Antioxidation effects of polypeptides from intestines and gonads of sea cucumber (Apostichopus japonicus) by enzymatic hydrolyzation
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摘要:
刺参(Apostichopus japonicus)肠和性腺是刺参加工过程中的副产物, 为丰富其高值化利用的基础理论, 研究了刺参肠、性腺酶解过程中可溶性蛋白和氨基酸态氮质量浓度变化, 分析了酶解多肽对1, 1-二苯基苦基苯肼(DPPH·)、羟基自由基(·OH)和超氧阴离子自由基(O2-·)的体外清除效果。结果显示, 刺参肠和性腺经生物酶水解后, 水解度分别为53.63%和63.40%, 酶解液中可溶性蛋白质量浓度分别为4.62 mg·mL-1和5.01 mg·mL-1, 氨基酸态氮质量浓度分别为0.43 mg·mL-1和0.56 mg·mL-1。刺参肠和刺参性腺酶解多肽清除DPPH·的半抑制质量浓度(IC50)分别为3.31 mg·mL-1和0.88 mg·mL-1, 清除·OH的IC50分别为9.53 mg·mL-1和8.81 mg·mL-1, 清除O2-·的IC50分别为6.42 mg·mL-1和3.22 mg·mL-1。刺参肠和刺参性腺酶解多肽具有一定的体外抗氧化效果, 应用前景广阔。
Abstract:Intestine and gonad of sea cucumber (Apostichopus japonicus) are by-products during its processing process.In order to utilize them better, we analyze the changes in contents of soluble protein and amino acid nitrogen during enzymatic hydrolyzation as well as study their free radical scavenging effects against 1, 1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl radical (DPPH·), hydroxyl free radical (·OH) and superoxide anion free radical (O2-·) in vitro.Results show that the degree of hydrolysis (DH%) of intestine and gonad after enzymatic hydrolyzation are 53.63% and 63.40% respectively; the contents of soluble protein are 4.62 mg·mL-1 and 5.01 mg·mL-1, respectively; the contents of amino acid nitrogen are 0.43 mg·mL-1 and 0.56 mg·mL-1, respectively.The half maximal inhibition concentrations (IC50) of polypeptides prepared from intestine and gonad are 3.31 mg·mL-1 and 0.88 mg·mL-1 against DPPH·, respectively, 9.53 mg·mL-1 and 8.81 mg·mL-1 against ·OH, respectively, 6.42 mg·mL-1 and 3.22 mg·mL-1 against O2-·, respectively.The polypeptides from intestine and gonad of sea cucumber have remarkable antioxidation functions with good application prospects.
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Keywords:
- Apostichopus japonicus /
- intestine /
- gonad /
- enzymatic hydrolyzation /
- polypeptide /
- antioxidation activity
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马拉瓜丽体鱼(Cichlasoma managuense)俗称淡水石斑、珍珠石斑、花老虎等，属鲈形目，慈鲷科鱼类，原产于中美洲的尼加拉瓜、洪都拉斯、哥斯达黎等地的河流及湖泊中，具有生长快、耐低氧、产量高、抗病力强、易捕捞及肉质鲜美等特点，是一个颇有发展前途的优良品种[1-2]。目前，有关马拉瓜丽体鱼的研究报道主要集中在繁殖生物学、人工育苗技术和养殖技术等方面[1-6]。
BLAXEX和HEMPEL[7]在1963年首次提出了仔鱼初次摄食饥饿“不可逆点”(point of no return，PNR)的概念，并利用饥饿试验来观察仔鱼的初次摄食率变化和确定PNR。当仔鱼饥饿到达PNR时，仔鱼完全丧失了正常摄食的能力，最终导致死亡。因此，也被称作“生态死亡”[8]。PNR是反映仔鱼饥饿耐力的主要指标之一，对鱼类人工繁育具有重要的参考价值。近年来，国内外学者对多种仔鱼的PNR和饥饿耐力进行研究[8-10]，但有关马拉瓜丽体鱼仔鱼的PNR和饥饿耐力尚未见报道。该试验对马拉瓜丽体鱼仔鱼进行饥饿试验以确定其PNR，并研究延迟投饵对其成活率和生长的影响，以期为人工育苗生产提供科学依据。
1. 材料与方法
1.1 材料
试验于2011年8月在三亚市南繁科学技术研究院实验室中进行。试验仔鱼由海南卓林农业开发有限公司天涯湖养殖基地提供的2龄亲鱼自然产卵孵化获得。试验用具为显微镜、解剖镜、解剖工具、烧杯及游标卡尺等；试验用水为经曝气、过滤的自来水，水温为27~29 ℃，溶解氧质量浓度在5 mg · L-1以上；pH 6.8，光照为室内自然光。
1.2 方法
1.2.1 初次摄食率变化及PNR的确定试验
仔鱼孵化后，分别将500尾初孵仔鱼放入2个规格为30 cm×25 cm×25 cm的玻璃水族箱中，微充气，并每天换等温水体1/3。1#玻璃水族箱从仔鱼开口当天起用卤虫(Artemia salina)无节幼体进行投喂，每天观察仔鱼的生长发育情况，并随机测量10尾仔鱼的全长、卵黄囊长径和短径，然后计算卵黄囊体积。$\text { 卵黄囊体积 }=4 / 3 \cdot \pi \cdot(r / 2)^2 \cdot R / 2$，r为卵黄囊短径，R为卵黄囊长径。2#玻璃水族箱仔鱼不投喂生物饵料。从仔鱼开口的第1天开始，每天从2#玻璃水族箱随机取出20尾，放入有效水体为800 mL的1 000 L烧杯中，微充气，用卤虫无节幼体进行投喂，2 h后用5%福尔马林杀死仔鱼，在解剖镜下逐尾检查其摄食情况，并计算初次摄食率。摄食率=肠道内含有卤虫的仔鱼数量/被测定的仔鱼数量×100%。马拉瓜丽体鱼仔鱼PNR的确定参照殷名称[8]的方法。
1.2.2 延迟投饵对仔鱼成活率的影响试验
试验共分为9组，每组设2个平行。在每个8 L的塑料桶中放入100尾仔鱼。仔鱼在出膜后的第4天开始开口摄食，试验组仔鱼分别于开口后的0(当天)、第1、第2、第3、第4、第5、第6、第7和第8天(完全饥饿组)开始投喂卤虫无节幼体，每天8: 00和17: 00各投喂1次，投饵量为每次投饵前略有剩余为宜。每日观察仔鱼的活动情况，用虹吸管移出死鱼并记录，直至完全饥饿组仔鱼全部死亡，并计算仔鱼的成活率。仔鱼死亡以鱼体发白、心脏停止跳动为准。
1.2.3 不同延迟投饵时间对仔鱼生长影响的试验
每日随机测量1#和2#玻璃水族箱中20尾仔鱼的全长。当完全饥饿组的仔鱼全部死亡时，测量各试验组仔鱼的全长。
1.2.4 统计方法
试验数据用平均值±标准差(X ±SD)表示，采用SPSS 15.0统计软件进行方差分析及Duncan氏多重比较。
2. 结果
2.1 仔鱼的生长发育
马拉瓜丽体鱼初孵仔鱼的卵黄囊椭圆形，占身体2/3，卵黄囊中央区域有黑色星状色素斑，卵黄囊前端靠近头部可见心脏有节律地跳动，动脉、静脉血流清晰可见，身体透明，口未开通，肛门和肠道见雉形。1日龄仔鱼卵黄囊中央的黑色素斑点增多，眼球和脊索颜色加深，卵黄囊体积变小，由椭圆形向不规则形状转变，尾部不停摆动。2日龄仔鱼的口下颌形成，头部出现黑色素，鳃动脉清晰可见，肠道透明。3日龄仔鱼的血流速度减弱，卵黄囊继续缩小，上下颌不停运动，头部上方黑色素增多，尾部快速摆动，尾鳍、胸鳍形成，部分个体尾鳍出现黑色素，胸鳍下端黑色素增多。4日龄时大部分仔鱼由池底聚群向周围水体游动、摄食，进入混合营养期，卵黄囊继续缩小，头部和背部黑色素增多，脊索下方黑色素增加，鳔上方有黑色素，肠道内充满黄色代谢产物，肛门开通，可观察到排便，鳃的颜色加深，尾鳍鳍条黑色，背部黑色素可从头部延伸至距尾部1/3处，胸鳍颜色加深。5日龄仔鱼心脏透明可见，卵黄囊继续缩小。胸鳍、尾鳍不停摆动，鳃盖可见，眼球可以转动，体背上方黑色素从头部继续向尾部延伸，体侧的黑色素从胸鳍附近向尾部延伸，鳔透明，消化器官基本形成。6日龄仔鱼卵黄囊继续缩小，被内脏挤至胸鳍下方，内脏充满食物，下颌和唇部开始出现黑色素，头部、背部黑色素继续增多，鳃盖上的黑色素延伸至卵黄囊和鳔上方，体侧的黑色素从胸鳍附近延伸至尾部。7日龄仔鱼卵黄囊基本消失，消化器官内充满食物，鱼体侧面和背部黑色素明显增多，仔鱼进入外源营养期。
2.2 仔鱼全长变化和卵黄囊的吸收
马拉瓜丽体鱼初孵仔鱼平均全长为(5.58±0.39)mm。仔鱼出膜后的第1和第2天全长增长幅度较大；其中l日龄仔鱼的增长幅度最大，为(1.04±0.03)mm。3日龄和4日龄仔鱼全长的增长幅度变小，分别为(0.12±0.02)mm和(0.10±0.02)mm；以后仔鱼生长速度变快，到7日龄时平均全长达(8.26±0.18)mm；平均增长幅度为(0.32±0.06)mm。初孵仔鱼的卵黄囊平均大小为(2.64±0.13)mm3，以后逐日缩小，至3日龄时卵黄囊仅为出膜时的30%，至7日龄时卵黄囊被完全吸收消失(表 1)。
表 1 马拉瓜丽体鱼仔鱼的全长变化与卵黄囊的吸收Table 1. Total length of larvae and size of yolk-sac of C.managuense during 1~7 d after hatching日龄/d
day old全长/mm
total length卵黄囊长径/mm
long diameter of yolk-sac卵黄囊短径/mm
short diameter of yolk-sac卵黄囊体积/mm3
volume of yolk-sac0 5.58±0.39 2.21±0.08 1.51±0.10 2.64±0.13 1 6.62±0.24 2.01±0.05 1.43±0.05 2.15±0.11 2 6.96±0.23 1.78±0.11 1.28±0.03 1.53±0.08 3 7.08±0.20 1.41±0.12 1.03±0.05 0.78±0.06 4 7.18±0.16 1.36±0.16 0.99±0.07 0.69±0.07 5 7.66±0.40 1.16±0.11 0.82±0.05 0.41±0.07 6 7.94±0.51 1.00±0.14 0.44±0.10 0.10±0.03 7 8.26±0.18 - - - 2.3 初次摄食率和PNR的确定
马拉瓜丽体鱼仔鱼初次摄食率的变化见图 1。4日龄仔鱼的摄食率仅为15%，说明仔鱼此时的摄食能力还很弱；5日龄仔鱼的摄食率急剧上升，高达82%，6日龄时达到最高峰值(100%)，以后逐日下降；至9日龄和10日龄时分别为57%和42%，并出现仔鱼大量死亡；至12日龄时仔鱼全部死亡，初次摄食率为零。显而易见，马拉瓜丽体鱼仔鱼初次摄食率在9日龄和10日龄之间时为最高初次摄食率的50%，因此，马拉瓜丽体鱼仔鱼的PNR为9~10日龄。
2.4 不同延迟投饵时间对仔鱼成活率的影响
完全投饵组(0 d)和延迟投饵1~3 d的12日龄仔鱼的成活率没有明显差异，均在85%以上。延迟投饵4 d的12日龄仔鱼成活率为75.33%，比完全投饵组和延迟投饵1~3 d的成活率略微下降。延迟投饵5~7 d的仔鱼在9日龄后出现大量死亡，成活率显著下降，至12日龄时仔鱼的成活率仅为11.67%~17.67%。延迟投饵8 d(完全饥饿组)仔鱼的半致死时间为9日龄，到12日龄时全部死亡(表 2)。
表 2 不同延迟投饵时间的马拉瓜丽体鱼仔鱼成活率Table 2. Survival of C.managuense larvae at different delayed initial feedings延迟投饵天数/d
delayed initial feeding day各日龄仔鱼的成活率/% survival of larvae at different day old 4 d 5 d 6 d 7 d 8 d 9 d 10 d 11 d 12 d 0 100.00 99.33 97.00 96.33 94.67 93.00 90.33 88.00 87.67 1 99.67 98.33 97.00 95.67 94.00 94.00 92.67 90.67 89.67 2 99.33 98.00 96.33 95.00 92.33 90.00 88.00 87.67 85.67 3 100.00 98.33 98.00 97.33 96.00 94.33 92.33 91.00 89.00 4 98.33 97.00 96.00 93.67 92.00 88.67 87.33 82.33 75.33 5 99.00 98.67 97.67 96.67 96.67 59.00 40.33 25.00 15.33 6 100.00 98.33 96.33 95.33 94.00 58.00 38.67 27.67 17.67 7 99.67 97.67 95.67 94.33 91.67 57.33 36.33 23.00 11.67 8 99.33 99.00 97.33 96.00 94.67 46.00 23.67 20.67 0 2.5 不同延迟投饵时间对仔鱼生长的影响
4~6日龄时完全饥饿组与完全投饵组间仔鱼的全长无显著性差异(P >0.05)；7~8日龄时各饥饿组仔鱼在全长上有显著性差异(P < 0.05)；9~12日龄时各饥饿组仔鱼全长在组间存在极显著性差异(P < 0.01)。而完全投饵组的仔鱼则稳定增长；完全饥饿组仔鱼9日龄后出现负增长现象(表 3)。延迟投饵各试验组的12日龄仔鱼全长见表 4。延迟投饵1 d、2 d和3 d组仔鱼的全长没有显著性差异(P >0.05)；延迟投饵4 d开始，仔鱼全长的增长随延迟天数的增加而下降，各组间仔鱼的全长差异极显著(P < 0.01)。
表 3 完全饥饿组与完全投饵组马拉瓜丽体鱼仔鱼的全长比较Table 3. Comparison of total length of C.managuense larvae between feeding group and starving group日龄/d)
day old投饵方式)
feeding method仔鱼全长/mm)
total length全长幅值/mm)
range4 完全饥饿 starving 7.15±0.20 6.89~7.28 完全投饵 feeding 7.18±0.17 6.91~7.30 5 完全饥饿 starving 7.54±0.48 7.21~8.11 完全投饵 feeding 7.66±0.40 7.31~8.01 6 完全饥饿 starving 7.78±0.57 7.20~8.52 完全投饵 feeding 7.94±0.51 7.21~8.50 7 完全饥饿 starving 7.91±0.48 7.78~8.29* 完全投饵 feeding 8.30±0.21 8.00~8.53 8 完全饥饿 starving 8.07±0.46 7.81~8.35* 完全投饵 feeding 8.66±0.27 8.41~9.05 9 完全饥饿 starving 8.05±0.53 7.86~8.30** 完全投饵 feeding 8.86±0.21 8.51~9.00 10 完全饥饿 starving 7.93±0.47 7.75~8.26** 完全投饵 feeding 9.22±0.23 8.50~9.31 11 完全饥饿 starving 7.90±0.46 7.60~8.28** 完全投饵 feeding 9.84±0.42 9.32~10.21 12 完全饥饿 starving 7.91±0.47 7.54~8.29** 完全投饵 feeding 10.56±0.56 9.65~11.21 注：*. 差异显著(P < 0.05)；* *. 差异非常显著(P < 0.01)
Note：*. significant difference (P < 0.05)；* *. very significant difference (P < 0.01)表 4 不同延迟投饵时间对马拉瓜丽体鱼12日龄仔鱼生长的影响Table 4. Effect of different delayed initial feedings on growth of 12-day old C.managuense larvae延迟投饵天数/d
delayed initial feeding day仔鱼全长/mm
total length全长幅值/mm
range0 10.57±0.54a 9.60~11.20 1 10.66±0.61a 9.31~11.48 2 10.62±0.67a 9.21~11.29 3 10.24±0.51a 8.53~9.42 4 9.16±0.61b 8.49~9.51 5 8.93±0.66b 8.42~8.52 6 8.15±0.46c 7.52~8.57 7 8.05±0.53c 7.53~8.41 8 7.91±0.47c 7.54~8.29 注：同一列中字母不同者表示差异显著(P < 0.01)
Note：Different letters in the same row indicate very significant difference (P < 0.01).3. 讨论
3.1 仔鱼营养期划分和生长发育
绝大多卵生硬骨类鱼类的仔鱼发育需经历内源营养期、混合营养期和外源营养期的3个不同发育阶段。水温(27±1)℃条件下马拉瓜丽体鱼1~3日龄仔鱼的消化器官、运动器官等还没有发育完善，仔鱼集群在底层，无摄食能力，属于内源营养期。4日龄仔鱼各种器官不断完善，特别是尾鳍、胸鳍形成、肠道完善、肛门开通，仔鱼由水底聚集向周围分散，开始巡游式运动，进行主动摄食，进入混合营养期。7日龄仔鱼的卵黄囊完全消失，摄食、运动、呼吸等器官也更为完善，过渡到外源营养期。混合营养期是仔鱼从内源性营养方式转变到外源性营养方式的过渡时期。这个时期是仔鱼建立外源性摄食关系的关键时期。仔鱼只有在这段时间内建立外源性摄食关系，才能避免因受饥饿造成死亡。不同种类的鱼类仔鱼的混合营养期起止时间不同。如水温16~19 ℃条件下真鲷(Pagrosomus major)的混合营养期为2~5日龄，牙鲆(Paralichthys olivaceus)为2~4日龄[11]；13.5~14 ℃条件下大泷六线鱼仔鱼(Hexagrammos otakii)为6~8日龄[12]；水温(28±0.5)℃条件下奥尼罗非鱼(Oreochromis niloticus×O.aureus)为3~6日龄[13]。该研究表明，水温(27±1)℃条件下马拉瓜丽体鱼的混合营养期为4~7日龄。在生产中正确掌握仔鱼混合营养期，即开口时间和卵黄囊消失时间，及时在适宜时间内投饵对提高鱼类育苗成活率有重要实践意义。
水温(27±1)℃条件下完全投饵组仔鱼在出膜后的前2天生长速度较快，3~4日龄仔鱼的生长速度减慢，5日龄以后仔鱼进入稳定生长期；而完全饥饿组仔鱼的生长则从快变慢，并在9日龄开始出现负生长现象。FARRIS[14]曾根据仔鱼早期发育的生长速度变化，把仔鱼的生长划分为3个不同的时期，即仔鱼初孵时的快速生长期，卵黄囊消失前后的慢速生长期以及外源摄食后的稳定生长期，或者是不能建立外源性营养后的负生长期。马拉瓜丽体鱼仔鱼的早期生长基本符合这一生长发育规律。
3.2 仔鱼的饥饿耐力
PNR从生态学角度研究初次摄食期仔鱼的饥饿耐力和描述最终导致仔鱼死亡的饥饿程度[15]，是评价仔鱼饥饿耐力的重要指标之一。从仔鱼初次摄食到达PNR时间越长，仔鱼饥饿耐力越强；反之则饥饿耐力越弱[9]。不同种淡水鱼类仔鱼的初次摄食时间和PNR见表 5。除了沙塘鳢(Odontobutis obscura)[16]、稀有
种类
species水温/℃
water temperature开口日龄/d
days of initial feeding不可逆点/d
PNR初次摄食至PNR时间/d
time from initial feeding to PNR马拉瓜丽体鱼 Cichlasoma managuense 27.0~29.0 4.0 9.0~10.0 5.0~6.0 银 24.6~25.5 2.0~3.0 11.0~12.0 8.0~10.0 稀有 24.0~26.0 1.5~2.0 8.0~10.0 6.0~8.5 瓦氏黄颡鱼 Pelteobagrus vachelli 24.5~25.5 3.0 15.0 12.0 黄颡鱼 P.fulvidraco 24.0~28.0 3.0 7.0~8.0 4.0~5.0 唐鱼 Tanichthys albonub 24.0~28.5 2.5~3.0 8.5 5.5~6.0 鲇 Silurus asotus 22.0~24.0 3.0 7~8 4.0~5.0 中华鲟 Acipenser sinensis 18.0~21.0 12.0 24.0 12.0 史氏鲟 A.schrenckii 23.0~27.0 6.0 16.0~17.0 10.0~11.0 白斑狗鱼 Esox lucius 6.0~8.2 8.0 11.0 3.0 鳜 Siniperca chuatsi 25.0~28.0 3.0~4.0 7.0~8.0 4.0~5.0 杂交鳜 S.chuatsi×S.scherzeri 23.0~25.0 4.0 7.0~8.0 3.0~4.0 倒刺鲃 Spinibarbus denticulatus 26.0~28.0 5.0 17.0 12.0 中华倒刺鲃 S.sinensis 24.5~25.5 5.0 18.0 13.0 奥尼罗非鱼 Oreochromis niloticus×O.aureus 27.5~28.5 3.0 7.0 4.0 沙塘鳢 Odontobutis obscura 27.5~28.5 0 14.0 14.0 3.3 延迟投饵对仔鱼成活及生长的影响
饥饿不仅会造成仔鱼成活率的下降，而且会引起仔鱼生长缓慢、停滞、甚至是负生长现象[14, 29]，但适当时间的延迟投饵，会大大刺激仔鱼的食欲，从而提高仔鱼的初次摄食率，部分种类的鱼类还具有明显的生长补偿能力；但过长的延迟投饵，不但会使仔鱼生长补偿能力降低甚至丧失，而且还会引起仔鱼的消化功能衰退和营养状况恶化，从而造成死亡[18, 30]。该研究表明，延迟投饵4 d以上对仔鱼成活率和生长都有显著性影响。延迟投饵4 d的仔鱼成活率为73.33%；延迟投饵5~7 d的仔鱼成活率仅为11.67%~17.67%；延迟投饵8 d仔鱼全部死亡。仔鱼大量死亡集中出现在9~12日龄，主要是因为仔鱼进入PNR期后丧失了初次摄食能力，无法恢复摄食能力；即使个别仔鱼能暂时摄食，也会因为体质过于虚弱导致死亡。延迟投饵1~3 d对仔鱼的生长无明显影响；而且延迟投饵1~2 d仔鱼的平均全长比完全投饵组的略长，说明了马拉瓜丽体鱼仔鱼具有一定的“生长补偿能力”；而延迟投饵4~5 d组的仔鱼的生长发育受到明显的影响，生长速度逐渐变得缓慢；延迟投饵6 d以上的仔鱼则出现了负生长现象。因此，马拉瓜丽体鱼仔鱼的延迟投饵不宜超过4 d。
3.4 仔鱼适宜投饵时间
在生产实践中掌握好适宜的投饵时间，对于提高育苗成活率相当重要。过早投饵不仅摄食率低，造成不必要的饵料浪费，而且仔鱼摄食后会因其消化器官还不完善，容易造成消化不良而引起死亡；而过迟投喂会造成仔鱼消化功能衰退、营养恶化等不良后果，对于肉食性仔鱼还会造成仔鱼的相互残杀，导致仔鱼成活率下降[20]，适当的延迟投饵可提高育苗成活率[19]。该研究表明，延迟投饵4 d以上的马拉瓜丽体鱼仔鱼生长发育受到显著性影响，畸形率增加和成活率明显下降；而且仔鱼开口的当天其摄食率很低(15%)。因此，马拉瓜丽体鱼的人工育苗必须在开口后3 d内投饵，才能保证仔鱼较高的成活率和良好的生长。
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图 1 刺参肠和刺参性腺酶解过程中可溶性蛋白(a)和氨基酸态氮(b)质量浓度变化
Figure 1. Changes in concentrations of soluble protein (a) and amino acid nitrogen (b) during enzymatic hydrolyzation
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