斑点叉尾鮰 (Ictalurus punctatus) 原产于北美洲，于1984年引入我国，具有生长快、适应性强、肉质鲜美和少刺等优点。自1987年我国突破了斑点叉尾鮰人工繁育技术之后，其养殖面积和产量均持续增加，目前已成为我国重要的特色淡水鱼类品种，深受生产者与消费者喜爱^[1]。

养鱼先养水。施肥是提高水产养殖产量的有效措施^[2]。施肥提升了养殖池塘内浮游植物的总量，提高了养殖池塘的初级生产力，并通过食物链向上传导，丰富了浮游动物的生物量，最终被养殖鱼类摄食，提高了养殖鱼类的生物量^[3]。无机肥以氮 (N) 、磷 (P) 为主，不必经过细菌分解，可直接被浮游生物吸收。有机肥为细菌生长提供基质，可为浮游植物提供养分，或被浮游动物消耗。已有研究表明，在鱼塘中施用N、P、钾 (K) 肥，显著提高了池塘中浮游动物的产量，且对水化学无显著影响^[4]。而有机肥含有次生和微量营养素，使用后能够增加水体中的N、五氧化二磷 (P₂O₅)和氧化钾 (K₂O) 的含量，刺激浮游植物的响应，从而提高池塘的养殖产量^[5]。

肠道微生物以宿主肠道作为栖息地，在宿主的免疫、代谢等多种生命活动中发挥重要作用^[6]。与畜禽动物相比，水生动物消化道短，肠道菌群极易受环境因子影响，从水环境中获取的细菌群落是影响其肠道菌群结构的主要因素，对早期肠道菌群的形成至关重要^[7-8]，因此，鱼肠道微生物群的变化与环境微生物和摄食密切相关。施肥能够调节鱼类生活环境中微生物群落的组成，通过宿主与微生物之间的相互作用，在鱼类生长发育过程中，影响其肠道菌群的变化^[9-10]。发酵有机肥增加了草鱼 (Ctenopharyngodon idellus) 肠道菌群中芽孢杆菌 (Bacillus) 和乳酸乳球菌 (Lactococcus) 的含量，前者有助于肠道菌群的繁殖并维持肠道微生物平衡，抑制病原菌生长，后者则对肠道中酸性环境的耐受力较高，两者均能促进水生动物的健康生长^[11]。

合理施肥能有效降低饵料系数、减少饲料成本并提高养殖效益。施肥不仅可为水产动物提供天然饵料，也实现了绿色环保和资源的高效利用。Mischke和Zimba^[12]研究了施肥后斑点叉尾鮰养殖池浮游生物的变化，发现施肥池中桡足类幼体和成虫数量有所上升，且无机肥池中的枝角类数量显著高于有机肥池，进一步证明施用不同种类的肥料对浮游动物的群落组成和丰度有不同影响。目前，施用不同种类肥料对斑点叉尾鮰肠道菌群的影响情况尚未见报道。本研究在前人基础上，通过16S rRNA扩增技术，研究了施肥对斑点叉尾鮰肠道微生物群的影响，以期探索斑点叉尾鮰的绿色、经济养殖模式，并为其养殖过程的施肥管理提供指导与依据。

1.   材料与方法

1.1   实验设置与饲养管理

实验在江苏省淡水水产研究所国家级斑点叉尾鮰遗传育种中心扬中基地进行。选择户外标准化水泥池12个 (规格3 m×3 m×1.2 m)，使用100 mg·L⁻¹的高锰酸钾溶液浸泡消毒后，加水至水深0.7 m并安置气头，保证水泥池内溶解氧充足。实验设为对照组 (D) 、无机肥组 (W) 与有机肥组 (Y)，每组设置4个平行。

实验开始时，参照Mischke^[13]的方法分别在无机肥组 (W) 和有机肥组 (Y) 水泥池中施用无机肥与有机肥。无机肥料为尿素 [江苏灵谷化工集团有限公司，总磷 (Total phosphorus, TP) 质量分数≥46%]以及复合肥 (河南保利化肥有限公司，N∶P₂O₅∶K₂O=16∶16∶16，质量比)，首周每日施加55 g复合肥和22 g尿素 (N∶P =10∶1，质量比)，肥料用水溶开后泼洒全池，第2周用量减半，施肥2次。有机肥为多功能生物I型水产专用肥 (江苏立华生物肥料有限公司，总养分质量分数≥5%，有机质质量分数≥54%)，按照用量说明每口水泥池施用1 kg，肥料颗粒用水溶开后，全池均匀泼洒，第2周同剂量施肥1次。2周后，每个水泥池内放入20尾斑点叉尾鮰鱼种 (平均20.96 g·尾⁻¹)，每日早晚投喂2次漂浮性颗粒配合饲料 (蛋白质质量分数为35%)，饲料日投喂量约为鱼体质量的4%。

养殖为期3个月，期间无需换水加水，后期实验组水体出现轻微蓝藻现象。实验结束后，排干池水收集各组实验鱼，实验期间鱼未出现死亡情况。

1.2   样品采集与处理

养殖实验结束后，禁食24 h，进行采样，每组第1口水泥池随机捕捞10尾个体进行解剖，检查肠道内容物情况，之后每组剩下的2口水泥池中随机捕捞5尾个体进行解剖。解剖前将所用器具用酒精消毒，用解剖剪取出肠道后置于解剖盘中，酒精棉擦拭肠管外壁后，收集肠道内容物，5尾个体样本混合均匀为1个样本，共获得12个肠道内容物样品。液氮速冻并 −80 ℃超低温冰箱保存备用。利用E.Z.N.ATM Water DNA Kit (Omega，美国) 试剂盒提取肠道微生物DNA，使用引物为338F和806R，扩增16S rRNA基因V3—V4高变区，PCR产物经quick Gel Extraction Kit (Qiagen，德国) 试剂盒纯化后，使用Illumina TruSeq Nano DNA LT Library Prep kit试剂盒构建文库，并用Illumina HiSeq2500 (Illumina，美国) 平台测序，建库及测序数据在上海美吉生物医药科技有限公司完成。有机组中有1组样本的DNA未提取成功，未能进行后续建库和测序实验。

1.3   数据分析

使用Trimmomatic和Flash软件对数据进行质控并用序列拼接。使用UPARSE软件 (7.1) 将序列以97%的相似性进行聚类分析。利用Mothur软件 (V1.30.2) 与非度量多维尺度分析 (Non-metric multidimensional scaling, NMDS) 分别评估微生物群落的α多样性和β 多样性。利用RDP classifier (V2.2) 对序列进行物种分类注释，统计微生物分类水平的组成。利用线性差异判别分析 (Linear discriminant analysis, LDA)，比较3组间具有显著性差异的菌群。

实验数据以“平均值±标准差 ($\overline { x}\pm s $)”表示，采用SPSS软件作单因素方差分析 (One-way ANOVA)，显著性水平α为0.05。

2.   结果

2.1   测序数据评价

如图1所示，本实验中各样本的物种数目饱和度稀释曲线均趋向平坦，因此目前的操作分类单元 (Operational taxonomic unit, OTU) 数量可以代表各组的微生物信息。本实验测序样品coverage指数值均大于99%，测序结果可反映出斑点叉尾鮰肠道微生物群的真实情况。

图  1  物种数目饱和度稀释曲线图

Figure  1.  Species saturation rarefaction curves

下载: 全尺寸图片 幻灯片

2.2   多样性指数分析

韦恩图能够反映不同样品拥有的物种数目以及各组之间的相似性及重叠情况。如图2所示，无机肥组、有机肥组和对照组共具有2 560个OTUs，其中3组共有的OTUs为176个；无机肥组共有1 009个OTUs，独有256个；有机肥组共有730个OTUs，独有374个；对照组共有1 863个OTUs，独有1 064个。

图  2  不同施肥组下的斑点叉尾鮰肠道微生物OTUs

Figure  2.  OTUs of intestinal microorganisms of I. punctatus in different fertilization groups

下载: 全尺寸图片 幻灯片

3组斑点叉尾鮰肠道菌群的MiSeq测序结果如表1所示，不同的施肥组显示出α多样性指数的差异性，对照组Chao和Ace指数最大，则对照组斑点叉尾鮰肠道菌丰富度最高，其次是有机肥组，无机肥组群落丰度最低；对照组Shannon值最大，Simpson值最低，则对照组群落多样性最高，有机肥组群落多样性最低，但3组之间差异不显著 (p>0.05)。

表  1  3组斑点叉尾鮰肠道微生物α多样性指数均值

Table  1.  Mean value of α diversity index of intestinal microbiome of I. punctatus in three groups

组别 Group	多样性指数 Diversity index
	Simpson	Shannon	Ace	Chao
对照组 D	0.035±0.045	4.862±1.196	679.846±263.442	668.269±281.502
有机肥组 Y	0.135±0.119	3.290±1.580	568.081±332.606	535.854±384.311
无机肥组 W	0.146±0.178	3.634±1.576	462.356±202.398	457.314±218.034

下载: 导出CSV 

| 显示表格

NMDS结果展示了3组斑点叉尾鮰肠道菌群的β多样性。由图3可见，所有组别可以明显区分，这表明3组菌群的组成之间具有显著性差异，与施肥组相比，对照组的样本之间聚类更近，表明其微生物群落也更相似 (r²=0.5275, p=0.025)。NMDS分析的stress值为0.034，表明排序结果相对可靠。

图  3  斑点叉尾鮰肠道菌群NMDS分图

Figure  3.  NMDS analysis of intestinal bacterial communities of I. punctatus

下载: 全尺寸图片 幻灯片

2.3   肠道微生物菌群落组成分析

2.3.1   门水平肠道菌群组成均值与显著性差异比较

在门水平上对斑点叉尾鮰肠道菌群进行分析，物种测序注释结果如图4所示。在3组斑点叉尾鮰肠道微生物菌群中，主要菌群均包括厚壁菌门、变形菌门、拟杆菌门、放线菌门、蓝藻门和绿弯菌门，其余门相对丰度较低，其中，厚壁菌门、变形菌门、拟杆菌门是3组的优势菌群。无机肥组和有机肥组的厚壁菌门与拟杆菌门的比值分别为4.14和2.99，相较对照组 (2.72)，施肥组中该比值具有上升趋势；对照组和水体中的变形菌门丰度最高。经差异性分析 (图5)，对照组中的变形菌门、放线菌门和梭杆菌门的相对丰度显著高于施肥组，比例分别为26.4%、20.2%和1.8%。其中，放线菌门的组间差异性较为显著 (p<0.01)。

图  4  不同施肥条件下斑点叉尾鮰肠道微生物在门水平的菌群丰度

Figure  4.  Relative abundance of species of intestinal bacterial communities in I. punctatus on phylum level under different fertilization conditions

下载: 全尺寸图片 幻灯片

图  5  不同施肥条件下斑点叉尾鮰肠道微生物在门水平组间的显著性差异

注：* 表示p<0.05；** 表示p<0.01。

Figure  5.  Significance of intestinal bacterial communities in I. punctatus on phylum level

Note: *. p<0.05; **. p<0.01.

下载: 全尺寸图片 幻灯片

2.3.2   属水平肠道菌群组成均值与显著性差异比较

在属水平对斑点叉尾鮰肠道微生物群落的分析表明，3组肠道菌群群落组成存在明显差异 (图6)。有机肥组的优势菌属为罗姆布茨菌属 (Romboutsia)、梭状芽孢杆菌属 (Clostridium)、苏黎世杆菌属 (Turicibacter) 及拟杆菌属 (Bacteroidales)，无机肥组的优势菌属为罗姆布茨菌属、苏黎世杆菌属和乳酸菌属 (Lactobacillus)，对照组中的菌群均以未分类的其他菌属为主。在属水平中的显著性差异结果显示 (图7)，对照组中的梭菌属 (Fusobacterium) 相对丰度显著高于施肥组 (p<0.05)，而无机肥组中的链球菌属 (Streptococcus) 相对丰度远高于对照组 (p<0.05)，比例约为18%。

图  6  不同施肥条件下斑点叉尾鮰肠道微生物在属水平的菌群丰度

Figure  6.  Relative abundance of species of intestinal bacterial communities in I. punctatus on genus level under different fertilization conditions

下载: 全尺寸图片 幻灯片

图  7  不同施肥条件下斑点叉尾鮰肠道微生物在属水平组间的显著性差异

注：* 表示p<0.05；** 表示 p<0.01。

Figure  7.  Significance of intestinal bacterial communities in I. punctatus on genus level

Note: *. p<0.05; **. p<0.01.

下载: 全尺寸图片 幻灯片

2.4   菌群差异性分析

将3组斑点叉尾鮰肠道菌群样本进行线性判别分析 (Linear discriminant analysis, LDA)，进一步探究施肥对斑点叉尾鮰肠道菌群的影响，LDA判别值大于4的细菌类群列举分析，如图8所示，3组间共有不同分类水平的18个细菌类群存在显著性差异 (p<0.05)。其中，有机肥组的优势菌群集中于厚壁菌门、梭状芽孢杆菌属、梭菌科及盖丝藻科；无机肥组显著性优势菌群集中于乳酸菌目和其下的科属以及厚壁菌门下的芽孢杆菌科；对照组显著性优势菌群则包括放线菌门、诺卡氏菌科、分枝杆菌科、芽孢杆菌目和微球菌目等。

图  8  不同组间差异性菌群多物种线性差异判别分析

Figure  8.  Discriminant analysis of multispecies linear difference of different flora

下载: 全尺寸图片 幻灯片

3.   讨论

鱼塘施肥一直用于提供浮游生物生长所需的基本营养成分，初级生产力的增加通常会产生更多的浮游动物与细菌，间接为水生动物提供营养物质，促进水生动物的消化，同时影响肠道菌群的变化^[14-15]，肠道菌群的多样性和丰度则与宿主的生长和发育密切相关。本研究中，不同的肥料显著改变了斑点叉尾鮰肠道菌群的多样性和结构，多样性结果显示对照组的丰度和多样性高于无机肥组与有机肥组。这与有机肥能够促进凡纳滨对虾 (Litopenaeus vannamei) ^[16]、海鲈 (Dicentrarchus labrax) ^[17]肠道菌群丰度与多样性的研究结果有所不同。造成这一差异的原因可能有：1) 施肥增加了水泥池中的N、P元素，浮游植物作为水体中的初级生产力，N、P是限制浮游植物繁殖的主要因素，过量的N、P和硅 (Si) 相互作用，会对生态结构产生不利影响；严重时会限制降低浮游植物的光合能力、生长和净初级产量，从而在更大程度上抑制浮游生物生长 ^[18-20]，造成浮游动物生物量下降，经食物链向上传导后，导致施肥组的斑点叉尾鮰肠道菌群的丰度与多样性下降。2) 与对照组相比，施肥组的池中出现了明显的蓝藻，有研究表明过量施肥易造成水中N和P的积累，增加蓝藻水华的发生概率，改变水体中生物群落的结构分布与多样性^[21]，因此导致水泥池中的生物饵料丰度与多样性降低，从而影响斑点叉尾鮰的肠道菌群。3) Mischke和Zimba^[13]研究指出，由于鱼池施肥后3~4周内产生了大量的桡足类和枝角类供鱼食用，其余浮游动物群落却无明显变化，导致水体中的浮游动物变得较为单一，斑点叉尾鮰摄入后，其肠道菌群多样性与丰度也因此降低。

熊向英等^[22]研究指出，斑点叉尾鮰肠道中的主要菌群是厚壁菌门、拟杆菌门和梭杆菌门。Larsen等^[23]研究发现，在斑点叉尾鮰的肠道菌群结构中，梭杆菌门的丰度占比居主导地位，这与本研究的结果不同。本研究中梭杆菌门的占比较小，且变形菌门为优势菌门，造成差异的原因可能是养殖环境不同。目前也有研究证实了这一点，Wang等^[24]在水箱中养殖斑点叉尾鮰，发现梭杆菌门成员的相对丰度从40.8%下降到9.8%。本研究结果与该研究中斑点叉尾鮰肠道中梭杆菌分类群的相对丰度均低于先前报道的土池养殖结果 (最高达94%)^[23]。

有研究发现，厚壁菌门可通过分解纤维素，产生挥发性脂肪酸，促进蛋白质的消化，提高宿主的营养利用率，维持肠道微生物生态平衡^[23]，拟杆菌门与糖类代谢和运输相关，能够高效利用低碳物质，为宿主提供能量，促进宿主生长^[25-26]，厚壁菌门与拟杆菌门的比值与脂质代谢呈正相关^[27]。与对照组相比，施肥组斑点叉尾鮰中的厚壁菌门丰度显著增加，则厚壁菌门与拟杆菌门的比值较对照组有所上升；这是由于施肥后水体中的生物饵料增加，因而促进了斑点叉尾鮰的生长，同时增加了鱼类脂肪，进一步证明施肥在肠道消化代谢运输的功能中表现更为突出，这与上述报道结果一致，同时与本研究设置实验组所预测分析的结果一致。变形菌门为条件致病菌，与肠内氧气、药物、炎症以及饮食的作用相关^[28]，放线菌是维持肠道屏障稳态的参与者^[29]。本研究中，经施肥后养殖的斑点叉尾鮰肠道中的变形菌门显著降低，推测施肥后的养殖环境在一定程度上减小了斑点叉尾鮰的患病风险。在施肥组中，无机肥组中的放线菌门显著高于有机肥组，表明无机肥比有机肥更能对肠道菌群在维持肠道屏障功能、增加紧密连接表达、调节黏蛋白生物合成和分解代谢及为上皮细胞增殖提供能量等方面起积极作用。

链球菌属的宿主分布范围较广，具有较强的致病性，在人、畜、水产动物间均可传播。1976年Pier和Madin^[30]从亚马逊河海豚 (Inia geoffrensis) 皮下的化脓灶内中首次分离到海豚链球菌 (S. iniae)。1991年，Chang和Plumb^[31]首次从斑点叉尾鮰体内分离到β-溶血性链球菌 (S. hemolytis-β)，表明了链球菌对斑点叉尾鮰具有致病性。Shewmaker等^[32]经杂交分析，从斑点叉尾鮰体内发现了鮰链球菌 (S. ictaluri)，链球菌则成为斑点叉尾鮰暴发性疾病的病原之一^[33-34]。本研究中，无机肥组的链球菌显著上升，且高于对照组，这一现象的发生可能会影响斑点叉尾鮰最适宜的环境因素，从而导致细菌性疾病的多发，同时，这也显示了无机肥组的养殖环境可能会增加斑点叉尾鮰病害的发生几率。Trotter和Marshall^[35]利用海豚链球菌的生物学特性，调节罗非鱼 (Oreochromis spp.) 的养殖水环境，有效地杀灭了水体中的海豚链球菌。然而，目前关于无机肥影响水体中链球菌属的机制尚不明确，实验中也并未出现鱼体大量死亡的现象，该现象产生的原因仍需进一步挖掘。

梭菌属被认为是淡水鱼类肠道菌群的优势菌属，有研究表明，其具有发酵多肽碳水化合物的能力，能高效分泌维生素、乙酸，以辅酶的形式参与核酸合成以及碳水化合物、脂肪和氨基酸的代谢^[36]。在菌群差异性分析中，有机肥组中梭菌科含量较为显著，本研究表明有机肥的增加对促进斑点叉尾鮰食欲与生长有一定作用。乳酸菌是水生动物肠道中的重要益生菌，在肠道繁殖过程中能够提高肠道菌群的多样性，有效抑制有害菌的入侵与生长，同时在宿主的免疫功能中发挥着重要作用^[37]。与对照组和有机肥组相比，乳酸菌目及其下的科、属已成为无机肥组斑点叉尾鮰肠道菌群中的优势菌，进一步证实了无机肥对调节水生动物的肠道健康影响显著。本研究在对养殖水泥池施肥后发现，施肥并未极大地改变斑点叉尾鮰肠道内的优势菌群，但菌群的比例发生了变化，在一定程度上促进了斑点叉尾鮰的健康生长。因养殖环境不同，本研究结果与已有研究结果存在差异，且养殖环境是苗种培育池，规模和尺度相对偏小，养殖密度也远低于常规养殖的载鱼量。因此，后续还需进一步开展养殖池塘条件下的施肥对斑点叉尾鮰生长和肠道菌群的影响研究，以更加准确地指导斑点叉尾鮰养殖过程中的施肥管理。

4.   结论

本研究通过16S rRNA 扩增子测序技术分析检测3组斑点叉尾鮰肠道菌群，结果发现施肥在一定程度上影响了斑点叉尾鮰肠道菌群的数量与结构，施用无机肥增加了斑点叉尾鮰肠道内的乳酸菌属，有机肥则有效抑制了链球菌的数量，2种肥料均促进了斑点叉尾鮰的生长与发育，并在一定程度上降低了斑点叉尾鮰的患病风险。因此，建议养殖中同时施用有机肥与无机肥，以发挥浮游生物的潜在优势，促进鱼类健康生长，同时也为优化与调整斑点叉尾鮰绿色健康的养殖方案提供参考。