的二次函数关系(R2=0.840 5),反映出胸椎生长所遵循的规律(表3)。

    表  2  胸椎测量
    Table  2.  Thoracic vertebra measurement
    项目
    item
    胸椎 thoracic vertebra
    T1 T2 T3 T4 T5 T6 T7 T8 T9 T10 T11 T12
    高/mm height 33 32 33 31 33 35 35 38 37 38 39 40
    宽/mm width 44 42 40 39 38 37 39 39 38 42 43 43
    长/mm length 20 27 33 36 39 41 43 44 44 44 44 44
    带棘突高/mm height with spine 118 126 130 131 134 137 143 149 146 153 156 160
    带横突宽/mm width with spine 108 104 101 97 91 104 116 134 127 142 159 186
    质量/g mass 42.8 46.2 48.2 49.8 55.5 58.2 59.2 76.1 75.0 83.1 83.1 84.7
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    表  3  函数关系
    Table  3.  Functional relationship
    变量
    variable
    函数关系
    functional relationship
    R2 函数方程
    functional equation
    胸椎质量与椎体高 thoracic vertebra mass and height 二次函数 0.919 2 y=0.219 1x2–10.509x+159.49
    胸椎质量与椎体长 thoracic vertebra mass and length 二次函数 0.840 5 y=0.123 3x2– 6.612 1x+128.99
    尾椎质量与椎体高 caudal vertebra mass and height 幂函数 0.955 0 y=0.001 3 x2.764 2
    尾椎质量与椎体长 caudal vertebra mass and length 幂函数 0.928 6 y=0.004 4 x2.490 8
    尾椎质量与椎体宽 caudal vertebra mass and width 幂函数 0.866 4 y=5E–09 x5.951 6
    V型骨质量与最大高 V type skeleton mass and max height 幂函数 0.950 3 y=0.472 x0.637 3
    V型骨质量与最大厚 V type skeleton mass and max thickness 幂函数 0.917 4 y=0.820 3 x0.728 6
    V型骨质量与最大宽 V type skeleton mass and max width 幂函数 0.890 0 y=0.196 x0.908 9
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    图  2  胸椎测量
    Figure  2.  Thoracic vertebra measurement

    腰椎共11枚(图1-c)。腰椎各椎体测量数据见表4。腰椎椎体变化不明显(图3)。前3枚椎体宽度大于椎体高度,第4~第11枚椎体宽度小于椎体高度。棘突和横突都比较大,腰椎椎体略长于胸椎。横突呈长板状平伸。棘突从第1~第6枚依次增高,第6枚最高,第7~第11枚高度又逐渐减小,这些都符合海豚的流线型身体曲线。椎体高/长的值变化幅度为0.93~1.16~1.09,呈先增后减的变化趋势。带棘突高/高的值变化幅度为4.13~3.00,呈现逐渐减小的趋势。

    表  4  腰椎测量
    Table  4.  Lumbar vertebra measurement
    项目
    item
    腰椎 lumbar vertebra
    L1 L2 L3 L4 L5 L6 L7 L8 L9 L10 L11
    高/mm height 40 43 45 47 48 51 50 48 50 52 50
    宽/mm width 41 43 47 42 45 44 44 46 47 48 48
    长/mm length 43 43 45 43 43 44 44 44 45 46 46
    带棘突高/mm height with spine 165 168 166 170 177 177 172 169 163 159 150
    带横突宽/mm width with spine 227 232 221 227 227 225 217 212 207 199 196
    质量/g mass 82.5 86.3 85.2 84.0 88.3 88.6 83.5 82.2 86.6 85.8 85.4
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    图  3  腰椎测量
    Figure  3.  Lumbar vertebra measurement

    尾椎共21枚,第1枚缺失(图1-d)。详细测量数据见表5。第2~第12枚椎体较粗大,从第13枚椎体向后逐渐变小。棘突和横突均由前至后逐渐消失,从第13枚椎体开始棘突消失,从第10枚椎体开始横突消失。椎体质量与椎体高度之间为幂函数关系(R2=0.955 0),幂函数关系也能很好地拟合椎体质量与椎体长度、椎体宽度之间的关系(R2=0.928 6,R2=0.0.866 4),反映出尾椎生长所遵循的规律(表3)。

    表  5  尾椎测量
    Table  5.  Caudal vertebra measurement
    尾椎
    coccygeal vertebra
    高/mm
    height
    宽/mm
    width
    长/mm
    length
    质量/g
    mass
    Ca1
    Ca2 50 48 47 90.8
    Ca3 48 48 48 92.9
    Ca4 51 48 48 99.1
    Ca5 52 50 48 91.5
    Ca6 51 50 49 81.3
    Ca7 50 51 51 77.8
    Ca8 50 50 53 71.5
    Ca9 51 48 53 62.7
    Ca10 54 48 52 53.9
    Ca11 53 45 52 50.0
    Ca12 49 42 46 39.5
    Ca13 44 39 30 22.5
    Ca14 31 40 18 11.2
    Ca15 25 40 16 8.0
    Ca16 21 40 15 7.0
    Ca17 18 40 15 5.1
    Ca18 16 35 15 3.3
    Ca19 14 29 14 2.0
    Ca20 12 23 14 1.5
    Ca21 11 21 9 0.6
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    V型骨共15枚(图1-e)。测量数据见表6。位于第1~第14尾椎下面,形状大小不一。其最大高度、最大厚度和V口外宽度均是先变大后变小,最大高度变化最明显,V口外宽度变化最缓慢(图4)。第1和第2枚椎体退化成骨片。幂函数关系能很好地拟合椎体质量与最大高度、最大厚度、最大宽度之间的关系(R2=0.950 3,R2=0.917 4,R2=0.89,表3)。

    表  6  V型骨测量
    Table  6.  V type skeleton measurement
    V型骨
    V type skeleton
    最大高/mm
    max height
    最大宽/mm
    max width
    最大厚/mm
    max thickness
    V口外宽度/mm
    V mouth outer width
    V口高度/mm
    V mouth height
    质量/g
    mass
    V1 1.7 3.6 0.8 0.8
    V2 1.3 3.7 0.6 0.5
    V3 48 44 10 26 20 5.6
    V4 64 35 12 26 20 5.1
    V5 64 39 16 27 18 7.0
    V6 62 40 17 27 15 7.5
    V7 63 42 18 29 15 9.0
    V8 57 47 16 27 16 7.8
    V9 44 43 15 24 16 5.3
    V10 40 43 17 23 13 4.1
    V11 35 41 13 22 11 3.2
    V12 2.1
    V13 2.5
    V14 1.0
    V15 0.3
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    图  4  V型骨测量
    Figure  4.  V type bone measurement

    中国关于中华白海豚骨骼的最早记录开始于新中国成立前,至今已有近70年历史,有文字记录的骨骼标本约有39副[15](表7),分别为广西5副、广东6副、珠江4副(1副丢失)、福建15副(2副丢失)、浙江1副、长江2副、香港5副、黄海1副。其中王丕烈和韩家波[20]对复旦大学(合浦)、复旦大学♀、8063号、L9101、L9301、L9302、L9001、L8201、L8501和上博♂共10副骨骼的脊椎数进行了统计,均与中华白海豚标准脊椎式相符合。同时对L9302和上博♂2副骨骼的脊椎数据进行了详细测量和记录。

    表  7  骨骼标本
    Table  7.  Bone specimen
    地区
    area
    时间
    time
    地点
    location
    标本号
    number
    性别
    gender
    年龄
    age
    存放位置
    store location
    广西 Guangxi 1976 合浦县 雌性 成体 复旦大学生物系
    1980 北海市 8063 雌性 成体 北海市水产馆
    1982 北海市 L8201 雌性 成体 辽宁省海洋水产研究所
    1985 北海市 L8501 幼体 辽宁省海洋水产研究所
    1988 北海市 L8801
    广东 Guangdong 1990 肇庆 L9101 雄性 成体 辽宁省海洋水产研究所
    1990 上川岛 L9001 雌性 辽宁省海洋水产研究所
    1993 蛇口 L9302 雌性 成体 辽宁省海洋水产研究所
    1993 花县 L9301 雄性 成体 辽宁省海洋水产研究所
    1995 内伶仃 雄性 幼体
    1996 内伶仃 幼体 南海海洋研究所
    珠江 Pearl River 50年代 黄埔港 广州市文化公园 (已丢失)
    1990 德庆 雄性 成体 辽宁省海洋水产研究所
    1992 横山河 雌性 成体 (怀1胎儿) 中国水产科学研究院
    2014 珠江 雌性 成体 珠江口中华白海豚保护区
    福建 Fujian 新中国成立前 2具骨骼 厦门大学生物系 (已丢失)
    1978 九龙江 复旦大学♀ 雌性 成体 复旦大学生物系
    1979 连江 福博2830 雄性 福建省博物馆
    1997—1998 厦门 S1-S11 均有 5个成体,6个幼体
    浙江 Zhejiang 1995 乐清县 雌性 成体 浙江自然博物馆
    长江 Yangtze River 1982 横沙岛 上博♂ 雄性 成体 上海自然博物馆
    1987 江苏 雌性 成体 南京师范大学生物系
    香港 Hong Kong OPC1等 5个成体
    黄海 Yellow Sea 2003 辽宁 雌性 成体 大连圣亚海洋世界
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    本标本的脊椎式为C7+T12+L11+Ca21=51,与标准脊椎式(C7+T12~13+L9~11+Ca21~24= 50~53) 相符合。但与已知的标本模式都不相同,本种模式比较少见,多数标本腰椎为10枚,仅有上川岛L9001标本与本文标本的腰椎为11枚,虽然不同个体之间的脊椎模式有所不同,但是脊椎由前向后的变化趋势是相似的,均呈现流线型。黄海北部发现的中华白海豚骨骼的第8、第10腰椎的棘突出现了分叉[24],本标本未出现上述情况。

    在颈椎、胸椎和腰椎中,棘突都比较大,可能扮演着保护椎体的重要作用。第7枚颈椎椎体下横突突然消失,这与L9301号标本一致。第1枚尾椎椎体的底部后侧形成两突,与第1、第2枚退化成骨片的V型骨相关节;第2枚椎体起该底部两突逐渐增大;第7~第14枚椎体,其底部前后形成纵凹槽,与V型骨相关节。

    已知标本V型骨有12~14枚,而本标本V型骨共15枚,与广东珠江口中华白海豚国家级自然保护区管理局收藏的标本一致。本标本V1和V2退化成骨片,这与九龙标本、上述珠江口标本和北海L8201标本一致。

    通过对脊椎骨数据的测量分析,对中华白海豚的骨骼特征有了比较详细的了解。本标本颈椎带棘突高/长的值变化幅度约是椎体高/长的2倍,与李娜等[26]的测定结果一致。二次函数可很好地拟合胸椎质量与椎体长度、椎体高度之间关系,李娜等[26]的测定结果也为二次函数关系,故推测二次函数比其他函数更容易推算腰椎的生长规律。由尾椎质量与椎体高度、椎体长度、椎体宽度之间的幂函数关系可以判断:其生长过程更倾向于等速生长[28]。这与李娜等[26]测定结果相比,尾椎质量与椎体高度、椎体长度之间关系均为幂函数关系,但尾椎质量与椎体宽度之间的关系却为不同函数,具有个别性。V型骨质量与最大高度、最大宽度、最大厚度之间亦存在明显的幂函数关系,反映出V型骨各椎体生长的规律。本研究结果为今后建立以骨骼为基础的中华白海豚生长特征函数奠定了基础。Weir和Wang[29]通过对中国台湾地区、塞内加尔和安哥拉地区的印度太平洋白海豚和大西洋白海豚的照片资料进行研究,首次记录了白海豚的脊柱骨存在明显异常(前凸、后凸或脊柱侧凸),发现白海豚的脊椎骨异常通常出现在腰尾椎区域,但大西洋白海豚的脊椎骨在颈胸椎区域存在异常。该标本与李娜等[26]测定标本的脊椎骨均不存在明显异常。Weir和Wang的研究结果来源于照片资料,未能在骨骼形态和数据方面作进一步补充说明,这也为中华白海豚的研究指明了新方向。

    综上,本标本骨骼虽然有些特征保留了哺乳纲动物的特点(如7枚颈椎等),但其尾椎为了适应水生生活已发生很多改变。中国海域的中华白海豚不作远距离洄游,其生活活动范围都比较稳定,属不同种群。本研究所得数据仅涉及生活在广东沿岸的种群,而关于其他水域中华白海豚的骨骼系统是否也具有明显的函数关系,以及不同种群生长特征函数的地理差异有待于深入探究。鉴于中华白海豚标本获取非常困难,且本研究所得结果具有个别性,因此还需要长期积累获取更多的中华白海豚骨骼数据,才能得出更为全面、系统的中华白海豚生长特征函数。

  • 图  1   LAMP环引物的加速试验

    a. 未加环引物的嗜水气单胞菌LAMP反应;b. 加入环引物的嗜水气单胞菌LAMP反应;c. 未加环引物的温和气单胞菌LAMP反应;d. 加入环引物的温和气单胞菌LAMP反应

    Figure  1.   Influence of loop-primers for LAMP reaction process

    a. AH LAMP reaction without loop primers; b. AH LAMP reaction with loop primers; c. AS LAMP reaction without loop primers; d. AS LAMP reaction with loop primers

    图  2   LAMP特异性试验

    a. 嗜水气单胞菌引物LAMP特异性试验;b. 温和气单胞菌引物LAMP特异性试验
    1. 阴性对照;2a. 嗜水气单胞菌;2b. 温和气单胞菌;3a. 温和气单胞菌;3b.嗜水气单胞菌;4. 维氏气单胞菌;5. 豚鼠气单胞菌;6. 大肠埃希氏菌;7. 迟缓爱德华氏菌;8. 无乳链球菌;9. 海豚链球菌;10. 金黄色葡萄球菌;11. 霍乱弧菌;12. 蜡样芽胞杆菌;13. 痢疾志贺氏菌;14. 肺炎克雷伯杆菌;15. 铜绿假单胞菌;16. 弗氏柠檬酸杆菌;17. 摩氏摩根菌

    Figure  2.   Specificity test of LAMP

    a. specificity test of A.hydrophila; b. specificity test of A.sobria
    1. negative control; 2a.A.hydrophila; 2b. A.sobria; 3a.A.sobria; 3b.A.hydrophila; 4. A.veronii; 5. A.caviae; 6. E.coli; 7. E.tarda; 8. S.agalactiae; 9. S.iniae; 10. S.aureus; 11. V.cholerae; 12. B.cereus; 13. S.dysenteriae; 14. K.pneumoniae; 15. P.aeruginosa; 16. C.frenudii; 17. M.morganii

    图  3   质粒酶切鉴定

    a. pilin质粒酶切鉴定;b. zipA质粒酶切鉴定

    Figure  3.   Restriction enzyme analysis of plasmid

    a. restriction enzyme analysis of pilin plasmid; b. restriction enzyme analysis of zipA plasmid

    图  4   LAMP和PCR灵敏度灵敏度试验

    a~b. 嗜水气单胞菌LAMP灵敏度试验;c. 嗜水气单胞菌LAMP灵敏度凝胶电泳图;d. 嗜水气单胞菌PCR灵敏度凝胶电泳图;e~f. 温和气单胞菌LAMP灵敏度试验;g. 温和气单胞菌LAMP灵敏度凝胶电泳图;h. 温和气单胞菌PCR灵敏度凝胶电泳图

    Figure  4.   Sensitivity test of LAMP and PCR

    a~b. sensitivity test of A.hydrophila; c. sensitivity test of agarose gel electrophoresis of LAMP of A.hydrophila; d. sensitivity test of agarose gel electrophoresis of PCR of A.hydrophila; e~f. sensitivity test of A.sobria; g. sensitivity test of agarose gel electrophoresis of LAMP of A.sobria; h. sensitivity test of agarose gel electrophoresis of PCR of A.sobria

    图  5   嗜水气单胞菌的pilin引物、温和气单胞菌的zipA引物检测已知的临床样品

    a. 实时浊度图(AH);b. 核酸染料图(AH);c. 实时浊度图(AS);d. 核酸染料图(AS);1.阴性对照;2.嗜水气单胞菌(KQ2010522);3.嗜水气单胞菌(BF20120816);4.嗜水气单胞菌(DSN20121018);6.嗜水气单胞菌(NH130605)

    Figure  5.   Results of AH samples by the detection of real-time turbidmeter and SYBR GreenⅠ

    a. detection of real-time turbidmeter (A.hydrophila); b. detection of SYBR GreenⅠ(A.hydrophila); c. detection of real-time turbidmeter (A.sobria); d. detection of SYBR GreenⅠ(A.sobria); 1.negative control; 2.A.hydrophila(KQ2010522);3.A.hydrophila (BF20120816);4.A.hydrophila(SK20120912);5.A.hydrophila(DSN20121018);6.A.hydrophila(NH130605)

    表  1   嗜水气单胞、温和气单胞LAMP引物序列

    Table  1   LAMP primers sequences of A.hydrophila and A.sobria

    引物名称
    primer
    引物序列(5′→ 3′)
    sequence
    AH-B3 TGTCGGCTCATGTCAGTA
    AH-F3 CAATGGCAGTCTGATCTCC
    AH-BIP CGCTGCAATTGATGGTGAGCAGTTTGATATCCCGCTGC
    AH-FIP CTGACCTGACTGCTTGGCAGCGACGATACCGTAGAGA
    AH-LB GGCACTGACGCTGAATCT
    AH-LF GGAGCCTGAACGTCATGG
    AS-B3 AAGCTCTGGCAGAGGCTC
    AS-F3 CGGACGAATGGACTCGAA
    AS-BIP GAAGACGAGGAAGAGGATCTGCAATTCGTCTTCCTGATAGACAG
    AS-FIP AACGCAGGAGTGGCACGATTTGACAGCGATGGCATC
    AS-LB CACTTCGCAAGCCTGCTG
    AS-LF AGCGAGTTCCGGCTCTTC
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出版历程
  • 收稿日期:  2014-03-24
  • 修回日期:  2014-04-23
  • 刊出日期:  2014-10-04

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