Preparation and characteristic research of immobilized patatin lipase suitable for fish oil processing
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摘要: Patatin (马铃薯糖蛋白) 是一种酯水解酶，具有脂肪酶催化活性，可应用于脂肪的水解加工。针对游离Patatin酯酶稳定性差且工业生产中酶很难重复利用的缺点，利用ConA (刀豆蛋白A) 耦联的纳米磁珠材料固定化Patatin酯酶，以提高其工业化应用的催化特性。通过研究，发现ConA耦联的纳米磁珠的平均吸附率为24.50%。同时筛选出适宜的Patain酯酶固定化材料为PAA (聚丙烯酸)-Fe3O4，其最优固定化条件为固定化时间47.2 min，固定化温度25.3 ℃，磁珠添加量为3.0 mg·mL−1。Patain酯酶固定化纳米磁珠在40.0 ℃、pH 7.0时水解底物活性最高，且相比游离Patatin酯酶，其温度耐受性提高了123%左右，pH耐受性提高了47%左右，连续反应5次后仍保留56.60%酶活力，说明纳米磁珠固定化后提高了Patatin酯酶的酶催化特性，为其在水产品如鱼油中的加工应用提供了一种催化性能更强的新酶体系。Abstract: Patatin, an ester hydrolase with lipase catalytic activity, can be applied to the hydrolysis of fat. To solve the problems of poor stability of free patatin lipase and difficult reuse in industrial production, we immobilized patatin lipase by coupled nano (ConA) magnetic beads to improve its catalytic characteristics of its industrial application. The results show that the average adsorption rate of ConA magnetic beads was 24.50%, and PAA-Fe3O4 was determined as the most suitable immobilization material. The optimal immobilization conditions are as follows: immobilization time of 47.2 min, immobilization temperature of 25.3 ℃, magnetic bead addition of 3.0 mg·mL−1. Immobilized patain had the highest hydrolytic substrate activity at 40.0 ℃ and pH 7.0. Compared with free patatin lipase, its temperature tolerance increased by about 123% and the pH tolerance increased by about 47%. After five consecutive reactions, 56.60% patatin activity was still retained, indicating that the immobilized nano magnetic beads improved the enzymatic catalytic characteristics of patatin, which provides a new enzyme system with stronger catalytic performance for its application in the processing of aquatic products such as oil fish.
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Keywords:
- Patatin /
- Lipase /
- Immobilization /
- Enzyme catalytic properties
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大亚湾位于珠江口东侧，三面环山，为半封闭海湾，区域面积约600 km2，是我国南海北部重要的生物种质资源自然保护区之一。湾内岛屿众多，局部海域有海藻、珊瑚及人工鱼礁分布，生境复杂多样。目前，有关大亚湾鱼类资源与多样性评价方面的研究已有诸多报道。张敬怀等[1]基于大亚湾2004—2015年底拖网调查数据，研究分析了该海域物种组成及多样性时空变化；陈应华等[2]基于大亚湾大辣甲南人工鱼礁投放前后鱼类资源密度与优势种类组成的变化，初步评价了该海域人工鱼礁区建设效果；李娜娜等[3]运用声学方法对大亚湾杨梅坑水域生物资源量进行了科学评估；陈丕茂等[4]研究了大亚湾杨梅坑人工鱼礁区的渔业资源变动规律。上述研究主要围绕鱼类物种组成、资源动态、时空分布及多样性差异等方面，且研究区域主要集中在湾内人工鱼礁区及其毗邻水域等特殊生境。对于游泳生物群落格局及其生态效应方面的研究鲜有报道。
群落是实现海洋生态系统物质循环与能量传递的重要结构与功能单元[5]。基于群落时空格局及其变动规律的研究，能够很好地反映其所处生态系统的状态与变化趋势[6-8]。如王雪辉等[9]运用聚类与排序方法研究了大亚湾鱼类空间格局，并进一步探讨了鱼类群落与水环境因子的响应关系。大亚湾湾口连通湾内与湾外，平均水深约20 m。该区域流速较快，水交换较为频繁。涨潮时，形成逆时针环流；退潮时，潮流经中央列岛东侧流出，形成顺时针环流。此外，该区域营养盐和饵料生物较为丰富，是诸多海洋生物索饵、产卵和育肥的优良场所[3]。然而，有关湾口游泳生物组成、时空变动规律及群落结构特征的研究尚未见报道。
本研究基于2015年大亚湾湾口渔业资源与生态环境调查资料，分析了该海域游泳生物的组成、资源变动与群落结构特征。在此基础上，利用生态学多元统计方法，探究了导致该海域游泳生物群落时空异质结构的主要生物/非生物因子，以期增加对大亚湾游泳生物资源现状与群落结构特征的认识，为改善该水域生态状况、恢复和发展渔业资源提供基础资料。
1. 材料与方法
1.1 数据采集与处理
本研究所用游泳生物群落和水环境数据主要来源于大亚湾湾口区域，取样位点分布见图1。调查时间为2015年4月、8月、10月、12月，分别对应春、夏、秋、冬四季。调查渔船功率为135 kW，船长15.5 m，宽5.6 m，排水量50 t；通过虾拖网进行游泳生物采样，网长4.8 m，网口宽2.6 m，网目3 cm × 3 cm。各位点拖网1次，拖网时长为20~40 min，拖网时速为5.4~7.2 km·h–1。受地形及海况等条件的限制，不同航次和位点渔获强度存在一定差异，但各航次采样位点均分布在大亚湾湾口区域，分别代表不同季节调查区域游泳生物的资源组成特征，因此各季节不同位点渔获数据可用于大亚湾湾口游泳生物资源与群落季节异质特征的研究。为消除差异化拖网时长和航速的影响，各采样位点游泳生物资源密度均以0.5 h时长和6 km·h–1航速进行标准化处理。渔获样品均现场分类处理，主要分为鱼类、头足类、虾类、蟹类和虾蛄类，其中虾类、蟹类和虾蛄类统称甲壳类，难以鉴定的种类低温冷冻保存，带回实验室鉴定。对渔获个体数少于50的种类全部取样；渔获个体数大于50的种类，则根据个体体长范围进行分组，各体长组按数量百分比随机取样，取够50尾。测量并记录渔获样本体长/叉长/胴长和体质量，体长精确至1 cm，体质量精确至1 g。
各位点于拖网前，分表、底层进行水样采集。主要测定参数包括水温(WT)、溶解氧(DO)、盐度(Sal)、叶绿素a (Chl a)、水体透明度(Tra)和pH。其中Tra用塞氏盘测定，同时记录水深；WT、DO、Chl a、pH和Sal用便携式多参数水质分析仪YSI6600测定。
1.2 数据分析
1.2.1 物种相似性
本研究采用Jaccard物种相似性指数[10]，分析调查水域不同季度物种组成的变化。计算公式为：Sj = j/(a+b–j)。式中a为第一季度物种数；b为第二季度物种数；j为不同季度共有物种数。Jaccard指数1.0~0.75说明鱼类群落组成极为相似；0.75~0.5群落组成中等相似；0.5~0.25群落中等不相似；0.25~0群落极不相似。
1.2.2 优势度
利用相对重要性指数(IRI)[11]对大亚湾湾口各季度游泳生物优势种类组成进行分析。计算公式为：IRI = (N+W)×F。式中N为某一种类的尾数占渔获总尾数的百分比；W为某一种类的质量占渔获总质量的百分比；F为某一种类出现的位点数占总调查位点数的百分比(即出现频率)。将IRI≥500的物种定为优势种，100≤IRI<500为常见种，10≤IRI<100为一般种，IRI<10为少见种。
1.2.3 资源密度估算
游泳生物资源量密度D (kg·km–2) 根据扫海面积法估算，计算公式为：D = Y/[A×(1–E)]。式中Y为平均渔获率(kg·h–1)；A为每小时扫海面积(km2·h–1)；E为逃逸率，本研究中取0.5。调查区域各个航次不同游泳生物类群资源密度为各调查位点资源密度的算术平均值。
1.2.4 多样性评价
α多样性指数是度量生物多样性高低及其空间分布状态的主要数值指标，被广泛用于群落结构的变化与水生态系统环境质量评价。当调查水域不同种类及同种类个体间差异较大时，用生物量表示的多样性更接近种类间能量的分布[12]。因此，本研究中调查海域生物多样性的评价主要基于渔获生物量数据。该海域生物多样性的评价主要基于Shannon-Wiener多样性指数(H′)和Simpson优势集中度指数(C)，其计算公式为：
$$ \begin{aligned} H' = - \mathop \sum \nolimits_{i = 1}^s {P_i}{\rm{ln}}{P_i} \\ \;\;C = \mathop \sum \nolimits_{{i}}^{{s}} {\left( {{P_i}} \right)^2}\quad\;\, \end{aligned} $$ 式中Pi为і种所占渔获中生物量的百分比，S为样方内物种数。
1.2.5 群落结构与稳定性
依据调查海域各位点游泳生物聚类(Cluster)与非度量多维标度排序(NMDS)分析结果，了解不同季度游泳生物群落结构特征；并通过SIMPROF检验其结构差异的显著性。在此过程中，为平衡优势种和稀有种权重的影响，首先对各位点游泳生物丰度进行log (x+1)转化，再根据转化结果计算位点间Bray-Curtis相似性系数。在此基础上，通过相似性百分比(SIMPER)分析，判别对群落组间差异性和组内相似性贡献率较大的关键生物。ABC曲线通过生物丰度与生物量的位置关系，可分析生物群落在不同干扰程度下的生态效应[13]。
1.2.6 群落生态效应
基于游泳生物群落去趋势对应分析(DCA)结果，确定调查海域游泳生物群落生态效应研究的最适方法。根据DCA分析结果，四轴中最大值超过4，则选择单峰模型(典范对应分析CCA)较合适；小于3则线性模型(冗余分析RDA)较合适；两者之间则2种模型均适应。研究发现，调查海域游泳生物DCA分析结果，四轴中最大值为2.442，因此选择线性模型(RDA)分析环境变量与游泳生物之间的效应关系较为适宜。
应用RDA方法探究调查海域游泳生物群落与环境因子间的关系。首先对游泳生物群落数据进行log (x+1)转换和中心化处理，并剔除游泳生物群落中相对重要性指数(IRI)小于100的种类，以降低极端值的权重[14]。进而运用Monte Carlo偏置换检验，通过逐步迭代的方式，筛选对游泳生物群落空间特征的解释有显著贡献的环境变量，最终分析得出关键物种对特定生境的效应关系。
1.3 统计分析与作图
游泳生物资源密度、多样性指数及环境因子的季节差异，通过SPSS 21.0单因素方差分析(One-Way ANOVA)进行检验。多样性评价、群落结构与生态效应分析分别通过Primer 6.0和Canoco 4.5实现。本研究中绘图软件主要包括Primer 6.0、Canoco 4.5、ArcGIS 10.2.2及Origin 9.0。
2. 结果
2.1 物种组成
调查海域2015年春、夏、秋、冬季4个航次共捕获各类游泳生物177种，其中鱼类118种、蟹类32种、虾类16种、头足类7种、虾蛄类4种(附录1，详见http://dx.doi.org/10.12131/20180246的资源附件)。春、夏、秋、冬季游泳生物物种数分别为66、100、69、71种，可见调查水域夏季游泳生物物种数明显高于其他季度。调查海域各季度游泳生物组成见图2，鱼类在各类游泳生物组成中所占比重最高，其次为蟹类和虾类，其他种类所占比重相对较低。
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图 2 大亚湾湾口2015年游泳生物百分比组成Figure 2. Percentage of nekton species at Daya Bay mouth in 2015本研究发现，调查海域2015年春、夏、秋、冬四季常见种类仅19种。根据Jaccard物种相似性研究结果(表1)，调查海域物种组成季节差异较大，季间物种相似性均在40%以下，其中秋季与夏季、冬季物种相似度相对较高(均为0.36)。整体上，调查海域游泳生物季间物种相似性处于中等不相似(0.5~0.25)和极不相似水平(0.25~0)。
表 1 大亚湾湾口2015年不同季节游泳生物Jaccard相似性指数Table 1. Jaccard similarity index of nekton at Daya Bay mouth in different seasons of 2015季节
season春季
spring夏季
summer秋季
autumn冬季
winter春季 spring 夏季 summer 0.27 秋季 autumn 0.29 0.36 冬季 winter 0.27 0.22 0.36 2.2 游泳生物资源密度季节变化
根据扫海面积法计算结果，调查海域春、夏、秋、冬季游泳生物资源量密度依次为1 536.4 kg·km–2、4 341.8 kg·km–2、1 634.1 kg·km–2、1 143.2 kg·km–2。各类游泳生物资源量密度详见表2。总体上鱼类资源密度相对较高，年均值为977.6 kg·km–2；其次为虾类和蟹类，年均质量密度分别为502.78 kg·km–2和439 kg·km–2；虾蛄类和头足类资源密度相对较低，年均值分别为175.63 kg·km–2和68.88 kg·km–2。单因素方差分析结果表明，夏季游泳生物资源量密度显著高于其他季节(F = 4.556, P = 0.01)。进一步分析发现，夏季鱼类资源密度显著高于其他季节(F = 10.323, P = 0.001)；而头足类(F = 0.346, P = 0.792)、虾蛄类(F = 2.559, P = 0.076)、虾类(F = 2.926, P = 0.052)和蟹类(F = 0.056, P = 0.982)资源密度季节差异不显著。
表 2 大亚湾湾口2015年游泳生物资源密度Table 2. Biomass density of nekton at Daya Bay mouth in 2015kg·km–2 季节
season头足类
Cephalopoda虾蛄类
Squilloidea虾类
Decapod蟹类
Crab鱼类
Fish春季 spring 41.2 225.5 67.6 399.4 802.7 夏季 summer 78.4 59.4 1 702.3 480.1 2 021.6 秋季 autumn 93.8 101.0 211.7 453.5 774.1 冬季 winter 62.1 316.6 29.5 423.0 312.0 2.3 优势度物种
基于相对重要性指数IRI研究结果(表3)，2015年春季，调查海域游泳生物优势种类主要包括二长棘鲷(Paerargyrops edita)等7种，累积数量和质量百分比分别为59.41%和40.61%。夏季优势种类主要有黄鳍马面鲀(Thamnaconus hypargyreus)等6种，累积数量和质量百分比分别为79.96%和49.42%。秋季优势种类主要有短吻鲾(Leiognathus brevirostris)等8种，累积数量和质量百分比分别为65.14%和62.26%。冬季优势种类主要包括拥剑梭子蟹(Portunus gladiator)和伪装关公蟹(Dorippe facchino)等7种，累积数量和质量百分比分别为59.93%和50.59%。综上可知：1)调查海域2015年各季节游泳生物优势种类存在较大差异。春季、夏季、秋季优势种类主要以鱼类为主，而冬季优势种类主要为甲壳类(蟹类、虾类、虾蛄类)。2)调查海域2015年各季节游泳生物个体差异较大。其中，夏季和春季优势种类数量百分比明显高于质量百分比，说明小型个体所占比重相对较高。
表 3 大亚湾湾口2015年游泳生物优势种类组成Table 3. Composition of dominant species of nekton at Daya Bay mouth in 2015季节
season种名
species数量比
N%质量比
W%频率
F%相对重要性指数
IRI春季 spring 二长棘鲷 Paerargyrops edita 31.6 15.6 100 4 717 口虾蛄 Oratosquilla oratoria 4.6 6.2 87.5 942 直额蟳 Charybdis truncatus 6.1 5.0 75 831 拟矛尾鰕虎鱼 Parachaeturichthys polynema 4.7 3.4 100 813 短脊鼓虾 Alpheus brevicristatus 6.8 2.1 87.5 780 隆线强蟹 Eucrate crenata 3.3 4.6 87.5 691 断脊口虾蛄 Oratosquillina interrupta 2.3 3.7 87.5 531 夏季 summer 黄鳍马面鲀 Thamnaconus hypargyreus 43.4 19.6 100 6 301 宽突赤虾 Metapenaeopsis palmensis 17.9 9.1 100 2 697 墨吉对虾 Penaeus merguiensis 6.3 13.7 57.1 1 142 侧线天竺鲷 Apogon lateralis 4.2 2.2 100 635 拥剑梭子蟹 Portunus gladiator 5.6 1.6 85.7 611 短吻鲾 Leiognathus brevirostris 2.6 3.4 100 593 秋季 autumn 短吻鲾 Leiognathus brevirostris 26.8 19.2 100 4 594 中线天竺鲷 Apogon kallopterus 13.1 3.8 87.5 1 472 红星梭子蟹 Portunus sanguinolentus 3.5 12.6 87.5 1 411 细条天竺鱼 Apogonichthys lineatus 10.3 3.7 87.5 1 228 墨吉对虾 Penaeus merguiensis 2.9 8.5 100 1 142 锈斑蟳 Charybdis feriatus 2.0 7.7 87.5 851 猛虾蛄 Harpiosquilla harpax 3.2 3.4 87.5 575 断脊口虾蛄 Oratosquillina interrupta 3.3 3.4 75 507 冬季 winter 拥剑梭子蟹 Portunus gladiator 19.0 5.0 100 2 394 伪装关公蟹 Dorippe facchino 15.2 11.8 87.5 2 364 断脊口虾蛄 Oratosquillina interrupta 7.4 9.4 100 1 682 杜氏枪乌贼 Uroteuthis duvauceli 6.7 10.4 75 1 280 猛虾蛄 Harpiosquilla harpax 4.2 6.5 75 804 口虾蛄 Oratosquilla oratoria 4.6 5.3 62.5 616 香港蟳 Charybdis hongkongensis 2.8 2.3 100 510 2.4 游泳生物群落特征
2.4.1 多样性水平
Shannon-Wiener多样性指数与Simpson优势集中度指数研究表明，调查海域不同季节生物多样性差异较小(图3)，但位点间差异明显(误差轴)。春、夏、秋、冬四季，Shannon-Wiener多样性指数分别为2.5、2.66、2.5、2.35；Simpson优势集中度指数分别为0.16、0.14、0.15、0.16。单因素方差分析结果表明，调查海域游泳生物Shannon-Wiener多样性指数(F = 0.597, P = 0.623)与Simpson优势集中度指数(F = 0.065, P = 0.978)季节差异均不显著。
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图 3 大亚湾湾口2015年游泳生物多样性差异误差线表示地理空间差异Figure 3. Diversity variation of nekton at Daya Bay mouth in 2015Error bar represents geographical spatial difference.2.4.2 稳定性评价
湾口海域2015年各季节游泳生物丰度和生物量ABC曲线见图4。春、夏两季游泳生物丰度曲线在生物量曲线之上，w值分别为–0.112和–0.145，且第一丰度优势种起点较高(约30%~40%)，说明调查海域游泳生物主要以小型个体为主，且群落在春、夏两季受外界干扰强度较大，群落结构稳定性较差，应多予以保护。秋季和冬季渔获丰度和生物量累积优势度曲线基本处于交错状态，其w值基本为0，说明秋、冬两季调查海域游泳生物个体相对较大，群落受外界干扰相对较小，群落结构相对稳定。
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图 4 大亚湾湾口2015年游泳生物群落ABC曲线Figure 4. ABC curve of nekton community at Daya Bay mouth in 20152.4.3 群落时空格局
Cluster (图5)与SIMPROF相似性检验显示，大亚湾湾口游泳生物群落结构季节差异显著(Pi = 9.3, P = 0.1%)；同一季节游泳生物群落空间差异较小，未表现出明显的空间格局。根据NMDS排序结果(图6)，2D Stress值为0.15，说明二维排序结果能较好地反映春、夏、秋、冬四季游泳生物群落结构特征。
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图 5 大亚湾湾口2015年游泳生物群落聚类分析Figure 5. Cluster analysis of nekton community at Daya Bay mouth in 2015![]()
图 6 大亚湾湾口2015年游泳生物群落NMDS分析Figure 6. NMDS analysis of nekton community at Daya Bay mouth in 20152.5 游泳生物群落生态效应
2.5.1 生物效应因子
根据SIMPER相似性百分比分析结果(表4)，湾口海域游泳生物群落空间相似性为43.4%~51%，季间特异性为69.13%~80.77%。群落空间相似性贡献率前三位的种类，春季为二长棘鲷、拟矛尾鰕虎鱼(Parachaeturichthys polynema)和口虾蛄(Oratosquilla oratoria)；夏季为黄鳍马面鲀、宽突赤虾(Metapenaeopsis palmensis)和远海梭子蟹(Portunus pelagicus)；秋季为短吻鲾、墨吉对虾(Penaeus merguiensis)和红星梭子蟹(Portunus sanguinolentus)；冬季为断脊口虾蛄(Oratosquillina interrupta)、拥剑梭子蟹和香港蟳 (Charybdis hongkongensis)。群落季间特异性贡献率位于前三位的种类，春夏为黄鳍马面鲀、侧线天竺鲷(Apogon lateralis)和隆线强蟹(Eucrate crenata)；春秋为二长棘鲷、墨吉对虾和红星梭子蟹；春冬为二长棘鲷、拥剑梭子蟹和棘突猛虾蛄(Harpiosquilla raphidea)；夏秋为二长棘鲷、宽突赤虾和侧线天竺鲷；夏冬为二长棘鲷、黄鳍马面鲀和侧线天竺鲷；秋冬为短吻鲾、墨吉对虾和中线天竺鲷(Apogon kallopterus)。
表 4 大亚湾湾口2015年游泳生物群落空间相似性与季节差异性贡献率位于前3位的种类Table 4. Top three species contributing to spatial similarity and seasonal dissimilarity of nekton community at Daya Bay mouth in 2015% 种类
species空间相似性贡献率
similarity contribution rate in space季节差异性贡献率
dissimilarity contribution rate among seasonsA B C D A&B A&C A&D B&C B&D C&D 51 48.21 48.06 43.40 73.50 76.05 75.75 69.13 80.77 69.96 二长棘鲷 Parargyrops edita 8.68 5.64 0 0 0.55 3.28 3.57 2.53 2.3 0 拟矛尾鰕虎鱼 Parachaeturichthys polynema 6.62 1.67 2.5 0.67 1.02 1.24 2.12 0.96 0.93 1.39 口虾蛄 Oratosquilla oratoria 6.13 1.46 3.23 3.59 1.34 1.47 1.77 1.27 1.3 1.85 黄鳍马面鲀 Thamnaconus hypargyreus 0 8.04 3.93 0 3.37 1.87 0 1.91 3.19 2.13 宽突赤虾 Metapenaeopsis palmensis 5.3 6.23 0 1.79 1.33 1.76 1.23 2.81 1.91 1.25 远海梭子蟹 Portunus pelagicus 4.54 5.99 0.31 0.33 0.94 2 2.17 2.16 1.99 1.32 短吻鲾 Leiognathus brevirostris 2.53 5.45 9.75 1.48 1.38 1.97 1.69 0.76 1.74 3.13 墨吉对虾 Penaeus merguiensis 0 1.81 8.91 0.77 1.82 3.29 0.83 1.87 1.69 2.89 红星梭子蟹 Portunus sanguinolentus 0 0.26 6.52 2.39 0.74 3 1.63 2.13 1.26 2.38 断脊口虾蛄 Oratosquillina interrupta 5.18 0.37 3.66 9.64 1.38 1.42 1.1 1.54 1.71 1.67 拥剑梭子蟹 Portunus gladiator 0 2.36 2.21 9.25 1.59 1.23 2.58 1.3 1.03 1.6 香港蟳 Charybdis hongkongensis 3.51 0 0.14 7.04 1.48 1.63 1.13 0.32 1.67 2.06 中线天竺鲷 Apogon kiensis 0 0 5.92 0 0 2.39 0 2.02 0 2.73 侧线天竺鲷 Apogon lateralis 0 5.3 0 0 2.37 0 0 2.46 2.24 0 隆线强蟹 Eucrate crenata 4.88 0 0 1.33 1.92 2.33 1.9 0 0.77 1.13 棘突猛虾蛄 Harpiosquilla raphidea 4.29 0 0 0 1.74 2.11 2.3 0 0 0 注：A、B、C、D分别为春、夏、秋、冬季
Note: A, B, C and D represent spring, summer, autumn and winter, respectively.2.5.2 非生物效应因子
大亚湾湾口主要水环境要素2015年各季节调查结果见表5。区域年均WT约23.76 ℃、Sal为34.96、Tra为3.85 m、pH为8.32、DO质量浓度为5.79 mg·L–1、Chl a质量浓度为1.96 μg·L–1。根据单因素方差分析结果，各水环境因子季节差异显著(P < 0.01)。
表 5 大亚湾湾口2015年主要水环境因子季节差异Table 5. Seasonal variation of main water environment factors at Daya Bay mouth in 2015环境因子
environment factor春季
spring夏季
summer秋季
autumn冬季
winterF P 温度/℃ WT 21.56 26.72 27.39 19.35 1 047.81 0.001 盐度 Sal 34.89 35.74 34.81 34.42 134.89 0.001 透明度/m Tra 5.69 3.43 3.98 2.31 5.76 0.004 pH 8.22 8.25 8.38 8.43 21.57 0.001 溶解氧/mg·L –1 DO 6.91 4.58 5.42 6.23 53.67 0.001 叶绿素a/μg·L–1 Chl a 2.39 2.82 1.75 0.89 4.94 0.007 RDA研究发现(图7)，轴1和轴2能较好地解释研究海域游泳生物群落季节异质特征及其与环境因子的对应关系。蒙特卡洛统计结果，进一步检验了其相关显著性(F = 5.823，P = 0.001)。轴1和轴2对游泳生物群落季节异质性的解释率分别为0.302和0.166；游泳生物群落与环境对应关系的解释率分别为0.51和0.279。夏季，游泳生物群落主要沿轴1正方向分布，代表生物主要包括黄鳍马面鲀和侧线天竺鲷等；冬季，游泳生物群落主要沿轴1负方向分布，代表生物主要包括断脊口虾蛄和猛虾蛄等；秋季，游泳生物群落主要沿轴2正方向分布，代表生物主要包括中线天竺鲷、细条天竺鱼和侧线天竺鲷等，主要与WT和pH正相关；春季，游泳生物群落主要沿轴2负方向分布，代表生物主要包括二长棘鲷和拟矛尾鰕虎鱼等。环境因子中Sal、DO、WT和Chl a主要与轴1相关，相关系数分别为0.87、–0.77、0.63和0.41；pH和Tra主要与轴2相关，相关系数分别为0.67和–0.31。
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图 7 大亚湾湾口2015年游泳生物群落与水环境因子RDA关系图sp1~sp21. 游泳生物种类；A1~D31. 各季度取样位点Figure 7. RDA ordination of nekton community and water parameters at Daya Bay mouth in 2015sp1–sp21. nekton species; A1–D31. sampling sites in each season3. 讨论
3.1 资源动态与多样性评价
渔业资源评估与动态监测旨在为渔业资源的保护和合理开发利用提供理论支持。本研究发现，大亚湾湾口夏季(8月)游泳生物密度明显高于其他季节，其中以鱼类和虾类资源较为丰富，而其他游泳生物类群(头足类等)季节差异不显著。这可能与我国南海伏季休渔政策相关(2015年调查海域休渔期为5月16日至8月1日)。诸多研究显示，伏季休渔政策能有效地缓解渔业资源衰退的局面，为鱼类等水生生物提供较稳定的繁殖、索饵与生长发育环境，进而达到资源保护与生态修复的目的。刘爱霞[15]研究发现，大亚湾2016年休渔期后渔业资源CPUE较休渔前明显上升。余景等[16]基于遥感数据定量评估了大亚湾2015年伏季休渔效果，研究发现休渔期后总渔获物CPUE从休渔前的0~10 kg·h–1上升至0~40 kg·h–1，且个体平均体长和体质量明显增加。此外，各季节游泳生物优势种类存在较大差异，该结果与张文超等[17]对北部湾洋浦海域鱼类群落结构的研究结果一致。春、夏、秋季第一优势种类分别为二长棘鲷、黄鳍马面鲀和短吻鲾，而冬季优势种类主要为拥剑梭子蟹等甲壳类生物(蟹类、虾类、虾蛄类)，该结果可能与调查海域游泳生物的繁殖、索饵及季度迁移习性相关[18]。
α多样性指数作为生物群落研究的重要指标之一[19]，常用来对比分析不同时期或水域生物群落多样性状况，探讨人类活动对鱼类群落多样性的影响及群落稳定性等[20]。如袁华荣等[21]通过Shannon-Wiener多样性指数、Pielou均匀度指数等对南海柘林湾鱼类多样性状况进行了评价，并分析了鱼类多样性与优势种类季节差异的相互关系。本研究中，夏季Shannon-Wiener多样性指数相对较高，但不同季节差异并不显著。湾口位置生境复杂，水体交换亦相对频繁，导致多样性指数空间差异较大(图3误差轴)。该差异经算术平均后被弱化，因此研究区域多样性指数季节差异并不显著。然而，当群落中的某一物种被与其生态功能相近的物种所代替时，这种群落结构的变化往往不能通过资源量或生物多样性指数等指标反映出来[22]。因此，单一的α多样性指数并不能有效地描述特定区域范围内生物群落的组成与结构特征[23]。
3.2 群落结构与稳定性评价
β多样性应用于生物群落时空格局研究，较α多样性指数能反映更多的群落信息，不仅描述生境内物种数量，同时也考虑到不同种类彼此之间的位置关系[24]。本研究采用生态学多元统计的方法，旨在研究大亚湾湾口海域游泳生物群落季节变化特征。由于湾口区域面积较小，调查过程中受天气、船舶通航及渔民捕捞作业等客观条件的影响，不同季节调查位点难以一一对应。各季节生物学采样位点均按照随机抽样的方式，均匀分布在湾口海域，整体上能反映该海域各个季节游泳生物组成特点，且各个季节不同调查位点渔获组成均进行了标准化处理，以保证其具有可比性。因此，本研究各个季节均采用随机抽样调查的方式，理论上是可行的。Cluster与NMDS研究表明，调查水域游泳生物群落季节差异显著(Pi = 9.3，P = 0.1%)，群落季间相似性均小于35%。诸多研究发现，群落中优势种类繁殖和索饵习性的差异(如多数鱼类的繁殖主要集中在春夏两季)，是导致群落季节异质特征的主要影响因子[25-26]。根据相对性指数计算结果，调查海域游泳生物优势种类季节差异显著。SIMPER相似性百分比进一步分析发现(表4)，二长棘鲷、黄鳍马面鲀和侧线天竺鲷为夏季和冬季游泳生物群落中特异性优势物种；二长棘鲷、墨吉对虾和红星梭子蟹为春季和秋季游泳生物群落中特异性优势物种。相关研究指出，优势种为海洋生态系统中的关键因子，对于维持生态系统的稳定以及渔业资源的可持续发展具有十分重要的意义[27]。根据上述研究结果，建议针对大亚湾湾口游泳生物群落中季节特异性优势物种，制定科学合理的保护措施(如限额捕捞、人工鱼礁建设等)，以促进该海域游泳生物资源的发展与群落结构的稳定。
ABC曲线中丰度和生物量优势度曲线的相对位置能反映游泳生物群落受外界环境的干扰程度[28]。有关研究显示，游泳生物群落稳定性表现出明显的季节变化特征。受水温、水位、水流等环境因子的影响，夏季游泳生物生理机能明显恢复，摄食增加、生长快速、繁殖旺盛且群落中小型个体所占比重大幅上升。近年来，随着大亚湾周边工业、港口建设、滨海旅游和规模化养殖等的迅速发展，该海域生态环境发生了较大变化，对鱼类等水生生物群落产生了不小的扰动，具体表现为渔业资源量下降、生物多样性降低、群落稳定性下降等[29]。本研究中，春季和夏季游泳生物丰度优势度曲线均在生物量优势度曲线之上，说明游泳生物群落以个体较小、生长快速、性成熟较早的r选择物种为主。另有研究指出，ABC曲线对优势群体的丰度和生物量变化比较敏感，优势种的丰度和生物量决定了生物量优势度曲线和丰度优势度曲线的位置[30]。本研究发现，夏季和春季第一优势种类数量百分比明显高于质量百分比，而秋季和冬季优势种类数量和质量百分比差异相对较小(表3)。综上可知，春、夏时期调查海域游泳生物群落受外界环境扰动的影响较大，群落结构处于不稳定状态，应采取有效措施，如伏季休渔等，为游泳生物提供良好的繁育环境。
3.3 游泳生物群落结构与水环境效应关系
有关研究指出，生境的变迁在一定时空范围内能导致群落异质结构的形成[31]。生态学多元统计分析(RDA、CCA等)应用于生物群落生态效应研究，能同时实现定量与定性分析的要求，因而逐渐成为群落生态研究的重要方法[32]。本研究中根据游泳生物群落与重要环境参数冗余分析结果，第一、二轴对游泳生物群落与环境关系的解释率分别为0.51和0.279。夏季和冬季游泳生物群落沿轴1分布，主要环境效应因子为Sal、DO、WT和Chl a；秋季和春季游泳生物群落沿轴2分布，主要环境效应因子为pH和Tra。由此可知，夏季游泳生物群落中二长棘鲷、黄鳍马面鲀和侧线天竺鲷的繁殖生长，对Sal、WT和Chl a等环境因子需求较高；冬季和秋季游泳生物群落中甲壳类(墨吉对虾、红星梭子蟹等)对pH耐受性较强，而不利于二长棘鲷等鱼类的种群增长。国外相关研究指出，pH水平与鱼类群落的组成和分布关系十分密切[33]。Ribeiro等[34]研究表明，水温在时间尺度上对鱼类群落影响最为显著，水温的季节变动直接导致了鱼类群落的季节差异[35]。另有研究指出，透明度在鱼类群落的时空分布中也起着十分重要的作用，其影响主要体现在索饵与避敌2个方面[36]。然而，生物群落与生态环境之间的效应关系因时因地而异，如Lunven等[37]研究指出，春季斯开湾浮游生物群落主要受磷酸盐调节，而夏季受硝酸盐影响较大。张文超等[17]研究发现，洋浦湾口海水的频繁交换，使得该海域水环境复杂，进而对该海域鱼类群落结构产生影响。因此，需尽可能系统全面地考虑潜在环境因子(如水深、海流、底质、人类活动等)的影响，以提高环境因子对生物群落时空异质特征的解释率。
本研究综合大亚湾湾口游泳生物资源动态、群落结构及其生态效应等多方面调查结果发现，调查海域主要水环境参数(Sal、WT、DO、pH、Chl a和Tra)及游泳生物中优势种类(二长棘鲷、黄鳍马面鲀、短吻鲾等)生理活动的季节性差异，是导致该海域游泳生物群落季节异质特征的主要影响因子。
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图 1 亲和色谱分离组分SDS-PAGE分析结果
Figure 1. SDS-PAGE of fractiones separated by affinity chromatography
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图 2 BCA法测定蛋白质浓度标准曲线
Figure 2. Standard curve of protein concentration determined by BCA method
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图 3 固定化材料对Patatin酯酶固定化效果的影响
Figure 3. Effect of immobilized materials on immobilized patatin lipase
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图 4 固定化时间对Patatin酯酶固定化效果的影响
Figure 4. Effect of immobilized time on immobilized patatin lipase
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图 5 固定化温度对Patatin酯酶固定化效果的影响
Figure 5. Effect of immobilized temperature on immobilized patatin lipase
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图 6 磁珠添加量对Patatin酯酶固定化效果的影响
Figure 6. Effect of magnetic bead addition on immobilized patatin lipase
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图 7 各因素交互作用对Patatin酯酶固定化效果的响应曲面
Figure 7. Effects of various factors and their interactions on immobilized patatin lipase
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图 8 Patatin酯酶固定化前 (a, b) 与固定化后 (c, d) 表面特征
Figure 8. Surface characteristics of magnetic beads before (a, b) and after (c, d) patatin lipase immobilization
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图 9 pH对固定化Patatin酯酶酶解活性的影响
Figure 9. Effect of pH on enzymatic hydrolysis activity of immobilized patatin lipase
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图 10 温度对固定化Patatin酯酶酶解活性的影响
Figure 10. Effect of temperature on enzymatic hydrolysis activity of immobilized patatin lipase
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图 11 温度对固定化前后Patatin酯酶稳定性的影响
Figure 11. Effect of temperature on enzymatic hydrolysis activity before and after patatin lipase immobilization
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图 12 pH对固定化前后Patatin酯酶稳定性的影响
Figure 12. Effect of pH on enzymatic hydrolysis activity before and after patatin lipase immobilization
表 1 Patatin酯酶活性测定反应体系
Table 1 Reaction system for patatin lipase activity
试剂
Reagent体积
Volume/μLTris-HCl 缓冲液 Tris-HCl buffer 2.5 PNP-acetate 缓冲液 PNP-acetate buffer 250 Patatin 酯酶溶液 Patatin lipase solution 100 氯化钙溶液 CaCl2 solution 100 
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表 2 固定条件Box-Benhnken响应面分析试验因素与水平
Table 2 Box-Benhnken response surface factors and levels of immobilization conditions
水平
LevelA B C t/min 温度
Temperature/℃磁珠添加量
Magnetic bead
addition/(mg·mL−1)−1 40 20 2.5 0 50 25 3.0 1 60 30 3.5
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表 3 磁珠与ConA的偶联实验结果
Table 3 Results of coupling experiment between magnetic beads and ConA
平行
ParallelConA吸附量 (磁珠)
ConA adsorption capacity
(magnetic beads)/(μg·mg−1)吸附率
Adsorption rate/%1 33.17 24.07±0.75 2 33.92 24.61±0.22 3 34.21 24.82±0.66 平均值 Average 33.77 24.50
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表 4 Box-Benhnken响应面分析试验设计及结果
Table 4 Box-Benhnken response surface design and experimental results
编号
No.A B C 酶比活力
Enzyme specific vitality/
(104 U·g−1)时间
Time温度
Temperature磁珠添加量
Magnetic bead
addition1 −1 −1 0 2.440 0 2 −1 0 −1 2.144 0 3 −1 0 1 2.240 9 4 −1 1 0 2.609 8 5 0 −1 −1 2.009 6 6 0 −1 1 2.047 0 7 0 0 0 3.101 3 8 0 0 0 3.150 0 9 0 0 0 3.195 8 10 0 0 0 3.200 3 11 0 0 0 3.225 0 12 0 1 −1 2.080 7 13 0 1 1 2.082 0 14 1 −1 0 1.729 6 15 1 0 −1 1.549 3 16 1 0 1 1.658 2 17 1 1 0 1.874 6
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表 5 Box-Benhnken响应面分析试验回归模型方差分析表
Table 5 Analysis of variance (ANOVA) and results of Box-Benhnken response surface
方差来源
Variance source平方和
Sum of squares自由度
Degree of freedom均方
Mean squareF P 差异显著性
Significance of difference模型 5.584 6 9 0.620 5 157.638 0 <0.000 1 *** A 0.860 0 1 0.860 0 218.482 3 <0.000 1 *** B 0.022 1 1 0.022 1 5.625 7 0.049 5 * C 0.007 5 1 0.007 5 1.898 4 0.210 7 AB 0.000 2 1 0.000 2 0.039 1 0.848 9 AC 0.000 0 1 0.000 1 0.009 1 0.926 5 BC 0.000 3 1 0.000 3 0.082 8 0.781 9 A2 1.435 3 1 1.435 3 364.630 0 <0.000 1 *** B2 0.768 2 1 0.768 2 195.146 7 <0.000 1 *** C2 2.019 3 1 2.019 3 513.003 2 <0.000 1 *** 残差 Residual 0.027 6 7 0.003 9 失拟项 Lack of fit 0.017 9 3 0.006 0 2.482 5 0.200 2 误差 Error 0.009 6 4 0.002 4 总离差 Total deviation 5.612 2 16 $R^2 $=0.995 1; $R_{{\rm{Adj}}}^2$=0.988 8; $R_{{\rm{Pred}}}^2$=0.946 2; Adeq Precision=34.036 5 注：*. 差异显著 (P<0.05)；**. 差异高度显著 (P<0.01)；***. 差异极其显著 (P<0.001)。 Note: *. Significant difference (P<0.05); **. Very significant difference (P<0.01); ***. Extremely significant difference (P<0.001).
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表 6 磁珠固定Patatin酯酶前后ζ-电势
Table 6 ζ- potential of patatin lipase before and after magnetic beads immobilization
组别
Group平均ζ-电势
Average ζ- potential/mV固定前 Before immobilization 86.673±4.233 固定后 After immobilization 56.300±1.103
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表 7 固定化前后Patatin酯酶温度耐受性的回归分析
Table 7 Regression analysis of temperature tolerance before and after patatin lipase immobilization
酶种类
Enzyme
type回归方程
Regression
equation相关系数
Correlation
coefficientIC50/℃ 游离Patatin酯酶
Free patatin lipasey=181−2.65xy 0.974 18.87 固定化Patatin酯酶
Immobilized patatin lipasey=135−1.19xy 0.996 42.01
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表 8 固定化前后Patatin酯酶pH耐受性的回归分析
Table 8 Regression analysis pH tolerance before and after patatin lipase immobilization
酶种类
Enzyme type回归方程
Regression
equation相关系数
Correlation
coefficientIC50 游离Patatin酯酶
Free patatin lipasey=−433+148x−10.5x2 0.886 1.915 固定化Patatin酯酶
Immobilized patatin lipasey=−225+84.06x−5.54x2 0.904 2.815
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