流式细胞术是20世纪70年代发展起来的一种自动分析技术，可以对如动植物细胞、细菌、病毒等生物体及其DNA、蛋白质等进行多参数快速分析和分选。流式细胞仪（flow cytometer，FCM）是以流式细胞术为核心，集光学、电子学、计算机技术、激光技术、流体力学、细胞化学、生物学等多学科知识和技术于一体的先进科学技术设备^[1-2]，主要由液流系统、光学检测系统、电子控制系统、数据存储与分析系统4部分构成。其工作原理是：细胞悬液经过特异性荧光抗体染色后，在一定压力下进入充满鞘液的流动室，鞘液带着细胞呈单行通过喷嘴中心形成细胞液柱。液柱与聚焦的激光束垂直相交，细胞受到激光激发产生散射光，分为前向散射光（forward scatter，FSC）和侧向散射光（side scatter，SSC）。同时细胞所携带的荧光物质被激光激发，发射出荧光，被聚光器收集。双色反光镜将不同颜色的荧光转向不同的光电倍增管检测器，将荧光信号转化为电信号。散射光和荧光信号被放大后经数据化处理输入电脑存储并进行分析^[3]。与其他的细胞分析技术相比，流式细胞术具有测量速度快、灵敏度高、变异系数小、可多参数测量、操作简便等优势^[4]，因此在微生物学^[5-7]、免疫学和肿瘤学^[8-10]、生物学^[11-13]、畜牧养殖^[14-15]等学科领域中得到广泛应用。

流式细胞仪最初和最成功的应用之一就是检测DNA含量及细胞周期。真核生物体细胞的染色体数目及DNA含量基本上是恒定不变的，其染色体和DNA含量可以作为该物种的一个特性参数^[16]，因此研究生物DNA含量成为了研究物种间差别的一种重要方法，可为种质鉴定提供依据，丰富物种细胞遗传学数据^[17]。目前，由于水资源短缺及水产养殖的需要，希望能够获得在生长速度、抗逆能力、免疫水平等方面具有优势的品种，鱼类遗传育种已成为研究热点^[18]。流式细胞仪因为能够快速分析大批量样品，及时获得细胞含量、倍性及相关参数的检测结果，成为研究采用的主要技术手段^[19-20]。方礼豹等^[21]曾基于流式细胞术检测了天然二倍体、四倍体泥鳅（Misgurnus anguillicaudatus）和大鳞副泥鳅（Paramisgurnus dabryanus）的杂交与自交子代的相对DNA含量，为泥鳅的良种选育提供了科学依据。REYES-BECERRIL等^[22]利用流式细胞仪检测了细胞受副溶血性弧菌（Vibrio parahaemolyticus）刺激后的非特异性免疫参数，为加利福尼亚湾石首鱼（Totoaba macdonaldi）水产养殖中的健康调控提供了基础数据。特别是当前，随着基因组学研究方法和技术水平的提升，鱼类基因组测定工作正逐步展开，在已发表的30种鱼类的基因组中，包括重要的水产养殖品种草鱼（Ctenopharyngodon idellus）^[23]、鲤（Cyprinus carpio）^[24]、大黄鱼（Larimichthys crocea）^[25]和半滑舌鳎（Cynoglossus semilaevis）^[26]等。基因组数据的获得，能够对特定养殖鱼类的食性特征、生长优势和免疫机能在分子水平进行阐明，进而在水产养殖方法、免疫能力提升及品种繁育上取得进展。而流式细胞分析能够较为快速、准确地测定细胞倍性和基因组大小，据动物基因组大小数据库（http://www.genomesize.com）统计，目前已通过流式细胞术测定了超过400种鱼类的基因组大小，这些研究成果为鱼类基因组学发展提供了重要的数据支持。

目前的流式细胞研究中使用的实验材料多为鱼类血液和生殖细胞（或胚胎），可直接制成单细胞悬液，虽然取样方法对样品的损伤相对较小，具有处理操作简单，测量结果较可靠的优点^[27-28]，但生殖细胞的产生具有一定的周期性，用作实验材料在时间上相对受限，而当研究对象个体较小或物种特殊时，采集其血液比较困难，即使对个体进行解剖也难以分辨不同内脏，无法找到合适的组织作为替代直接制作单细胞悬液。因此，该研究拟选用鱼类的不同组织进行流式分析，比较不同组织的流式结果图，通过对DNA含量和细胞周期时相的测算确定更加科学的实验材料和处理方法，以期找到在流式细胞术中能够替代血液和生殖细胞的组织，便于更好地开展鱼类遗传育种及保护利用研究。

1.   材料与方法

1.1   材料

草鱼、鲫（Carassius auratus）、团头鲂（Megalobrama amblycephala）、鲤、大鳞副泥鳅样品均采自北京清河镇农副产品交易市场中心，每种鱼采样3~5尾作为重复，所有样品均保持个体鲜活带回实验室处理。斑马鱼（Danio rerio）样品取自中国科学院动物生态与保护生物学院重点实验室，均为个体健康的实验用鱼。

1.2   样品制备

血细胞的采集和固定：断尾取血0.1~0.3 mL，加入到含有1 mL磷酸缓冲液（PBS，pH＝7.4）的离心管中，500 r·min^-1离心5 min，去除上清液，下层血细胞再用PBS洗涤1~2次，离心5 min后去除上清液，缓慢加入1.5 mL新制备的卡诺氏固定液[V（甲醇）:V(乙酸)=3:1）]，吹吸均匀后置于4 ℃冰箱保存。

组织细胞的采集和固定：用干净的剪刀和镊子分别剖取适量鱼的背部肌肉、胸鳍、鳃、肝、肾脏组织置于2 mL离心管中剪碎，用PBS洗涤1~2次后加入1 mL含0.25%胰酶的细胞消化液（Trypsin-EDTA Solution）于37 ℃条件下消化15~60 min。消化完全后加入20 μL胎牛血清终止消化反应，2 000 r·min^-1离心5 min，去除上清液，下层细胞用PBS洗涤1次，离心（2 000 r·min^-1），弃上清液，缓慢加入1 mL体积分数为70%的冰乙醇溶液，用1 mL移液枪吹吸均匀后置于4 ℃冰箱中固定24 h。

细胞染色：染色前将固定好的细胞取出离心洗涤2~3次，加入5 μL RNA酶37 ℃下水浴30 min后2 000 r·min^-1离心5 min，弃上层清液，缓慢加入0.4 mL PBS溶液并吹吸均匀。利用流式细胞仪进行检测前用300目筛网过滤细胞，向过滤液中加入5 μL碘化丙啶（PI，propidium iodide）染液，于4 ℃条件下染色0.5 h后上机检测。检测细胞DNA含量时使用斑马鱼血液作为内标定，按照V(样品):V(标定)=3:1的比例混合后过滤染色。

1.3   细胞的检测和数据分析

染色后的细胞使用流式细胞仪（BD FACSCalibur）进行检测，检测过程中采用488 nm激光照射，调整液流速度使每秒通过喷嘴的细胞数维持在100~150，依据样品检测情况设定FSC-Height等参数。检测结束后使用FlowJo 7.6软件对流式数据进行分析，结果以直方图（图 1）表示，其中纵坐标（cell count）表示检测到的细胞数量，横坐标（FL2-A）表示细胞的脉冲面积，其值可用于测算DNA含量。直方图中1个单峰表示一群DNA含量相同的细胞，不同生物体的DNA含量相对恒定，因而在流式结果图中会呈现不同的峰。文章利用斑马鱼作为内标测定相对DNA含量，计算公式为：X=A1/AD×D。其中X表示待测细胞的DNA含量，A1表示所测得的待测细胞的FL2-A值，AD表示斑马鱼细胞的FL2-A值，D表示斑马鱼细胞的DNA含量。

图  1  草鱼肝脏（A）、肾脏（B）、鳃（C）、肌肉（D）、鳍条（E）组织流式细胞检测直方图

Figure  1.  Histogram of grass carp′s liver(A), kidney(B), gill(C), muscle(D) and fin(E) detected by flow cytometer

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2.   结果与分析

2.1   草鱼不同组织流式结果分析

草鱼各组织流式细胞检测的结果见图 1。图 1-A为肝细胞，动物肝组织中细胞分裂十分旺盛，因而会存在大量的四倍体细胞，其DNA含量是正常二倍体细胞的两倍，属于肝细胞的典型特征^[29]，从图中可以明显看出在肝细胞中同时存在二倍体（FLA-2值为200）和四倍体（FL2-A值为400），并且大量细胞正处于分裂中，DNA含量不尽相同，不能形成明显的单峰，不利于正确地判定样品的DNA含量。图 1-B为肾脏细胞，因容易出现细胞粘连而导致不能得到单一的峰，无法确定DNA含量。图 1-C为鳃组织流式结果图，虽然能得到较为明显的单峰，但发现在实验操作过程极易形成细胞碎片而导致在流式细胞仪中不能得到有效检测，没有稳定的重复结果，不是合适的替代材料。图 1-D为肌肉组织流式结果图，也能得到峰形明显的图像，但从纵坐标来看细胞数量相对较少，表明肌肉组织作为实验材料不能制得细胞密度较高的单细胞悬液，并不适合作为替代。图 1-E为利用鳍条组织作为实验材料得到的流式结果图，可以看到明显的单峰，且样品细胞数量多，在重复实验中也得到了稳定的结果。因此，通过对草鱼的不同组织进行流式细胞检测，综合比较分析后认为使用鳍条组织替代血液或生殖细胞作为实验材料是一种可行方案。

2.2   不同鱼类鳍条组织流式结果分析

为进一步验证鳍条组织作为实验替代材料的稳定性，文章分别对鲫、鲤、团头鲂和大鳞副泥鳅的鳍条组织进行流式细胞检测，结果见图 2。可以看出不同鱼类的鳍条组织在实验中均能获得细胞数量足够且峰形明显的直方图，这表明利用鳍条组织作为流式细胞分析的实验材料具有稳定的可重复性，是一种可行方案。

图  2  不同鱼类鳍条组织流式细胞检测DNA含量结果图

Figure  2.  DNA content of fins in different fishes detected by flow cytometer

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2.3   鳍条组织细胞周期时相及相对DNA含量分析

由于流式细胞术的主要运用是分析细胞周期及检测细胞DNA含量，为进一步论证鳍条组织作为实验材料的科学性，对其细胞周期时相（以草鱼和鲤为例）进行了分析（图 3）。细胞增殖周期时相的改变会导致DNA含量的变化，G₀期是细胞静止期，DNA含量恒定为正常二倍体。细胞分裂周期中G₁期DNA还未开始复制，DNA含量与G₀期相同，S期内DNA含量逐渐由二倍体增加为四倍体，DNA含量介于两者之间，G₂期和M期细胞完成了DNA复制，其含量表现为四倍体^[30]。测定细胞周期能够了解细胞增殖的动态变化，一般认为不同的时相比例反映细胞处于不同的代谢阶段，例如处在G₀/G₁期时相比例低而处在S及G₂期比例较高的细胞正处于增殖旺盛期，细胞加速分裂。由图 4可以看出，不同鱼类的鳍条组织在流式细胞分析中表现出细胞周期现象，且大部分细胞停留在G₀/G₁期。

图  3  鳍条组织细胞周期时相图

Figure  3.  Phases of cell cycle in fin

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图  4  团头鲂鳍条组织相对DNA含量

Figure  4.  Relative DNA content of fin in M.amblycephala

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DNA含量（基因组大小）具有种的特征，它包含了一个物种的遗传信息，结果是相对恒定的^[16]。文章利用鱼类研究中的模式物种斑马鱼（DNA含量1.75 pg）^[31]作为内标定，测定了团头鲂鳍条组织的相对DNA含量（图 4）。采用公式X=A1/AD×D计算团头鲂鳍条组织的相对DNA含量（C值）为（1.25 ±0.07）pg。通过对细胞周期时相及相对DNA含量的分析，该研究认为利用鳍条组织作为流式细胞检测的实验材料是科学可行的。

3.   讨论

过去已有研究者基于不同标定材料和测定方法测算过团头鲂的DNA含量（表 1），与该研究中利用鳍条组织作为实验材料所测得的结果基本一致，微小差异可能由测定方法、仪器偏差及标定物的不同而导致。过去研究中多利用血液作为实验材料进行分析，而目前已有研究表明^[32]，不同组织的DNA含量存在微小差异，且血液中DNA含量较鳍条组织中高，该研究得到的结果符合此结论。

表  1  基于不同材料和方法测得的团头鲂DNA含量结果比较

Table  1.  Comparison of DNA content detected by different methods and tissues

标定物种 calibration species	实验材料 experiment tissue	DNA含量(C值)/pg DNA content（C value）	测定方法 method	与该研究相比 comparison with this study	研究者 researcher
斑马鱼(Danio rerio)	鳍条	1.25±0.07	FCM	－	该研究
鸡（Gallus domesticus）	血液	1.33±0.03	FCM	+0.08	范兆廷等[33]
人（Homo sapiens）	血液	1.17	FD	－0.08	周暾[34]
人	血液	1.2	FD	－0.05	李渝成等[35]
鸡	血液	1.33±0.01	FCM	+0.07	吴成宾等[36]
鸡	血液	1.32±0.03	FCM	+0.08	尹洪滨等[37]
注：FCM.流式细胞术；FD.显微荧光光度法 Note：FCM. flow cytometry；FD. feulgen densitometry

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血液及生殖细胞是流式细胞术中常用的实验材料，测定结果的准确性相对较高，在条件适宜的情况下应该作为首选材料，可采用挤压法取鱼类的精子（卵细胞）或利用受精卵进行实验，但需在鱼类繁殖期方可获得理想材料。鱼类个体较大时可采用静脉取血的方法获得血液，但操作复杂且需具备一定的鱼类解剖学知识，对初学者而言有一定的实际操作难度。而当鱼类个体较小时则需采取断尾取血的方法获得血液，属于损伤取样且易混入鱼类鳞片表面的分泌物，影响实验结果。

文章通过对鱼类不同组织进行流式细胞实验发现，鳍条组织在样品制备过程中难度较小，易获得数量足够的单细胞悬液，在分析中能够有明显的峰图，对不同鱼类进行的重复实验结果稳定。进一步分析发现，以鳍条组织作为实验材料能够观察到细胞周期现象，利用斑马鱼作为内标定测算出的团头鲂DNA含量也与其他研究者的结果基本吻合，表明利用鳍条组织作为流式细胞分析的替代材料能够取得良好的实验结果，可以实现流式细胞分析的主要目标。同时，鳍条组织的获取不受繁殖周期的影响，能及时地开展相关研究，对实验对象的损伤也相对较小，操作难度低，有利于流式细胞术在鱼类研究中的推广和应用。因此，综合考虑实验材料的获取、样品制备的难度及实验结果的稳定性、准确性，笔者认为，利用鳍条组织作为血液和生殖细胞替代材料进行流式细胞分析是科学可行的。

通过对实验过程的归纳，文章总结出了利用鳍条组织作为实验材料进行流式细胞分析的流程图（图 5）。值得注意的是，在利用鳍条组织进行实验时，酶解时间过短将导致无法得到足够数量的细胞进行分析，而酶解时间过长则易产生大量的细胞碎片。因此，利用胰蛋白酶对鳍条组织进行消化时需严格控制时间，通常充分机械破碎过的1 cm×1 cm的鳍条组织经40 min消化即可，消化期间每隔5 min充分震荡离心管，避免鳍条组织团聚成块。固定细胞时需使用-20 ℃预冷的乙醇溶液，可在振荡器上完成细胞固定，能有效避免细胞被乙醇溶液瞬间固定成团，进而影响通过滤网的细胞数量。固定时间需保证在18 h以上，固定后的细胞沉降速率会有一定程度的下降，因此在清洗细胞时可预先向固定细胞的乙醇溶液中加入适量的PBS后离心，以减少细胞的损失。

图  5  流式细胞分析实验鳍条组织样品制备流程图

Figure  5.  Flowchart of fin tissue sample preparation for flow cytometry experiment

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中国现存超过5 000种鱼类，而其中很大一部分鱼类的生物学研究仍存在一定空白，随着中国水产养殖行业的不断发展和鱼类基因组学研究的逐渐深入，对于鱼类生物学基础数据的需求将不断增加，流式细胞术作为一种科学技术手段正在向高灵敏、高速度、多参数测量等更加全面和便捷的方向发展，能在未来的科学研究中发挥重要作用。文章通过对鱼类不同组织的比较分析，推断并论证了鳍条组织作为流式分析实验材料的可行性，为其在鱼类生物学研究，特别是水产养殖、遗传育种及基因组学研究方面的进一步推广和应用提供了科学依据。