肠道与外界隔离，形成了一个复杂独特的微生态系统。在这个微生态系统中，肠道微生物在宿主的生长发育、消化吸收、免疫调节、基础代谢、健康维持等方面发挥着重要作用^[1-4]。鱼类是脊椎动物中种类最为丰富的物种之一，且生存环境和食物种类丰富。与其他动物相比，鱼类肠道微生物更容易受到外界因素影响，具有更高的复杂性^[5]。

近年来，随着高通量测序技术和生物信息学的发展，众多学者对鱼类肠道微生物及其影响因素开展了相关研究，包括饵料的种类、养殖模式、健康状态、投喂策略等。例如，李鸣霄等^[2]报道了大口黑鲈 (Micropterus salmoides)由投喂丰年虫转为人工配合饲料后，其肠道优势菌属由单一的气单胞菌属 (Aeromonas)逐步向假单胞菌属 (Pseudomonas)、不动杆菌属 (Acinetobacter)、邻单胞菌属 (Plesiomonas)、鲸杆菌属 (Cetobacterium)、乳球菌属 (Lactococcus) 等多种复合优势菌属转变。朱昊俊等^[6]研究了不同养殖模式对杂交黄颡鱼 (Tachysurus fulvidraco♀×Pseudobagrus vachellii♂) 肠道微生物结构的影响，结果表明稻渔工作模式可为黄颡鱼提供更为优良的生存环境，其肠道微生物具有更高的多样性和稳定性。Kormas等^[7]研究了3种不同摄食方式对金头鲷 (Sparus aurata) 肠道菌群结构的影响，发现操作分类单元 (Operational taxonomic units, OTUs) 数量存在差异，野生组最多、有机组次之、常规组最低，说明食物对肠道菌群具有较大影响。胡安东等^[8]研究发现，类志贺邻单胞菌 (Pseudomonas shigella) 感染可导致杂交鲟肠道菌群紊乱，肠道微生态失衡。王淼等^[9]在尼罗罗非鱼 (Oreochromis niloticus) 养殖池塘水体中泼洒复合乳杆菌，10周后复合乳杆菌可以改善罗非鱼肠道和鳃的菌群结构，预防疾病的发生。已有大量研究聚焦于外界因素对鱼类肠道微生物群落结构的影响，但针对外界因素与鲟鱼肠道菌群相关性的研究仍较少。

中华鲟 (Acipenser sinensis) 属于大型江海洄游性鱼类，是地球上最古老的脊椎动物之一，被誉为“水中大熊猫”和“活化石”，具有重要的科研价值、生态价值和社会价值^[10]。目前，中华鲟的研究主要集中于人工繁育、生理生化、营养发育、分子鉴定、病害防控、资源调查等方面^[11-18]，而对其幼鱼阶段肠道微生物的研究鲜有报道。徐雪峰^[19]研究发现，中华鲟消化系统在40日龄左右才能发育完善。50日龄是人工养殖条件下中华鲟幼鱼食性转换的重要时间节点，因此了解其肠道菌群结构特征及影响因素，有助于优化苗种培育方法。本研究以50日龄中华鲟幼鱼为研究对象，通过高通量测序方法探讨其肠道微生物群落结构特征及其与饵料、养殖水源水的相关性，以期为中华鲟的健康养殖提供参考依据。

1.   材料与方法

1.1   实验材料与饲养管理

本研究在中华鲟研究所进行，选取2023年该所秋季自主繁育的中华鲟子二代幼鱼为研究对象，将其饲养在直径2 m的圆形流水养殖池中。每日投喂量占鱼体质量的6%~12% (根据鱼体摄食情况进行相应调整)，分3~4 次投喂。每日排污3~4 次，每次换水量约为养殖池总水量的40%~50%。养殖水源水为地下井水，未经净化处理，由水泵抽取经水塔曝气处理后，直接经管道流入养殖池内。养殖期间各项水质指标符合鲟鱼养殖水质标准。

1.2   样品采集

在中华鲟幼鱼50 日龄时，对其肠道、肠道内容物、养殖水源水及其饵料样品进行采集，每种样品设6个平行。生物样品从同一养殖池中随机挑选6尾中华鲟幼鱼，每尾作为1个重复，共6个重复。参考田甜等^[20-21]采样方法，对肠道及肠道内容物样品进行采集。具体方法如下：首先，用无菌水冲洗体表3遍，然后用75% (φ) 乙醇棉球擦拭腹部、肛门及周围皮肤，再用无菌解剖剪从腹部剪开，取出肠道，经无菌PBS冲洗3遍，将肠道内容物置于2 mL无菌EP管中，最后将肠道再次用无菌PBS冲洗3遍，置于2 mL无菌EP管中，−80 ℃保存待测。同时，采集与肠道、肠道内容物样品同时期的养殖水源水和饵料样品。养殖水源水样品为养殖池进水管道处的水样，采集方法为：用无菌袋采集1 L水样，经0.22 μm收集菌体，−80 ℃保存待测。饵料样品采集方法为：称取1 g水蚯蚓和饲料的混合物置于2 mL无菌EP管中，–80 ℃保存待测。

1.3   高通量测序与数据处理

根据Fast DNA^®Spin Kit for Soil试剂盒说明书提取中华鲟幼鱼肠道总DNA。使用16S rRNA的V3—V4变异区通用引物 (338F—806R) 进行PCR扩增。PCR产物经回收、纯化等处理后, 通过Illumina Miseq PE300平台 (上海美吉生物医药科技有限公司) 进行高通量测序。测序数据在美吉生物云平台上进行数据处理和生物信息学分析。原始数据经质控、拼接处理后，获得的有效数据按照最小样本序列数进行抽平，然后分别使用Uparse11软件、R语言3.3.1工具、Mothur1.30.2软件和Vegan2.4.3软件包依次进行OTU聚类、物种组成分析、Alpha多样性分析和Beta多样性分析。采用Procrustes分析，揭示中华鲟肠道和肠道内容物的菌群与饵料、养殖水源水微生物群落的相关性；通过SourceTracker软件追踪中华鲟肠道和肠道内容物菌群中的微生物来源。

2.   结果

2.1   高通量测序结果分析

测序结果显示，24 个样品经高通量测序和序列优化后，共获得1 236 392条有效序列 (平均值：51 517，最小值：40 818，最大值：68 971)，序列平均长度为421 bp。根据97%的相似度对所有序列进行聚类分析后得到13 478 个OTUs。如图1所示，养殖水源水样品中OTUs数量最高，达10 750；饵料和肠道内容物样品中OTUs数量较为接近，分别为2 546和2 292；肠道样品中OTUs数量最低，为1 522。4种样品中共有OTUs数量为366，3种样品中共有OTUs数量为616，2种样品中共有OTUs数量为1 257，每种样品各自特有OTUs数量为11 239，其中养殖水源水样品为9 294，饵料样品为1 056，肠道内容物样品为569，肠道样品为320。

图  1  肠道、肠道内容物、饵料及其养殖水源水OTUs数量分布UpSet韦恩图

注：C、CN、F、W分别表示肠道、肠道内容物、饵料和养殖水源水。

Figure  1.  UpSet Venn diagram analysis of intestine, intestinal content, feed and culture source water

Note: C, CN, F, W represent the samples of intestine, intestinal content, feed, culture source water, respectively.

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2.2   肠道微生物群落组成分析

在门水平上，中华鲟幼鱼肠道和肠道内容物微生物优势菌门均以变形菌门、厚壁菌门、蓝细菌门和放线菌门为主，其中变形菌门在肠道中处于绝对优势地位 (占比63.90%，图2-a)，而厚壁菌门在肠道内容物中处于绝对优势地位 (占比84.11%)。饵料和养殖水源水微生物优势菌门种类多于肠道和肠道内容物，前者以厚壁菌门、变形菌门、螺旋菌门、拟杆菌门、蓝细菌门、梭杆菌门和放线菌门为主；后者以变形菌门、拟杆菌门、髌骨菌门、放线菌门、蓝细菌门和蛭弧菌门为主。

图  2  肠道、肠道内容物、饵料及其养殖水源水微生物优势菌门和优势属组成

注：C、CN、F和 W 分别表示肠道、肠道内容物、饵料和养殖水源。

Figure  2.  Composition of dominant bacterial phyla and genus of intestine, intestinal content, feed and culture source water

Note：C, CN, F and W represent the samples of intestine, intestinal content, feed and culture source water, respectively.

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在属水平上，中华鲟幼鱼肠道微生物优势菌属为不动杆菌属 (16.54%)、乳球菌属 (12.64%)、柠檬酸杆菌属 (6.97%)、假单胞菌属 (5.06%) 和Clostridium_sensu_stricto_1 (4.24%) (图2-b)。肠道内容物微生物优势菌属为乳球菌属 (68.90%)、Clostridium_sensu_stricto_1 (6.72%) 和土孢杆菌属 (3.30%)。饵料微生物优势菌属为unclassified_f_Spirochaetaceae (13.92%)、管道杆菌属 (Cloacibacterium, 8.01%)、乳球菌属 (7.08%)、Planktothrix_NIVA-CYA_ 15 (6.90%)、Clostridium_sensu_stricto_1 (6.57%)、鲸杆菌属 (6.46%)、unclassified_c_Gammaproteobacteria (6.02%)和土孢杆菌属 (5.20%)。养殖水源水微生物优势菌属为unclassified_f_Methylomonadaceae (9.24%)、泉发菌属 (Crenothrix, 8.53%)、黄杆菌属 (Flavobacterium, 6.69%)和unclassified_f_Methylophilaceae (5.74%)。

2.3   肠道、肠道内容物与饵料、养殖水源水微生物多样性分析

选取2个α多样性指数 (Chao指数和Shannon指数) 评价4 种样品中微生物群落的丰富度和多样性。如图3-a所示，养殖水源水的微生物物种丰富度极显著 (p<0.001) 高于其他3组，饵料居中，肠道和肠道内容物最低，且二者之间无显著性差异。如图3-b所示，养殖水源水的微生物物种多样性最高，肠道和饵料次之，肠道内容物最低。采用非度量多维尺度分析研究4 种样品间的组成关系。如图4所示，肠道、肠道内容物和饵料中全部样品落在第一和第三象限，说明三者间的关系较为相似，其中肠道和肠道内容物具有更高的相似性。而养殖水源水全部样品落在第二和第四象限，说明其与肠道、肠道内容物和饵料之间的菌群结构具有明显差异。

图  3  肠道、肠道内容物、饵料及其养殖水源水微生物群落Alpha多样性分析

注：C、CN、F和W 分别表示肠道、肠道内容物、饵料和养殖水源；*. p<0.05; **. p<0.01; ***. p<0.001。

Figure  3.  Alpha diversity analysis of microorganism of intestine, intestinal content, feed and culture source water

Note: C, CN, F and W represent the samples of intestine, intestinal content, feed, and culture source water, respectively. *. p<0.05; **. p<0.01; ***. p<0.001.

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图  4  肠道、肠道内容物、饵料及其养殖水源水微生物群落Beta多样性分析

注：C、CN、F和 W 分别表示肠道、肠道内容物、饵料和养殖水源。

Figure  4.  Beta diversity analysis of microorganism of intestine, intestinal content, feed and culture source water

Note：C, CN, F and W represent the samples of intestine, intestinal content, feed and culture source water, respectively.

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2.4   肠道微生物与饵料、养殖水源水相关性分析

采用Procrustes分析肠道、肠道内容物微生物与饵料和养殖水源水微生物群落之间的相关性。结果显示，肠道、肠道内容物微生物与饵料微生物群落具有显著相关性 (p<0.05，图5-a、6-c)，但与养殖水源水微生物群落相关性不显著 (p＞0.05，图5-b、6-d)。进一步通过SourceTracker软件分析追踪肠道、肠道内容物微生物的来源。溯源结果表明，肠道微生物中有82.68%来源于饵料，1.89%来源于养殖水源水(图6-a)；肠道内容物微生物中有94.60%来源于饵料，0.93%来源于养殖水源水(图6-b)。

图  5  肠道、肠道内容物和饵料、养殖水源水之间的Procrustes分析

Figure  5.  Procrustes analysis between microorganism of intestine, intestinal content and feed, culture source water

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图  6  饵料、养殖水源水对肠道、肠道内容物微生物群落的贡献

Figure  6.  Contribution of feed, culture source water for bacteria community in intestine, intestinal content

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3.   讨论

3.1   中华鲟幼鱼肠道微生物优势菌群

肠道是鱼类体内微生物最密集的组织，肠道微生物主要存在于其肠道和肠道内容物中。变形菌门在肠道中占据优势地位已在多种鱼类肠道微生物群落结构研究中得到证实，例如：大口黑鲈^[2]、梭鲈 (Sander lucioperca)^[22]、大西洋鲑 (Salmo salar)^[23]、石首鱼 (Aplodinotus grunniens)^[24]等肠道菌群的第一优势菌门均为变形菌门。本研究结果与上述研究结果相似，中华鲟幼鱼肠道优势菌门以变形菌门、厚壁菌门、蓝细菌门和放线菌门为主，其中变形菌门在肠道中占据第一优势地位。此外，本研究还发现，中华鲟幼鱼肠道内容物优势菌门组成与肠道优势菌门相似，但第一优势菌门不再是变形菌门，而是厚壁菌门。已有研究发现，厚壁菌门可分泌多种果胶酶和蛋白酶，在消化动物粪便上起到重要作用^[25]，因此厚壁菌门更适宜在肠道内容物中富集并发挥作用。

在属分类水平上，中华鲟幼鱼肠道优势菌属为不动杆菌属、乳球菌属、柠檬酸杆菌属、假单胞菌属和Clostridium_sensu_stricto_1，肠道内容物优势菌属为乳球菌属、Clostridium_sensu_stricto_1和土孢杆菌属。研究表明，Clostridium_sensu_stricto_1和乳球菌属对肠道健康具有积极作用^[26-27]：而不动杆菌属、柠檬酸杆菌属和假单胞菌属是典型的条件致病菌，能够导致美洲鳗鲡 (Anguilla rostrata)^[28]、杂交鲟 (Acipenser baerii♀×A. schrenckii♂)^[29]、黄颡鱼 (Pelteobagrus fulvidraco)^[30]、大口黑鲈^[31]、半滑舌鳎 (Cynoglossus semilaevis)^[32]等多种鱼类患病。本研究发现，中华鲟幼鱼肠道和肠道内容物微生物组成在属分类水平上有所差异，结合各自菌属的特性及临床意义，前者优势菌属多为潜在致病菌，后者优势菌属多为有益菌。其他学者也得到相似的研究结果，例如：姜燕等^[33]发现不动杆菌属为许氏平鲉 (Sebastes schlegelii) 仔稚幼鱼肠道中的最优势菌属；苟妮娜等^[34]报道野生和养殖多鳞白甲鱼 (Onychostoma macrolepis) 肠道内容物优势菌群分别为鲸杆菌属和乳杆菌属 (Lactobacillus)。推测肠道内容物中具有高丰度的潜在有益菌，可能与营养物质的消化吸收过程有关，肠道内容物中含有大量的营养物质，而乳球菌属、梭菌属、乳杆菌属和鲸杆菌属等微生物菌群有助于宿主糖类水解、碳水化合物酵解等^[35-36]，帮助机体消化吸收，更适合在肠道内容物中存活。但肠道中富含条件致病菌的原因尚不明确，仍需进一步研究证实。

3.2   中华鲟幼鱼肠道微生物与饵料、养殖水源水微生物群落多样性

长江鲟 (A. dabryanus) 幼鱼肠道内容物及其养殖水源水菌群结构研究表明，二者间的多样性存在极显著性差异 (p<0.001)^[20]。李珊珊等^[37]研究发现，光唇鱼 (Acrossocheilus fasciatus) 幼鱼肠道Chao指数显著低于同时期的养殖水源水 (p<0.05)。本研究α多样性分析结果也表明，肠道、肠道内容物、饵料中微生物群落丰富度和多样性均极显著低于同时期养殖水源水细菌群落 (p<0.001)。此外，本研究运用β多样性分析，评估了4 种样品间的微生物群落差异性。结果显示，4 种样品的微生物群落主要划分为两大类，其中肠道、肠道内容物和饵料菌群组成较为相似，划分为第一类；而养殖水源水单独划分为第二类，两类菌群结构可明显区分开来。本研究结果表明，在养殖水源水和饵料2种外因中，中华鲟幼鱼肠道和肠道内容物的微生物更多来源于饵料，以适应养分的消化吸收而构建其特定的群落结构。

3.3   中华鲟幼鱼肠道微生物与饵料、养殖水源水微生物群落的相关性分析

水环境和食物是影响鱼类肠道微生物群落结构的关键因子。龚钰雯等^[38]将罗非鱼暴露于酸性环境2周发现，低pH对其肠道微生物菌群结构具有较大影响，肠道微生物中分枝杆菌属r相对丰度显著升高，从而导致患病风险增加。马兴宇等^[39]报道，食物种类对大口黑鲈幼鱼肠道微生物菌群结构影响较大，投喂丰年虫时放线菌门占主导地位，转食配合饲料后改变为厚壁菌门占据主导地位。Zan等^[40]研究发现，采用剂量为2.0×10⁹ CFU·kg⁻¹的多种益生菌投喂半滑舌鳎，可以有效提高厚壁菌门的丰度。本研究为明确肠道微生物中来源于饵料和养殖水源水各自的组成比例，采用SourceTracker软件进行物种溯源分析。结果表明，肠道、肠道内容物的微生物中超过80%来源于饵料，小于2%来源于养殖水源水；这说明饵料和水环境2种外因对中华鲟幼鱼肠道微生物的定植起到了关键作用，其中饵料占据主导地位，饵料中的微生物菌群组成、多样性变化可直接影响肠道微生物的菌群结构特征，为中华鲟幼鱼肠道调控提供了基础资料。

4.   结论

本研究利用高通量测序技术解析了中华鲟幼鱼肠道微生物的菌群结构及影响因素。结果表明，中华鲟幼鱼肠道和肠道内容物的微生物组成在属分类水平上有所差异，前者优势菌属多为潜在致病菌，后者优势菌属多为有益菌。与养殖水源水相比，饵料对肠道和肠道内容物微生物群落组成的贡献更高。