糖皮质激素性骨质疏松症 (Glucocorticoids osteoporosis, GIOP) 是一种因骨量低下、骨组织微结构损坏，致骨脆性增加的全身性骨病^[1]，也是长期持续使用或短期高剂量使用糖皮质激素类药物常见的并发症之一。GIOP的发病率和用药量呈正相关，且停药后，已形成的损伤难以逆转^[2]。流行病学调查显示，大众对骨质疏松的认知严重不足，且目前相关治疗药物尚无明确规范，骨质疏松已成为我国50岁以上人群面临的主要公共健康问题之一^[3]。

GIOP的治疗方法包括增强锻炼频率、外源性补充营养和药物治疗^[4]等。然而，多数在临床上使用的药物对人体存在不可忽视的不良影响^[5]。近年来，采用中药疗法干预GIOP受到广泛关注^[6]。中药治疗多采用天然成分混合，如萜类化合物^[7]、黄酮类化合物^[8]以及中药复方^[9]等。此类治疗方式虽对人体副作用小，但也存在见效时间长、疗程长等弊端。因此，研究出作用效果良好且绿色、安全的天然活性成分成为干预骨质疏松症的紧迫任务。随着生物技术的不断发展，研究人员发现海洋生物具有较强的生物活性。其中，从南极磷虾 (Euphausia superba)^[10]、鱼类^[11]及贝类^[12]等提取出的生物活性肽可有效调整骨转换，在干预骨质疏松症方面有广阔前景。

牡蛎 (Ostreidae) 是珍珠贝目、牡蛎科软体动物的统称，俗称海蛎子、蚝等，广泛分布于热带、亚热带和温带各海区，其软体部位不仅可食用，还能以化痰清热的作用入药，具有很高的经济价值，是我国首批列入药食同源的食物之一。牡蛎含有丰富的多糖和多肽类物质，具有提高免疫力^[13]、降低血糖^[14]、缓解肝损伤^[15]、缓解疲劳^[16]及促进生精^[17]等诸多活性。此外，研究表明牡蛎源的外泌体能够调节骨稳态，其可能通过激活成骨细胞中的PI3K/AKT/β-catenin通路来促进成骨细胞活性^[18]；Ihn等^[19]研究发现，体外发酵的太平洋牡蛎 (Crassostrea gigas) 提取物能抑制破骨细胞活性，具有治疗骨质疏松和破骨细胞介导的骨骼疾病的潜力；Molagoda等^[20]指出，牡蛎肉提取物经发酵后可以通过激活自分泌IGF-1介导的IGF-1R信号传导途径，增加Ser9处的磷酸化GSK-3β，进而促进成骨和生长性能；Chen等^[21]通过提取牡蛎中的蛋白水解物发现，其八肽可以抑制卵巢切除小鼠骨质疏松症的发生概率；Jeong等^[22]发现发酵牡蛎提取物能够通过抑制RAW264.7细胞中的活性氧 (ROS) 的产生，抑制RANKL诱导的破骨细胞生成。此外，牡蛎壳被证明可通过纳米钙锌的激活增加骨形成、减少骨丢失效率^[23]。以上研究表明，牡蛎在改善骨质疏松上具有广阔的应用前景。本研究通过建立地塞米松诱导的糖皮质激素性骨质疏松大鼠模型，探究牡蛎酶解产物 (Oyster enzymatic products, OP) 对糖皮质激素性骨质疏松症的改善作用，为牡蛎的资源开发利用提供了理论方向，从而实现经济和社会双重效益。

1.   材料与方法

1.1   材料及试剂

新鲜香港牡蛎 (Magallana hongkongensis) 肉购自湛江霞山东风水产品市场；中性动物蛋白水解酶购自庞博生物工程有限公司；地塞米松磷酸钠注射液 (1 mL∶2 mg，国药准字H41020327) 购自河南润弘制药股份有限公司；阿仑膦酸钠片 (70 mg·片⁻¹，国药准字H200610303) 购自石药集团欧意药业有限公司；特定病原体 (SPF) 级15周龄Wistar雄性大鼠、SPF级辐照饲料购自优达 (广州) 生物技术有限公司，许可证号：SCXK (辽) 2020-0001；4% (w) 多聚甲醛通用性组织固定液购自兰杰柯科技有限公司；骨碱性磷酸酶 (Bone alkaline phosphatase, BALP)、骨保护素 (Osteoprotegerin, OPG)、I型前胶原氨基端肽 (Amino-terminal peptide of type I precollagen, PINP)、基质金属蛋白酶 (Matrix metalloproteinase, MMP-9)、抗酒石酸酸性磷酸酶 (Antitartrate acid phosphatase, Tracp-5b)、组织蛋白酶K (Histolytic enzyme, Cath-K)、睾酮 (Androstenedione, T) 检测试剂盒均购自江苏酶免生物科技有限公司；氢氧化钠 (NaOH) 购自广东光华科技股份有限公司，为分析纯。

1.2   仪器与设备

HH-S4型数显恒温水浴锅 (金坛市朗博仪器制造有限公司)；FD-551型立式冷冻干燥机 (东京理化器械公司)；Lynx6000型高速落地离心机、Varios-kanFlash全自动酶标仪 (美国Thermo公司)；HH-8CJ型数显恒温磁力搅拌水浴锅 (常州市金坛友联仪器研究所)；EYELA N-1388V-W旋转蒸发仪 (东京理化器械公司)。

1.3   实验方法

1.3.1   牡蛎酶解产物的制备

沿用本课题组的OP制备方法^[23]，将新鲜牡蛎肉流水洗净杂质并晾干，按料液比1∶3加入蒸馏水混合打浆，使用4% (w) 的NaOH调节pH至7.0，按照酶活与底物比例1 000∶1 (U·g⁻¹) 加入中性动物蛋白水解酶，53 ℃酶解5 h。酶解完成后沸水浴灭酶15 min，8 000 r·min⁻¹离心20 min。过滤获得上清液后减压浓缩，真空冷冻干燥48 h，得到OP，−20 ℃保存备用。

1.3.2   动物实验分组、造模、干预、取材

15周龄Wistar雄性大鼠共60只，体质量为 (330±5) g。所有动物均在广东海洋大学SPF级动物房饲养 (批准文号：GDOU-LAE-2023-035)。整个动物实验过程严格按照广东海洋大学实验动物伦理委员会相关规定执行。

将所有Wistar大鼠于干燥、通风、室温 (22±2) ℃、相对湿度 (55±5)%的环境下饲养1周。暂养结束，确认周期内无死亡及其他异常情况，将所有大鼠随机分为6组，每组10只，分别命名为空白组 (CK)、模型组 (DEX)、阳性药物组 (AL) 及OP给药低、中、高剂量组 (OP-L, OP-M, OP-H)。按表1对大鼠进行肌肉注射与灌胃干预，灌胃剂量为1 mL·100 g⁻¹，为期9周。给药剂量参照药理学标准体质量的mg·kg⁻¹剂量折算表，并按照1∶3∶9的比例设置剂量组。灌胃干预结束后，于所有大鼠腹腔注射10% (w) 水合氯醛麻醉，观察其对外界刺激无应答后取材。

表  1  动物模型造模及给药

Table  1.  Animal model modeling and drug administration

组别 Group	肌肉注射 Intramuscular injection	灌胃 Gastric lavage
对照组 CK	0.9% (w) 氯化钠注射，2.5 mg·kg−1，每周2次	蒸馏水，每天1次
模型组 DEX	地塞米松磷酸钠注射液，2.5 mg·kg−1，每周2次	蒸馏水，每天1次
阳性药物组 AL	地塞米松磷酸钠注射液，2.5 mg·kg−1，每周2次	阿仑膦酸钠片，6.3 mg·kg−1，每周1次
牡蛎酶解产物给药低剂量组 OP-L	地塞米松磷酸钠注射液，2.5 mg·kg−1，每周2次	牡蛎酶解产物，300 mg·kg−1，每天1次
牡蛎酶解产物给药中剂量组 OP-M	地塞米松磷酸钠注射液，2.5 mg·kg−1，每周2次	牡蛎酶解产物，900 mg·kg−1，每天1次
牡蛎酶解产物给药高剂量组 OP-H	地塞米松磷酸钠注射液，2.5 mg·kg−1，每周2次	牡蛎酶解产物，2 700 mg·kg−1，每天1次

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1.3.3   样本采集及检测

1) 血清中生化指标检测

采用眼眶取血法采血，全血标本室温静置1 h，3 000 r·min⁻¹离心20 min，仔细提取上清液，EP管密封后放入 −80 ℃冰箱待测。血清中骨保护素、骨碱性磷酸酶、I型前胶原氨基端肽质量浓度，基质金属蛋白酶、抗酒石酸酸性磷酸酶、组织蛋白酶K活性以及睾酮浓度按照ELISA检测试剂盒说明书进行检测。

2) 骨密度测量和微型CT (Micro-CT)

取大鼠左侧股骨，仔细剔除附着的肌肉和软组织，剥离完后使用4% (w) 多聚甲醛固定，采用Micro-CT扫描，利用NRecon三维重建图像，使用CT Analyser分析选定区域。统一标准后，测得骨密度 (Bone mineral density, BMD)、骨体积分数 (TV)、骨小梁数目 (Tb.N) 及骨表面积骨体积比值 (BS·BV⁻¹)。

3) 苏木素-伊红染色和钙结节染色

苏木素-伊红切片染色和钙结节切片染色委托塞维尔 (广州) 科技有限公司进行。

4) 统计学方法

使用Microsoft Excel 2016 软件进行记录和格式整理，采用SPSS 22.0和GraphPad 9.0软件对所有数据进行统计分析。实验结果以“平均值±标准差 ($\overline { x}\pm s $)”表示，采用单因素方差分析 (One-way ANOVA) 分析所有数据，显著性水平α为0.05。

2.   结果与分析

2.1   血清中生化指标分析

血清中的骨保护素和I 型前胶原氨基端肽作为成骨细胞标志物，反映了成骨细胞合成骨胶原的能力，是新骨形成的特异性敏感指标^[24]。大鼠血清中生化指标测定结果如图1所示。与空白组相比，DEX组的骨保护素和I型前胶原氨基端肽分别下降了18.39%和15.20% (p<0.05，图1-a—1-b)，表明DEX组大鼠体内成骨细胞合成骨胶原的能力降低，进而影响了新骨的形成。OP-L、OP-M和OP-H组骨保护素质量浓度分别为922.44、900.92和915.08 pg·mL⁻¹，I型前胶原氨基端肽质量浓度分别为45.61、45.47和45.68 pg·mL⁻¹，2种标志物相较于DEX组平均分别提高了13.67%和11.51%，表明OP可以提高骨胶原合成能力，促进新骨形成。

图  1  各组血清生化指标检测

注：不同字母表示差异显著 (p<0.05)。

Figure  1.  Serum biochemical indexes detection in each group

Note: Different letters represent significant differences (p<0.05).

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血清中的基质金属蛋白酶和组织蛋白酶能够降解软骨基质进而引发疼痛，而抗酒石酸酸性磷酸酶作为第二代骨吸收标志物，与骨吸收高度相关。DEX组的基质金属蛋白酶、组织蛋白酶K和抗酒石酸酸性磷酸酶质量浓度较空白组分别增加了12.48%、32.22%和11.12% (p<0.05，图1-c—1-e)，表明DEX组大鼠骨转换过程中的骨吸收增强，骨流失加速。OP-L、OP-M和OP-H组的基质金属蛋白酶质量浓度比DEX组分别降低了16.14%、16.77%和13.40% (p<0.05)，其中OP-L、OP-M组较AL 组(13.73%) 效果更好。OP各剂量组的组织蛋白酶K和抗酒石酸酸性磷酸酶平均质量浓度分别为57.22和38.45 pg·mL⁻¹，改善效果与AL组 (58.38 和39.06 pg·mL⁻¹) 无显著性差异，且基本恢复至空白组水平。

睾酮作为人体内重要的性激素之一，在维持骨转换平衡和抑制骨量丢失等方面起重要作用^[25]。与空白组相比，DEX组睾酮浓度下降了16.62% (p<0.05，图1-f)，说明GIOP大鼠血清内睾酮浓度间接影响骨转换。OP-L、OP-M和OP-H组睾酮浓度分别为3.60、3.57和3.58 nmol·L⁻¹，较DEX组平均提高17.80%，与AL组 (3.43 nmol·L⁻¹) 改善作用相当，与空白组无显著性差异。骨碱性磷酸酶作为一种细胞外酶，主要作用于骨形成，正常情况下其在体内的含量相对稳定，只有出现病理指征时才会发生变化。OP组大鼠体内骨碱性磷酸酶与DEX组相比无显著性变化 (图1-g)。冯佳等^[26]通过实验比较不同糖皮质激素骨质疏松造模，结果表明糖皮质激素造模方式存在碱性磷酸酶无显著性差异的情况，与本研究结果一致。

综上，OP可显著提高成骨细胞合成骨胶原的能力，加速新骨形成，降低骨吸收速度，提高血清中的睾酮含量，使GIOP大鼠基本恢复至正常不患病水平，起到了良好的改善GIOP的作用。

2.2   骨相关参数分析

骨由皮质骨和骨小梁2部分组成，分别分布于骨的表面和内部。骨小梁在骨髓腔中呈不规则立体网状结构，具有非均匀的各向异性，这种排列能够增加骨强度。有研究表明，糖皮质激素类药物导致的骨密度降低，是致其患病的主要因素^[27]。骨密度作为衡量骨质疏松的“金指标”，能够直接反映选中区域的骨量；骨体积分数和骨表面积骨体积比值分别表示感兴趣区域总体积和单位体积骨组织的面积大小；骨小梁数目代表感兴趣的区域中每1 mm骨组织与非骨组织交点数量的平均值，是衡量骨密度的重要指标^[28]。

如图2-a所示，DEX组大鼠骨密度为0.37 g·cm⁻³，显著低于空白组 (0.72 g·cm⁻³, p<0.05)，说明糖皮质激素诱导骨质疏松大鼠造模成功。与DEX组相比，OP-H组骨密度增加56.31% (p<0.05)，显著高于AL组 (51.86%)，表明高剂量的OP能改善GIOP，且效果优于阳性药物。此外，OP组骨体积分数较DEX组平均提升21.40%，骨表面积骨体积比值平均提升20.48%，骨小梁数目平均提升11.25% (p<0.05，图2-b—2-d)，表明OP能够改善GIOP大鼠的骨质疏松态，其中OP-L、OP-M组的效果优于OP-H组。综上所述，低、中剂量的OP可能通过减少骨吸收、维持骨形成而减少骨量损失；高剂量的OP可能可以在减缓骨转换的同时增强成骨能力，进而增加骨密度、改善骨形态，效果接近AL，改善作用较其他样品组更佳。

图  2  各组骨小梁指标检测

注：不同字母表示差异显著 (p<0.05)。

Figure  2.  Bone trabecular index test for each group

Note: Different letters represent significant differences (p<0.05).

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2.3   Micro-CT扫描图像

Micro-CT扫描结合软件能够在不破坏样本的情况下，清楚了解样本的内部显微结构，有助于直接观察骨小梁的分布^[29]。图3显示，空白组骨髓腔充实，骨小梁排列紧密，无明显空洞，骨小梁之间无明显间隙，网状结构明显；而DEX组骨小梁数目明显减少，骨髓腔空虚，骨小梁排列稀疏，骨小梁与空白组相比网状结构明显缺失。经阳性药物与不同剂量的OP干预后，骨小梁数目逐渐增加，结构紧密，骨髓腔逐渐充实，骨小梁之间空洞减少，间隙缩短。OP-H组各项指标与空白组接近，说明其可有效改善GIOP大鼠的骨小梁状态。苏开鑫等^[30]研究发现牡蛎肉提取物能改善类固醇使用导致的大鼠骨缺失，改善骨代谢，增强骨密度，与本研究结果相似。

图  3  各组股骨干骺端Micro-CT扫描图像

注：箭头所指为骨髓腔中骨小梁。a. 空白组；b. 模型组；c. 阳性组；d. 牡蛎酶解产物低剂量组；e. 牡蛎酶解产物中剂量组；f. 牡蛎酶解产物高剂量组。

Figure  3.  Micro-CT scans of the femoral epiphysis of each group

Note: Arrows point to trabeculae in the marrow cavity. a. CK group; b. DEX group; c. AL group; d. OP-L group; e. OP-M group; f. OP-H group.

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2.4   Micro-CT三维重建

通过三维骨结构的定量图像能直观地看到骨小梁的排列结构及形态变化，对于骨质评估至关重要^[31]。3D重建图像见图4，空白组骨小梁形态良好，结构紧密，骨小梁之间连接紧密，排列有序；而DEX组骨小梁数目缺失，结构稀疏，密度下降，形态不规则，骨小梁间间距变大，连接断裂，总体呈现骨质疏松态。与DEX组相比，OP组呈现出不同程度的骨质疏松态改善情况，且随剂量增加，各组骨小梁数目增多，形态愈发规则，连续性较好，排列紧密。其中，OP-H组大鼠骨小梁结构已接近空白组，与AL组改善效果相似。以上结果表明OP能够改善骨质疏松大鼠的骨小梁微结构，且高剂量OP改善效果较其他剂量更显著。

图  4  各组Micro-CT 3D重建图像

注：上为3D重建正视图，下为3D重建俯视图。a. 空白组；b. 模型组；c. 阳性组；d. 牡蛎酶解产物低剂量组；e. 牡蛎酶解产物中剂量组；f. 牡蛎酶解产物高剂量组。

Figure  4.  Micro-CT 3D reconstructed images of each group

Note: The top images are the 3D reconstruction front view, and the bottom images are the 3D reconstruction top view. a. CK group; b. DEX group; c. AL group; d. OP-L group; e. OP-M group; f. OP-H group.

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2.5   股骨组织病理分析

骨骼的强度和机械能力一定程度上取决于骨的微观结构^[32]。由股骨干骺端HE切片 (图5) 可知，空白组骨小梁数目丰富，排列紧密，骨组织结构完整，骨小梁间无断裂现象且空洞少，骨微结构未遭破坏，形态良好。与空白组相比，DEX组骨小梁数目减少，有断裂现象出现，厚度减小，连续性变差，面积比低，排列紊乱，有明显的骨质疏松症状。使用AL与OP进行干预后，骨小梁数目逐渐增加，断裂现象减少，厚度增加，连续性明显改善，排列逐渐规律整齐，骨质疏松症状逐渐减轻。使用ImageJ软件计算骨小梁面积占比发现，AL、OP-L、OP-M、OP-H组骨小梁面积占比分别为56.72%、52.88%、44.40%、55.49%，OP各剂量组骨小梁面积占比平均比DEX组增加14.02%。结果表明，阳性药物确实能改善骨质疏松大鼠骨小梁的状态，而高剂量OP较其余剂量改善情况更接近阳性药物，在改善骨小梁数目和形态上发挥更大的作用。

图  5  各组股骨HE染色结果 (200×)

注：箭头所指为骨小梁。a. 空白组；b. 模型组；c. 阳性组；d. 牡蛎酶解产物低剂量组；e. 牡蛎酶解产物中剂量组；f. 牡蛎酶解产物高剂量组。

Figure  5.  HE staining results of femur in each group (200×)

Note: Arrows point to trabeculae. a. CK group; b. DEX group; c. AL group; d. OP-L group; e. OP-M group; f. OP-H group.

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2.6   钙结节染色

骨组织是体内钙离子的储存库，对骨转化有着重要影响^[33]。骨盐占骨干质量的65%~70%，其中约60%的骨盐以结晶的羟基磷灰石形式存在，其能增加骨的硬度，在骨硬组织切片中显示出黑色沉淀。如图6所示，空白组骨盐沉积面积较大，连续性好，骨盐沉积形态连续，无断裂现象；DEX组与空白组相比骨盐沉积部分面积减少，连续性变差，断裂增加；使用OP干预后，骨盐沉积面积逐渐增大，连续性变好，断裂现象减少。通过ImageJ计算骨盐沉积面积变化发现，空白组骨盐沉积面积为42.85%，DEX组为32.75%，AL、OP-L、OP-M、OP-H组的骨盐沉积面积较DEX组分别增加28.6%、20.09%、16.45%、22.51% (p<0.05)。OP各剂量组平均增加19.68%，说明阳性药物与OP均能通过增加骨质疏松大鼠中骨盐的沉积面积来增强骨强度，进而改善骨质疏松症状，其中高剂量OP效果最佳。

图  6  各组股骨钙结节指染色结果

注：箭头所指为钙盐沉积部分。a. 空白组；b. 模型组；c. 阳性组；d. 牡蛎酶解产物低剂量组；e. 牡蛎酶解产物中剂量组；f. 牡蛎酶解产物高剂量组。

Figure  6.  Finger staining results of femoral calcaneal nodes in each group

Note: Arrows point to the portion of calcium salt deposits. a. CK group; b. DEX group; c. AL group; d. OP-L group; e. OP-M group; f. OP-H group.

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3.   结论

本研究以牡蛎酶解产物为研究对象，对糖皮质激素引起的骨质疏松大鼠进行干预，评估其对大鼠骨质疏松的改善作用。结果表明，牡蛎酶解产物能通过提高骨密度和骨小梁数目、血清中成骨细胞标志物以及睾酮的含量，降低破骨细胞标志物的活性，增强骨的钙盐沉积能力，来改善糖皮质激素诱导的骨质疏松症状。结果可为牡蛎在骨质疏松方面的研究提供理论依据，并为其原料开发和高值化利用提供参考。