尖吻鲈幼鱼运输密度和时长对运输水质及其复苏率和抗氧化能力的影响

陈旭, 左涛, 周胜杰, 杨蕊, 于刚, 秦传新, 马振华

陈旭, 左涛, 周胜杰, 杨蕊, 于刚, 秦传新, 马振华. 尖吻鲈幼鱼运输密度和时长对运输水质及其复苏率和抗氧化能力的影响[J]. 南方水产科学, 2021, 17(2): 122-128. DOI: 10.12131/20200169
引用本文: 陈旭, 左涛, 周胜杰, 杨蕊, 于刚, 秦传新, 马振华. 尖吻鲈幼鱼运输密度和时长对运输水质及其复苏率和抗氧化能力的影响[J]. 南方水产科学, 2021, 17(2): 122-128. DOI: 10.12131/20200169
CHEN Xu, ZUO Tao, ZHOU Shengjie, YANG Rui, YU Gang, QIN Chuanxin, MA Zhenhua. Effects of transport density and duration on transport water quality, resuscitation rate and antioxidant ability in juvenile Lates calcarifer[J]. South China Fisheries Science, 2021, 17(2): 122-128. DOI: 10.12131/20200169
Citation: CHEN Xu, ZUO Tao, ZHOU Shengjie, YANG Rui, YU Gang, QIN Chuanxin, MA Zhenhua. Effects of transport density and duration on transport water quality, resuscitation rate and antioxidant ability in juvenile Lates calcarifer[J]. South China Fisheries Science, 2021, 17(2): 122-128. DOI: 10.12131/20200169

尖吻鲈幼鱼运输密度和时长对运输水质及其复苏率和抗氧化能力的影响

基金项目: 中国水产科学研究院基本科研业务费项目 (2020TD55);中国水产科学研究院南海水产研究所中央级公益性科研院所基本科研业务费专项资金资助 (2018ZD01);广西创新驱动发展专项资金项目 (桂科AA18242031)
详细信息
    作者简介:

    陈 旭 (1974—),男,助理研究员,从事水产养殖和营养与饲料研究。E-mail: chenxu7495@163.com

    通讯作者:

    马振华 (1981—),男,博士,研究员,从事海水鱼类繁育与深远海养殖研究。E-mail: zhenhua.ma@hotmail.com

  • 中图分类号: S 981.13

Effects of transport density and duration on transport water quality, resuscitation rate and antioxidant ability in juvenile Lates calcarifer

  • 摘要: 该试验采用塑料袋密闭充氧运输方式,探讨3种运输密度 (D1=14 kg·m−3、D2=21 kg·m−3、D3=28 kg·m−3) 下模拟运输24 h和运输密度7 kg·m−3下模拟6个不同运输时长 (T1=4 h、T2=8 h、T3=12 h、T4=16 h、T5=20 h、T6=24 h) 对运输水质、尖吻鲈 (Lates calcarifer) 幼鱼复苏率和抗氧化能力的影响。结果显示,随着运输密度和时间的增加,运输水体中氨氮 (NH4 +-N)和亚硝态氮 (NO2 -N) 升高而溶解氧 (DO)、酸碱度 (pH)和复苏率降低;幼鱼成活率均为100%。运输密度结果显示,D1和D2组总超氧化物歧化酶 (T-SOD) 活性显著低于对照组 (P<0.05);D3组过氧化物酶 (POD) 活性均显著低于D1、D2和对照组 (P<0.05);D2与D3组相比丙二醛 (MDA) 含量差异不显著,均显著高于D1和对照组 (P>0.05)。运输时长结果显示,T3与T4组相比T-SOD活性差异不显著,显著高于T1、T2、T5和T6组 (P<0.05);各试验组POD活性均显著高于对照组 (P<0.05);T2组MDA含量与T4组相比差异不显著,显著高于T1、T3、T5、T6和对照组 (P<0.05)。研究表明,随着运输密度和时间的增加,尖吻鲈幼鱼运输水质恶化,复苏率降低,对抗氧化能力影响显著。综合分析,在水温24 ℃、盐度32、pH 7.92的条件下用塑料袋密封充氧运输的体长为 (1.42±0.19) cm的尖吻鲈幼鱼24 h时,密度不超过21 kg·m−3为宜。
    Abstract: The experiment was conducted to investigate the effects of simulated transportation for 24 h with three transport densities (D1=14 kg·m−3, D2=21 kg·m−3, D3=28 kg·m−3) and six different transport durations (T1=4 h, T2=8 h, T3=12 h, T4=16 h, T5=20 h, T6=24 h) at 7 kg·m−3 on the transport water quality, resuscitation rate and antioxidant capacity of juvenile Lates calcarifer. The results show that with the increase of transport density and duration, the contents of NH4 +-N and NO2 -N in the transport water increased, while the DO content, pH and resuscitation rate decreased but the survival rate was 100%. The results of transport density test show that the T-SOD activities in D1 and D2 groups were significantly lower than that in the control group (P<0.05); the POD activity in D3 group were significantly lower than those in D1 group, D2 group and the control group (P<0.05); the MDA content in D2 group was not significantly different from that in D3 group, which was significantly higher than those in D1 group and control group (P>0.05). The results of transport time test show that there was no significant difference in T-SOD activity between T3 and T4 groups, which were significantly higher than those in T1, T2, T5 and T6 groups (P<0.05); the POD activity in each experimental group was significantly higher than that in the control group (P<0.05); the MDA content in T2 group was not significantly different from that in T4 group, but was significantly higher than those in T1, T3, T5, T6 groups and control group (P<0.05). It is shown that with the increase of transport density and duration, the water has deteriorated and the resuscitation rate decreased, having significant effect on the antioxidant ability of L. calcarifer juveniles. In conclusion, under conditions of water temperature 24 ℃, salinity 32 and pH 7.92, with body length of (1.42 ± 0.19) cm, the density should not exceed 21 kg·m−3 for 24 h.
  • 种群遗传结构是指种群内部等位基因频率的异质性[1]。种群遗传结构研究的目的在于探明物种在特定栖息范围内的种群数量,以及各个种群的遗传特征及他们之间的差异和联系。在渔业管理中,需要根据种群的划分来分配不同的捕捞压力[1-2],防止过度捕捞的发生和种群适应力的下降或衰退[3]

    圆舵鲣(Auxis rochei)属鲈形目、鲭科,广泛分布于大西洋、印度洋和西太平洋的浅海海域[4-5],是一种中上层洄游的小型金枪鱼类,具有重要的经济价值。FAO数据显示,以舵鲣类为代表的小型金枪鱼类资源的全球捕捞量逐年攀升[6]。近年来的灯光罩网探捕[7-8]也发现南海蕴藏有丰富的圆舵鲣资源,其中2012年9月~10月在南海中南部海域的探捕调查显示圆舵鲣为重要渔获[9]。而目前关于南海圆舵鲣的研究较少,仅见于生长发育[10]、资源生物学[11-12]和营养分析[13]等方面,尚未见种群遗传相关的报道。线粒体控制区(D-loop)为非编码区,进化速率快,多态性高,是探讨种内遗传分化较为理想的分子标记,应用广泛。该研究利用D-loop序列作为遗传标记,分析了南海圆舵鲣的种群遗传结构和遗传多样性,旨在为资源的合理开发和可持续利用提供参考。

    圆舵鲣个体样本通过灯光罩网渔船采集,经形态学鉴定和生物学测量后冰冻带回实验室,剪取背部肌肉置于-20 ℃保存。采样点位置示意图见图 1,样本采集时间、位点经纬度及样本量见表 1

    图  1  圆舵鲣采样点示意图
    南海九段线参见彩色宣传页的调查区域图
    Fig. 1  Map of sampling sites for A.rochei in the South China Sea
    For information about the nine-dash line of the South China Sea, see the survey area map on the colored leaflet.
    表  1  南海圆舵鲣样本信息及D-loop区遗传多样性参数
    Table  1  Specimen information of A.rochei and genetic diversity parameters based on D-loop sequences
    采样点
    sampling site
    采样时间
    sampling date
    经度/纬度
    longitude/latitude
    样本量(N)
    number of samples
    单倍型数量(H)
    number of haplotypes
    多态性位点数(S)
    number of polymorphic sites
    单倍型多样性
    (h±SD) haplotype diversity
    核苷酸多样性
    (π±SD) nucleotide diversity
    A 2014-11-22 108°03′E /18°12′N 30 30 103 1.000 0±0.008 6 0.034 966±0.017 627
    B 2015-03-17 112°58′E /18°29′N 42 34 130 0.958 2±0.025 3 0.037 692±0.018 765
    C 2015-04-22 116°53′E /20°28′N 36 36 125 1.000 0±0.006 5 0.035 815±0.017 933
    D 2013-03-27 115°32′E /11°01′N 38 35 116 0.994 3±0.008 2 0.037 030±0.018 494
    E 2013-03-20 110°31′E / 5°34′N 32 32 103 1.000 0±0.007 8 0.034 327±0.017 276
    F 2014-11-28 112°03′E /20°14′N 10 9 31 0.977 8±0.054 0 0.034 347±0.018 732
    G 2013-04-05 117°28′E /15°04′N 13 13 83 1.000 0±0.030 2 0.041 235±0.021 749
    总计  total - - 201 185 202 0.997 2±0.001 5 0.036 807±0.017 981
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    从每个样品中剪取30 mg左右肌肉置于1.5 mL离心管内,使用快速组织细胞破碎仪(BulletBlender STORM,美国)研磨后,用海洋动物基因组DNA抽提试剂盒(北京天根)提取基因组DNA。取5 μL DNA样品用1%TBE琼脂糖凝胶进行电泳,检测其基因组DNA完整性和纯度。剩余样品置于-20 ℃冰箱内保存备用。

    PCR反应体积为50 μL,其中Taq PCR Master Mix(上海生工)25 μL,包括Taq DNA聚合酶、dNTP、PCR Buffer、PCR stabilizers、gel loading和核酸染液;模板DNA 1 μL,正反向引物(Ath-Dloop-F与Ath-Dloop-R[14])各1 μL(浓度为10 μmol · L-1),加灭菌超纯水至总体积50 μL。PCR反应在热循环仪(Eppendorf,德国产)上进行,反应程序为94 ℃预变性3 min,之后进行30个循环,每个循环包括94 ℃变性30 s、56 ℃退火30 s、72 ℃延伸1 min,最后72 ℃延伸5 min。扩增产物经电泳检验后,选取单一条带产物进行序列测定,测序引物与扩增引物相同。

    将测序获得的序列经BioEdit 3.3[15]编排后,用MEGA 6.0[16]中ClustalW进行比对(alignment),多重排列的参数设置为程序默认值。核苷酸替代的最适模型通过软件Modeltest 3.7[17]来选择。基于AIC(Akaike Information Criterion) 标准从56种核苷酸替代模型中选出最适模型及相关参数,用于后续系统发生关系重建和种群遗传结构分析。

    利用Dnasp 5.0[18]和Arlequin 3.5[19]软件计算各个采样点(地理群体)样本的遗传多样性指数,包括单倍型数目(H)、多态位点数目(S)、单倍型多样性(h)和核苷酸多样性(π)等。

    在Arlequin 3.5中采用分子方差分析(analysis of molecular variances,AMOVA)[20]来评价种群遗传变异水平与地理格局的相关性;进化模型选择1.3.1中确定的具有非变异位点(invariable sites)和Gamma参数(Gamma shape parameter)的TrN模型[21](TrN+I+G模型),显著性用10 000次重复抽样来检验。通过计算两两群体间的分化固定指数FST来检验群体间遗传距离的大小,利用Dnasp 5.0计算群体间的基因流。若群体间遗传分化不显著,则进行种群分化测试(exact test of population differentiation)。此测试基于随机交配群的单倍型分布频率的观测值低于期望值这个预定假设。若检测结果不显著,则接受群体间为随机交配群的假说。种群分化测试在Arlequin 3.5中计算,显著性通过10 000次重复抽样来检验。鉴于采样点F和G的样本量比较小,为避免样本量不对等带来的误差,这2个群体不参与种群遗传结构和历史动态的分析。

    利用Dnasp 5.0生成所有样本的D-loop区序列单倍型,将扁舵鲣(A.thazard)D-loop区同源序列作为系统分析的外类群,基于邻接法(neighbor-joining,NJ)在MEGA 6.0中构建样本单倍型的系统发育树。进化模型同样选择1.3.1中确定的TrN+I+G模型,系统树各分支的可靠性采用1 000次重复抽样评估。

    在Arlequin 3.5中使用核苷酸不配对分布分析(mismatch distribution)[22-23]和中性检验(neutrality tests)来检测南海圆舵鲣的种群历史动态,以检验种群历史上是否存在扩张事件。核苷酸不配对分布分析中,选取突然扩张模型(sudden expansion model)基于最小方差法来检验观测值和种群扩张模型下的期望分布之间是否一致。模型的有效性由粗糙指数[24](Harpending′s raggedness index,HRI)进行评估,HRI的统计检验由10 000次重复抽样获得。另外由于核苷酸不配对分布可能具有保守性[25],采用两种广泛使用的中性检验:Tajima′s D检验[26]和Fu′s FS检验[27]来检测种群是否严格遵循中性理论。

    如检测到种群扩张事件,则依据公式t=τ/2 u[28]计算扩张开始到现在经历的代数。其中τ为根据核苷酸不配对分布计算获得的扩张时间参数,t指自扩张以来所经历的代数,u为序列的突变速率,可通过公式u=2μk计算得到,其中k代表序列长度,μ代表每个核苷酸位点的突变速率,采用相关研究中普遍采用的每百万年3% ~10%的数值[29]。实际扩张时间T=t×代时,圆舵鲣代时以2.6年[5]为计。

    共获得南海圆舵鲣7个地理群体共201尾样本的线粒体D-loop区序列,截取5′端高变区644 bp序列进行分析,未发现插入与缺失碱基。碱基平均组成比例为A=31.9%、T=31.5%、C=20.8%和G=15.8%,A+T含量(63.4 %)明显高于C+G含量(36.6 %)。

    样本整体共包含202个多态性位点,核苷酸多样性指数为0.036 807 (SD=0.017 981)。201条序列一共检测到185个单倍型,单倍型多样性指数为0.997 2(SD=0.001 5)。绝大多数单倍型(180个)只属于一个个体,仅有5个单倍型被不同的个体共享(2~10个)。除位点E的个体外,其余各地理群体均互有共享单倍型。南海圆舵鲣遗传多样性参数如表 1所示,各个地理群体均呈现出非常高的单倍型多样性(0.958 2~1.000 0)和较高的核苷酸多样性(0.034 327~0.041 235)。

    南海圆舵鲣地理群体D-loop序列的AMOVA结果(表 2)显示,群体间的遗传变异仅占所有遗传变异的极少部分,绝大部分的遗传变异(98.33%)来源于群体内部。样本总体分化系数为0.016 74,基因流为14.68,表明群体间基因交流频繁,不存在明显的遗传分化。两两地理群体间遗传分化系数FST及显著性见表 3FST除了群体B与其他群体之间为显著(但数值较小)之外,其余两两群体间的FST均为很小的值甚至是负值,且统计检验不显著。随机交配假设检验的显著性(表 4)显示大部分群体间符合单倍型随机分布的假设,虽然B群体偏离假设,但整体样本的检测结果(P=1.00)表明南海圆舵鲣符合随机交配群的假设,与AMOVA结果一致。

    表  2  圆舵鲣5个地理群体D-loop区遗传变异的分子方差分析
    Table  2  Analysis of molecular variance for five populations of A.rochei based on D-loop sequences
    变异来源
    source of variation
    自由度
    degree of freedom
    变异百分比
    percentage of variation
    分化系数
    F statistics
    P
    P value
    群体间  among populations 4 1.67 FST = 0.016 74 0.000 50
    群体内  within populations 173 98.33
    所有样本  total 177
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    表  3  圆舵鲣两两地理群体间D-loop区的遗传分化系数(对角线下方)及显著性水平(对角线上方)
    Table  3  Pairwise FST (below diagonal) and P values (above diagonal) among geographic populations of A.rochei based on D-loop sequences
    A B C D E
    A 0.004 36 0.056 23 0.327 59 0.429 86
    B 0.036 45 0.001 09 0.002 48 0.005 35
    C 0.015 65 0.033 77 0.847 24 0.336 11
    D 0.002 12 0.034 59 -0.007 26 0.645 38
    E -0.000 13 0.033 57 0.001 82 -0.003 69
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    表  4  圆舵鲣两两地理群体间随机交配假设检验的显著性水平
    Table  4  P values of exact test of sample differentiation of A.rochei based on D-loop haplotype frequencies
    A B C D
    B 0.000 01
    C 1.000 00 0.000 01
    D 0.128 85 0.000 01 0.128 70
    E 1.000 00 0.001 60 1.000 00 0.112 95
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    利用D-loop序列单倍型基于邻接法(NJ)构建的南海圆舵鲣的系统发育树见图 2。每个采样点的单倍型均广泛分散于系统树的各个分支,系统树的拓扑结构很浅并且大部分分支的支持率(自展值)均不高,未形成分化显著的支系结构。

    图  2  圆舵鲣D-loop区单倍型邻接系统发育树
    每一枝的末端代表单倍型来源群体;各分支标记大于70%的自展值
    Fig. 2  Neighbor-joining tree for D-loop haplotypes of A.thazard
    The tails of branches represent the populations for each haplotypes. Bootstrap supports of >70% are shown at nodes.

    从核苷酸不配对分布的参数估算(表 5)可见,圆舵鲣样本总体的吻合度检验的HRI值不显著(P>0.05),表明核苷酸不配对分布符合假设(Rogers and Harpending的种群扩张模型)。总体样本两两序列差异与发生频率的关系图(图 3)显示,核苷酸不配对分布呈明显的单峰分布,且观测值与突然扩张模型下的期望值非常吻合,表明种群在历史上经历过快速扩张。中性检验的Tajima′s D值为不显著的微小负值,但Fu′s FS值在所有群体中均呈现极显著或显著的负值(表 6),显著偏离中性理论下的Wright-Fisher模型,同样表明南海圆舵鲣经历过种群的扩张事件。根据扩张时间参数(τ)的观测值21.8,估算出种群的扩张时间约发生在22万~73万年前。

    表  5  圆舵鲣D-loop区序列核苷酸不配对分布分析的参数估计值
    Table  5  Mismatch distribution parameter estimates for A.rochei based on D-loop sequence
    核苷酸不配对分布  mismatch distribution 吻合度检验  goodness-of-fit test
    扩张时间
    τ
    初始值
    θ0
    最终值
    θ1
    平方和
    SSD
    显著性
    P
    粗糙指数
    HRI
    显著性
    P
    A 21.7 0.003 52 248.325 00 0.001 82 0.817 20 0.003 80 0.926 20
    B 19.8 3.636 91 152.992 97 0.004 68 0.202 30 0.011 64 0.016 80
    C 21.3 0.047 46 387.304 30 0.001 53 0.713 70 0.004 09 0.710 80
    D 22.7 0.007 03 189.716 41 0.001 71 0.740 30 0.004 31 0.653 60
    E 19.9 0.451 76 703.750 00 0.001 40 0.818 30 0.004 54 0.735 10
    总计  total 21.8 0.029 88 219.521 48 0.000 37 0.680 50 0.001 35 0.831 20
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    图  3  圆舵鲣D-loop区序列单倍型核苷酸不配对分布曲线
    Fig. 3  Mismatch distribution of D-loop haplotypes for A.rochei
    表  6  圆舵鲣D-loop区序列的Tajima′s D和Fu′s FS统计值及显著性水平
    Table  6  Tajima′s D, Fu′s FS statistics, corresponding P values for A.rochei based on D-loop sequences
    Tajima′s D Fu′s FS
    D P FS P
    A -0.858 93 0.208 60 -15.264 13 0.000 40
    B -1.044 75 0.145 60 -7.948 97 0.022 00
    C -1.170 23 0.113 00 -20.597 32 0.000 01
    D -0.851 71 0.203 60 -13.510 01 0.000 80
    E -0.840 11 0.209 60 -17.268 99 0.000 01
    总计  total -1.215 72 0.089 00 -23.701 30 0.003 60
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    物种的遗传多样性是其生存适应和进化的前提,也是评价物种资源状况和进行合理利用的重要依据。在渔业资源开发和管理中,对其遗传多样性水平的监测是不可忽视的部分。遗传多样性的下降会降低鱼类对不良环境的适应力,威胁到种群的可持续性发展[3]。该研究检测到南海海域圆舵鲣具有很高的单倍型多样性(h=0.997 2)和较高的核苷酸多样性(π=0.036 8),与同样基于D-loop序列分析的南海其他鱼类相比较,遗传多样性水平与扁舵鲣(h=0.999 5;π=0.019 1)[14]、短尾大眼鲷(Priacanthus macracanthus)(h=0.990 3;π=0.094 2)[30]和红鳍笛鲷(Lutjanus erythropterus)(h=0.997 0;π=0.030 0)[31]相当,明显高于黄斑胡椒鲷(Plecto-rhinchus flavomaculatus)(h=0.665 5;π=0.005 4)[32]。南海海域圆舵鲣丰富的遗传多样性可能与其繁殖较快、资源量和有效群体较大并且受到的捕捞压力较小有关。其种质资源良好,体现出较强的环境适应能力和进化潜力[33]

    南海圆舵鲣中性检验的Tajima′s D值虽不显著,但对种群扩张非常敏感的Fu′s FS检验产生了绝对值较大的负的FS值,且所有群体和整体的FS值在统计意义上均为显著或极显著水平,表明其显著偏离稳定种群模型。核苷酸不配对分布的单峰形曲线同样表明南海圆舵鲣历史上曾经历过种群的快速扩张,时间约发生在22万~73万年前(更新世晚期)。第四纪晚期,西太平洋的边缘海受冰期—间冰期交替气候的影响[34],海平面反复升降[35],在更新世冰期,南海海平面下降变成一个封闭的内陆海[36],圆舵鲣栖息地缩小。随后的间冰期海平面上升,圆舵鲣可能在较大的范围发生重新殖化,种群得以迅速扩张。

    种群是渔业资源开发和管理的基本单位。鱼类种群遗传结构的研究有助于种群的判定和合理划分渔业管理单元,指导可持续发展的渔业资源开发。南海圆舵鲣样本单倍型的系统发生关系分析显示不存在显著遗传分化的支系,地理群体的AMOVA也未发现明显的种群遗传结构。整体样本FST仅为0.016 74,依据FREELAND[37]和WRIGHT[38-39],遗传分化系数FST < 0.05表明群体间无遗传分化;基因流>4,群体就是一个随机的单位。该研究中南海圆舵鲣FST为0.016 74,个体间基因流高达14.68,表明群体间基因流动相当强烈,是一个随机交配的单一种群(unit population)。

    在缺乏阻碍扩散因素的海洋环境中,许多生物的浮游性卵、幼体和成体可以借助洋流扩散,使群体间产生频繁的基因交流,从而导致海洋生物在较大的地理尺度内呈现很低的遗传分化[40-42]。圆舵鲣是一种洄游性很强的中上层鱼类,成体的移动范围很大。产卵场遍布南海北部[12, 43],中沙、西沙和南沙等岛礁浅海水域[44-45],卵和仔稚鱼可随季风主导的海洋环流、水平环流、沿岸流[46-47]及部分区域的上升流等海流而扩散,从而形成基因交流和遗传均质化。依据LAIKRE等[1],这种非分化种群(no differentiation),在渔业开发和管理上可视为一个管理单元(management units,MUs)。然而,南海海域仅仅是圆舵鲣的部分分布区,其很可能与相邻海域分布的个体同属一个种群。今后需要通过扩大研究范围,结合更多的标记如SSR、SNP等分析技术全面评估圆舵鲣的种群遗传结构,为渔业管理措施的制定提供支撑。

  • 图  1   不同运输密度对尖吻鲈幼鱼运输水质和复苏率的影响

    不同字母表示数据间有显著性差异 (P<0.05);后图同此

    Figure  1.   Effect of different transport density on transport water quality and resuscitation rate of juvenile L. calcarifer

    Values with different superscripts are significantly different (P<0.05); the same case in the following figures.

    图  2   不同运输时长对尖吻鲈幼鱼运输水质的影响

    Figure  2.   Effect of different transport duration on transport water quality of juvenile L. calcarifer

    图  3   不同运输密度和运输时长对尖吻鲈幼鱼总超氧化物歧化酶、过氧化物酶活性及丙二醛质量摩尔浓度的影响

    Figure  3.   Effect of transportation density and duration on T-SOD, POD activity and MDA content of juvenile L. calcarifer

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  • 收稿日期:  2020-08-13
  • 修回日期:  2020-11-22
  • 网络出版日期:  2020-12-07
  • 刊出日期:  2021-04-04

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