织纹螺 (Nassarius spp.) 是一类海洋腹足类动物，腐食性，广泛分布于热带、亚热带及温带地区的潮间带及海底，在中国主要分布于浙江、江苏、广东、福建的沿海区域^[1-2]。织纹螺味道鲜美，深受包括中国在内的部分亚洲国家居民的喜爱。但是近几十年来，食用织纹螺中毒事件时有发生，甚至出现人员死亡，引起了有关部门的高度重视。

随着检测技术的不断发展，织纹螺的主要致毒成分基本被确认为河豚毒素 (Tetrodotoxin, TTX) 及其同系物^[1]。TTX为氨基全氢喹唑啉化合物，是一种典型的非蛋白类神经毒素，能造成神经麻痹，严重时患者会因为中枢神经麻痹导致呼吸停止而死亡^[3]。关于TTX的来源一直颇具争议，通常认为可能有内源性和外源性2种来源。内源性来源主要指自身产生的毒素，外源性来源则包括了食物链累积及微生物产生的毒素^[4]。由于织纹螺是腐蚀性动物，因此可能摄食环境中的有毒动物尸体或有毒藻类，导致毒素在体内蓄积^[2]。此外，随着从海洋生物及其生活环境中分离得到的产TTX细菌的种类和数量不断增加，产TTX细菌被认为可能是海洋生物体内TTX的重要来源之一^[5]。织纹螺作为一类含TTX的生物，其体内的毒素来源也可能和微生物有关。

当前，已报道的产TTX细菌大多局限于实验室可培养的细菌，推测还有不可培养的细菌可进行TTX的生物合成^[6]。利用高通量测序技术对含TTX生物中不可培养的微生物进行研究，有助于深入地认识TTX的积累和来源问题。Biessy等^[7]利用16S rRNA测序技术对含TTX 和不含TTX 双壳贝类的细菌群落进行比较，提出弧菌属 (Vibrio) 和芽孢杆菌属 (Bacillus) 可能是双壳贝类中TTX的细菌来源。Melnikova和Magarlamov^[8]通过分析纽虫的群落结构发现，与不含TTX的纽虫相比，产TTX细菌更容易在含TTX的纽虫中积累。但目前关于织纹螺的细菌群落结构研究未见报道。基于此，本研究以较为常见的半褶织纹螺 (N. semiplicatus) 为研究对象，采用液相色谱-串联质谱 (LC-MS/MS) 法分析半褶织纹螺体内的TTX及其同系物，利用高通量测序技术比较含TTX和不含TTX织纹螺的菌群结构差异，从微生物的角度探讨半褶织纹螺体内毒素的可能来源，以期为其他含TTX生物的微生物学研究提供理论参考。

1.   材料与方法

1.1   样品采集及处理

本实验于2023年6—7月在福建省莆田市秀屿区下房海域采集半褶织纹螺，共采集6次，代表6个实验组。考虑到半褶织纹螺个体较小，从每个实验组中挑出大小均一的100只螺作为1组样本，共6组。每组样本随机取10只，用游标卡尺、天平分别测量其壳长、体质量。每组螺先用75% (φ) 乙醇擦拭表面，接着用灭过菌的开壳工具取其软组织于无菌离心管中，再用消毒过的匀浆机匀浆，最后于−40 ℃保存备用。匀浆样品用于螺体内的毒素成分和菌群结构分析。

1.2   TTX及其同系物的测定

采用液相色谱-串联质谱法对半褶织纹螺体内的TTX及其同系物进行检测。TTX的质量分数根据标准曲线进行定量，TTX同系物因缺少标准品只进行定性分析。前处理方法参照黄连琴^[9]的测定方法。色谱条件如下：TSKgel Amide-80色谱柱 (150×2.0 mm, 3 µm)；流动相A为含5 mmol·L⁻¹乙酸铵和0.1% (φ) 的甲酸溶液，流动相B为乙腈；洗脱梯度为0~2.0 min (90%B)，2.1~6.0 min (10%B)，6.1~8.0 min (90%B)；流速0.3 mL·min⁻¹；柱温40 ℃；进样体积10 μL。质谱的离子源：ESI正离子，喷雾电压：3 500 V，鞘气40 Arb，辅助气15 Arb，碰撞室压力1.5 mTorr，检测方式：多反应监测模式 (MRM)，5种目标化合物：trideoxyTTX (m/z, 272>254/162)、dideoxyTTX (m/z, 288>270/224)、deoxyTTX (m/z, 304>286/176)、TTX (m/z, 320>302/162)、oxoTTX (m/z, 336>318/178)。

1.3   微生物多样性的测定

本实验DNA的提取、扩增及产物测序均委托上海生工生物工程有限公司完成。具体流程如下：根据OMEGA DNA试剂盒方法提取样品的DNA。以提取的DNA为模板，利用细菌16S rRNA基因V3—V4区引物 (341F: 5'-CCTACGGGNGGCWGCAG-3', 805R: 5'-GACTACHVGGGTATCTAATCC-3') 进行PCR扩增。PCR反应体系 (30 μL) : 2×Hieff Robust PCR Master Mix 15 μL，上下游引物各1 μL，ddH₂O 12 μL，模板1 μL。PCR 反应条件： 94 ℃预变性3 min，94 ℃变性30 s，55 ℃退火20 s，72 ℃延伸30 s，共25个循环，72 ℃延伸5 min。扩增产物使用2% (w) 琼脂糖凝胶进行电泳检测，使用Qubit 4.0荧光定量仪进行文库浓度测定。构建好的文库通过Ilumina Miseq平台进行高通量测序。

1.4   数据分析处理

对下机测序得到的双端序列数据，首先去除引物接头序列，再根据PE reads间的overlap关系，将成对的reads拼接成1条序列，然后按照barcode标签序列识别并区分样品得到各样本数据，最后对各样本数据的质量进行质控过滤，得到各样本的有效数据。

采用Ribosomal database project (RDP) classifier贝叶斯算法对97%相似度水平的操作分类单元 (Operational taxonomic units, OTUs) 代表序列进行分类学分析，统计各样品在门和属水平上的群落组成。基于OTUs的分析结果，采用Chao1指数、Shannon指数、Simpson指数进行Alpha多样性分析。Chao1指数越大，表明群落丰富度越高；Shannon 指数越大或Simpson指数越小，则表明群落多样性越高。基于加权和非加权距离进行主坐标成分分析 (Principal co-ordinate analysis, PCoA) 以及Anosim组间相似性分析。采用STAMP软件进行差异物种分析。采用PICRUSt软件进行KEGG基因功能预测分析。采用SPSS 22.0软件对数据进行独立样本t检验分析，显著性水平α为0.05。

2.   结果与分析

2.1   半褶织纹螺体内的TTX及其同系物

由于半褶织纹螺属于季节性有毒织纹螺，其体内是否含TTX具有不确定性，因此本实验选择织纹螺毒性高发的夏季进行样品采集。本研究根据半褶织纹螺体内是否含TTX，分为不含TTX织纹螺组 (NTN) 和含TTX织纹螺组 (LTN) (表1)。其中，NTN组的平均壳长范围为 (1.62±0.16)~(1.74±0.20) cm，平均体质量范围为 (0.59±0.10)~(0.71±0.14) g，TTX质量分数均小于定量限50 μg·kg⁻¹；LTN组的平均壳长范围为 (1.42±0.04)~(1.55±0.07) cm，平均体质量范围为 (0.41±0.03)~(0.49±0.08) g，TTX质量分数范围为402~644 μg·kg⁻¹。

表  1  半褶织纹螺的壳长、体质量及其体内TTX的质量分数

Table  1.  Shell length, body mass and TTX content of N. semiplicata

采样日期 Sampling date	样品名称 Sample name	平均壳长 Average shell length/cm	平均体质量 Average body mass/g	TTX质量分数 Mass fraction of TTX/(μg·kg−1)
2023-06-06	NTN-1	1.71±0.22	0.70±0.12	<50
2023-06-13	NTN-2	1.62±0.16	0.59±0.10	<50
2023-06-20	LTN-1	1.42±0.04	0.41±0.03	402
2023-06-27	LTN-2	1.47±0.04	0.44±0.05	644
2023-07-04	NTN-3	1.74±0.20	0.71±0.14	<50
2023-07-18	LTN-3	1.55±0.07	0.49±0.08	613

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如图1-a所示，由TTX标准品检测得到的标准曲线线性方程为y=719.1x−81.85，相关系数r²为0.999 8，说明在2~50 ng·mL⁻¹浓度范围内线性良好。LTN组样品中检测到trideoxyTTX、dideoxyTTX、deoxyTTX、TTX共4种，其中trideoxyTTX的峰面积最大，deoxyTTX和TTX次之，dideoxyTTX最小 (图1-c)。此外，样品中TTX的出峰时间为4.79 min，与标准品出峰时间一致 (图1-b)，样品中TTX同系物因缺少市售标准物质无法进行比较。NTN组样品除检测到微量的dideoxyTTX外，未检测到TTX及其他3种同系物 (图1-d)。

图  1  标准曲线、标准品及部分样品的LC-MS/MS检测图谱

注：a. 标准曲线；b. 10 ng·mL⁻¹TTX；c. LTN-1色谱图；d. NTN-1色谱图。

Figure  1.  Calibration curve of TTX, chromatogram map of TTX standards and some samples detected by LC-MS/MS

Note: a. Calibration curve; b. 10 ng·mL⁻¹ TTX; c. Chromatogram map of LTN-1; d. Chromatogram map of NTN-1.

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2.2   半褶织纹螺的菌群多样性分析

将测序得到的双端序列数据通过质控过滤得到各样本的有效数据。6个实验组样品最终得到有效序列数350 573 条，平均序列长度为418.89 bp。其中含TTX织纹螺组共获得有效序列181 114 条，平均每个样品为60 371 条；不含TTX织纹螺组共获得有效序列169 459 条，平均每个样品为56 486 条。韦恩图 (图2-a—c) 显示，2组共有OTUs 935个、门26个、属479个；2组特有的OTUs、门、属的数目均无显著性差异 (p>0.05)。

图  2  基于OTUs水平、门水平、属水平的Venn图

注：a. OTUs水平；b. 门水平；c. 属水平。

Figure  2.  Venn analysis of bacterial community based on OTUs (a), phylum (b) and genus (c) level

Note: a. OTUs level; b. Phylum level; c. Genus level.

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如表2所示，LTN组的有效OTUs数、Chao1指数均显著高于NTN组 (p<0.05)，表明含TTX的半褶织纹螺的群落丰富度高于不含TTX的半褶织纹螺。LTN组的Shannon指数、Simpson指数与NTN组均无显著性差异 (p>0.05)，表明含与不含TTX的半褶织纹螺的群落多样性无显著差异。

表  2  Alpha多样性指数

Table  2.  Alpha diversity indexes

组别 Group	OTUs 数 OTUs number	Chao1指数 Chao1 index	Shannon指数 Shannon index	Simpson指数 Simpson index
含TTX织纹螺组LTN	1300±160a	1355±153a	4.08±0.24a	0.07±0.02a
不含TTX织纹螺组NTN	831±78b	897±82b	3.39±0.42a	0.11±0.04a
注：同列中不同字母间存在显著性差异 (p<0.05)。 Note: Values with different letters within the same column represent significant differences (p<0.05).

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2.3   半褶织纹螺的菌群结构分析

门水平下(图3-a)，LTN组相对丰度排名前五的菌门分别为，变形菌门 (43.9%~67.5%)、弯曲菌门 (11.7%~15.6%)、螺旋体门 (2.54%~24.6%)、拟杆菌门 (5.75%~12.1%)、梭杆菌门 (3.18%~5.38%)；NTN组相对丰度排名前五的菌门分别为，变形菌门 (19.3%~58.7%)、梭杆菌门 (12.7%~52.4%)、拟杆菌门 (11.0%~27.5%)、螺旋体门 (0.51%~33.4%)、弯曲菌门 (2.84%~6.23%)。2组的优势菌门种类一致，相对丰度无显著性差异 (p>0.05)。此外，蓝藻门在LTN组中的相对丰度 (0.93%~1.55%) 高于NTN组 (0.30%~0.90%)，但无显著性差异 (p>0.05)。

图  3  门水平和属水平下半褶织纹螺的菌群结构

Figure  3.  Community structure of N. semiplicata on phylum and genus level

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属水平下 (图3-b)，LTN组相对丰度排名前五的已知优势菌属分别，为弧菌属 (13.4%~15.2%)、norank_Spirochaetaceae (2.39%~24.0%)、疟疾杆菌属(Malaciobacter, 7.27%~9.48%)、假交替单胞菌属 (Pseudoalteromonas, 6.15%~9.00%)、嗜冷杆菌属 (Psychrobacter, 4.95%~8.86%)；NTN组中相对丰度排名前五的已知优势菌属分别为，梭杆菌属 (Fusobacterium, 10.6%~44.1%)、norank_Spirochaetaceae (0.28%~33.2%)、海生线状菌属 (Marinifilum, 0.10%~16.2%)、假交替单胞菌属 (3.67%~9.91%)、希瓦氏菌属 (Shewanella, 3.35%~9.62%)。其中，LTN组的弧菌属、疟疾杆菌属、嗜冷杆菌属相对丰度显著高于NTN组 (p<0.05)，而梭杆菌属相对丰度显著低于NTN组 (p<0.05)。

2.4   含和不含TTX半褶织纹螺的菌群差异性分析

本研究采用非加权丰度指数和加权丰度指数进行PCoA分析，其中非加权丰度指数主要关注OTUs存在与否，加权丰度指数则考虑OTUs的丰度信息。在非加权丰度下 (图4-a)，前3主成分 (PCoA1、PcoA2、PCoA3) 的贡献率分别为39.81%、21.10%、15.17%，累计贡献率达到76.08%；在加权丰度下 (图4-b)，前3个主成分贡献率分别为50.38%、34.49%、8.04%，累计贡献率达到92.91%。说明在非加权与加权丰度下，3个主成分可代表所检测细菌群落的大部分信息。根据Anosim组间相似性分析结果，非加权丰度下，r²=0.629 6，p>0.05；加权丰度下，r²=0.814 8，p>0.05。虽然组间差异大于组内差异，但均不显著，说明含和不含TTX的织纹螺的菌群结构总体上较为相似。

图  4  基于OTUs的PCoA分析

注：PCoA用来表示不同群体间的差异，样品距离越接近，表示物种组成结构越相似。

Figure  4.  PCoA analysis of bacterial community based on OTUs level

Note: PCoA represents the differences among different groups. The closer the sample distance is, the more similar the microbial community structure is.

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STAMP差异分析用于比较2组样本间物种的丰度，可获得显著性差异物种。图5列出的相对丰度大于0.2%且p<0.05的差异种属共19个，其中有17个差异菌属在LTN组中的相对丰度高于NTN组，相对丰度较高的差异物种分别为弧菌属、疟疾杆菌属和嗜冷杆菌属。

图  5  属水平上的STAMP差异分析图

注：图的左边所示为不同物种分类在两组样本中的丰度比例，中间所示为95%置信度区间内，物种分类丰度的差异比例，最右边为p值，p<0.05，表示差异显著。红色字体的菌属表示显著性差异物种，黑色字体的菌属表示非显著性差异物种。

Figure  5.  STAMP analysis on genus level

Note: The left side of the figure shows the abundance ratio of different species classifications in the two groups of samples. The middle side of the figure shows the difference ratio of species classification abundance within the 95% confidence interval. The value on the right side is p value, p<0.05 indicating significant differences. The genus in red represent significant difference species, and the genus in black represent non-significant difference species.

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2.5   基于PICRUSt的菌群基因功能预测

通过对含和不含TTX的半褶织纹螺的菌群KEGG pathway (level-2) 进行丰度组成分析。选择相对丰度前20的代谢通路进行分析 (图6)，2组织纹螺体内菌群的KEGG功能组成总体相似，均无显著性差异 (p>0.05)。丰度相对较大的代谢通路为氨基酸代谢 (LTN: 13.4%±0.41%, NTN: 12.5%±0.63%)、碳水化合物代谢 (LTN:13.3%±0.89%, NTN: 12.9%±0.13%)、辅助因子和维生素代谢 (LTN: 12.5%±1.39%, NTN: 13.7%±0.10%)、萜类和聚酮类物质代谢 (LTN: 8.52%±0.34%, NTN: 10.2%±1.24%), 丰度相对居中的代谢通路为外来生物的生物降解和代谢 (LTN: 7.43%±2.29%, NTN: 5.45%±0.78%)、类脂物代谢 (LTN: 5.82%±0.23%, NTN: 5.33%±0.25%)、能量代谢 (LTN: 5.58%±0.13%, NTN: 5.58%±0.16%)、复制和修复 (LTN: 5.15%±0.67%, NTN: 5.90%±0.37%)。

图  6  基于PICRUSt的菌群基因功能预测

Figure  6.  Genomic functional prediction of bacterial community by PICRUSt

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3.   讨论

3.1   半褶织纹螺体内毒素成分分析

已有研究发现，福建省的织纹螺毒性消长具有明显的季节性和地域性特征^[10]，本研究的半褶织纹螺采集于2023年夏季的福建省莆田市下房海域，排除了季节性和地域性差异。采集到的含TTX的半褶织纹螺体内TTX质量分数介于402~644 μg·kg⁻¹，虽低于国内水产行业标准规定的安全标准 (2 200 μg·kg⁻¹)，但比欧洲食品安全局 (European food safety authority, EFSA)对海洋腹足类和双壳类动物规定的安全限量标准 (44 μg·kg⁻¹)^[11]高8.1~13.6倍。有研究发现，野生河鲀个体越大，其体内毒素的浓度越高^[12]。但本研究显示，含TTX的半褶织纹螺的壳长、体质量均小于不含TTX的织纹螺 (p<0.05)，说明织纹螺的个体越大，其体内TTX的累积不一定越多。

TTX存在一系列结构相似的同系物，如4-epiTTX、6-epiTTX、11-deoxyTTX、4,9-anhydroTTX、5,6,11-trideoxyTTX、11-oxoTTX等，这些同系物可能与含TTX生物的合成代谢有关^[1,13]。Suo等^[14]在日本有毒扁虫 (Planocera multitentaculata) 中检测到 TTX 及trideoxyTTX、monodeoxyTTX、dideoxyTTX等主要同系物。Vlasenko和Magarlamov^[15]在不同的纽形动物 (Cephalothrix cf. simula) 中检测到7~11种TTX同系物，其中包含2种新的trideoxyTTX同系物；同时发现不同器官中的毒素成分相同，但毒素浓度不同。罗璇等^[1]对江苏省连云港市和浙江省舟山市采集的织纹螺进行检测，发现trideoxyTTX是织纹螺的主要毒素成分，TTX 和其它2种同系物次之。本研究结果与上述研究相似，在福建近岸海域的半褶织纹螺体内同时检测到TTX及3种同系物，其中trideoxyTTX的色谱峰面积最大，deoxyTTX、TTX次之。虽然trideoxyTTX、deoxyTTX在织纹螺中所占比例较大，但两者均属于TTX脱氧同系物，其羟基数量较少，降低了与钠离子通道的结合能力，毒性低于TTX，因此织纹螺的毒性主要与其体内TTX浓度相对应^[16-17]。

3.2   含和不含TTX半褶织纹螺的菌群结构和功能预测

相关研究表明，有毒河鲀独特的食物偏好可能形成独特的肠道微生物群，这可能为TTX的生物合成创造了必要条件^[6]。Lin等^[18]对包含织纹螺在内的3种螺类进行了跟踪监测，发现螺体内的TTX质量分数与菌群数量的变化有一定关系。本研究中含TTX织纹螺的群落丰富度显著高于不含TTX织纹螺，但群落多样性无显著差异。推测含TTX织纹螺群落丰富度的提高与某些产TTX相关菌在有毒织纹螺体内的大量富集有关，群落多样性无差异是由于两组织纹螺采自同一海域，细菌群落组成较为相似。

由于织纹螺的菌群结构研究未见报道，因此主要参考河鲀、纽虫等含TTX生物的菌群研究结果进行分析。雷阳等^[19]研究表明，变形菌门为野生双斑东方鲀 (Takifugu bimaculatus) 和养殖双斑东方鲀肠道菌群的优势菌门，与产TTX相关的希瓦氏菌属、发光杆菌属 (Photobacterium)、假交替单胞菌属在野生双斑东方鲀肠道中占一定比例，而在养殖双斑东方鲀中未发现。另有研究表明，5—6月黄鳍东方鲀 (Takifugu xanthopterus) 肠道的毒性最高，春、夏季肠道菌群中的优势物种包含弧菌属、弓形杆菌属、嗜冷杆菌属等^[20]。Melnikova等^[8]分析纽虫的群落结构发现，含和不含TTX纽虫的优势菌门均为变形菌门；这与本实验结果相似，变形菌门为含和不含TTX半褶织纹螺的主要优势菌门；与产TTX相关的弧菌属、嗜冷杆菌属、假交替单胞菌属为含TTX半褶织纹螺的主要优势菌属，而假交替单胞菌属、希瓦氏菌属为不含TTX半褶织纹螺的主要优势菌属。这些优势菌属大部分属于γ -变形菌纲，和Pratheepa等^[21]研究发现的葡萄牙沿海腹足类动物内脏团中γ -变形菌纲的16S rRNA基因序列数量达75%的结果相似。此外，在含和不含TTX半褶织纹螺中检测到19个差异菌属，其中17个差异菌属在含TTX织纹螺中的相对丰度较高，可进一步说明含TTX织纹螺的群落丰富度高于不含TTX织纹螺。

迄今为止，TTX在宿主体内的生物合成机制问题仍未得到解答。有学者提出TTX生物合成途径的假说，认为TTX中的胍基部分来源于精氨酸前体，而糖环部分由聚酮链、C5糖环或萜类衍生而来^[22]。Li等^[6]利用宏基因组测序对有毒和无毒河鲀的肠道菌群进行基因功能预测，发现有毒河鲀体内菌群中谷氨酸到精氨酸的代谢通路明显上调，推测精氨酸是河鲀体内共生菌群合成TTX的前体物质。本研究中含和不含TTX织纹螺的菌群KEGG功能组成相似，这与2组的菌群结构无显著性差异有关。此外，2组的主要代谢通路包含氨基酸代谢、碳水化合物代谢、辅助因子和维生素代谢、萜类和聚酮类物质代谢。由于TTX生物合成途径假说并未得到证实，因此织纹螺体内TTX及其同系物的合成是否与氨基酸代谢、萜类和聚酮类物质代谢有关仍需进一步研究。

3.3   半褶织纹螺体内产TTX相关细菌分析

关于TTX微生物来源的假说，认为共生细菌定植在宿主的特定器官中产生次级代谢产物，这些产物被宿主吸收，并加以利用。而宿主则为共生细菌提供适宜的生长和代谢条件，特别是宿主会提供细菌所必需的信号分子，以诱导共生细菌高效提供次级代谢产物^[23]。迄今为止，研究人员已从各种含TTX的生物体及环境中发现了150多株产TTX微生物^[24]，主要有变形菌门 (弧菌属、希瓦氏菌属、假交替单胞菌属等)，及放线菌门 (微球菌属、玫瑰杆菌属、链霉菌属等)；其次为厚壁菌门 (芽孢杆菌属和肠球菌属等)、拟杆菌门 (纤维单胞菌属、黏着杆菌属) 等^[25]。如Turner等^[26]将从纽虫分离得到的溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)在低温条件下进行培养，发现培养液中含有TTX。张璇^[22]从横纹东方鲀 (Takifugu transverseis) 的肠道分离出了可以产TTX或其同系物的嗜冷杆菌属。岳田芳^[27]在海藻希瓦氏菌(Shewanella algae)发酵产物中检测到了TTX。Melnikova等^[28]从Hubrechtella juliae中分离鉴定出产TTX的假交替单胞菌属。本研究在含和不含TTX半褶织纹螺体内均检测到弧菌属、嗜冷杆菌属、假交替单胞菌属、希瓦氏菌属这4种产TTX相关菌属。该结果和在不含TTX的纽形动物中发现产TTX相关菌的研究结果^[27]一致，说明产TTX相关菌可同时存在于含和不含TTX的生物体中。

虽然弧菌属是目前报道最多的产TTX细菌，占产TTX细菌菌株的30%以上，但至今未能成功分离出持续产TTX的弧菌^[7,23]。有研究发现，弧菌和蓝藻可能在有毒河鲀的肠道环境中形成共生关系，由此怀疑TTX的生物合成是由弧菌或潜在触发物组成的共生体产生^[6]。本研究发现，蓝藻门在含TTX织纹螺中的相对丰度是不含TTX织纹螺的近2倍，但无显著性差异(p>0.05)。考虑到蓝藻与石房蛤毒素 (saxitoxin，STX) 的生物合成有关，而STX与TTX有相似的胍基结构，建议后续可以开展相关研究。另有学者发现，弧菌属可产生分子量与TTX相近的无毒化合物，因此建议在评估产TTX细菌时需要对其产生的无毒化合物进行分析^[29]。基于此，Reveillon等^[30]从贝类养殖环境中分离获得122株菌株，经LC-MS/MS法检测未发现TTX及其他5种同系物。本课题组尝试从含TTX的织纹螺中分离产TTX菌株，经酶联法检测、16S rRNA鉴定，获得弧菌属、嗜冷杆菌属、希瓦氏菌属、假交替单胞菌属等产TTX菌，其中最高TTX质量分数可达99 ng·g ⁻¹ (湿质量)；然而这些菌株经LC-MS/MS法再次测定后，未发现含有TTX。该现象一方面可能是由于TTX同系物种类繁多，酶联法检测容易受到TTX同系物干扰从而出现假阳性结果；另一方面，目前市面上缺少TTX同系物标准品，使得LC-MS/MS法不能对菌株的TTX同系物进行全面分析。因此，今后可以聚集TTX同系物或前体物质方面的研究，这对探寻生物体内TTX的细菌性来源，以及TTX生物合成路径的研究均具有重要参考价值。

4.   结论

产TTX相关菌可同时存在于含和不含TTX的半褶织纹螺中，弧菌属、嗜冷杆菌属等产TTX相关菌更容易在含TTX的织纹螺中富集。结合织纹螺体内的毒素成分分析，推测产TTX相关菌在生物体内并非直接产TTX，更可能产生TTX类似物或前体物质，这些物质在生物体内进一步转化为TTX。上述结论一定程度上解释了实验室内未能成功分离持续产TTX的细菌这一问题。

致谢：衷心感谢福建省莆田市海洋与渔业局、莆田市秀屿区海洋与渔业局工作人员在织纹螺样品采集给予的帮助。