Embryonic development and morphological characteristics of larvae and juvenile of Platax teira
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摘要: 为了提高尖翅燕鱼 (Platax teira) 的卵孵化率和苗种成活率，并为人工催产和苗种繁育提供理论依据，观察分析了尖翅燕鱼受精卵胚胎发育和仔稚鱼发育的时序特征，对其形态学指标进行测量，推算出仔稚鱼阶段生长特性的回归方程。结果显示，尖翅燕鱼受精卵为浮性卵，直径 (1.29±0.09) mm，卵壳较坚韧，呈黄色透明的球状，单个油球，无黏性。在孵化温度 (26±0.3) ℃、盐度34~36和pH 7.8±0.5条件下，整个胚胎发育经历7个阶段共27个时期，耗时27 h 45 min。初孵仔鱼全长 (3.120±0.349) mm，呈透明状，体表散布着大量分枝叶黄素，先后经历仔鱼期 (0~17 d) 和稚鱼期 (17~25 d)，25 d后进入幼鱼期。此时幼鱼鳍棘和鳍条已发育完全，其典型特征为头部、躯干部和尾部各有3条黑色条带，身体呈银白色。统计模型显示，尖翅燕鱼早期阶段生长速度较缓，7日龄后生长加速；8日龄仔鱼出现残食和攻击行为。Abstract: In order to improve the egg hatching rate and fry survival rate of Tiera batfish (Platax teira), and to provide a theoretical basis for artificial spawning and fry breeding, we observed and analyzed the temporal characteristics of embryonic and juvenile development of fertilized eggs of P. teira, and measured the morphological indexes to derive the regression equations for the growth characteristics of juvenile stages. The results show that the eggs were floating, (1.29±0.09) mm in diameter, with a tough, transparent, yellow spherical shell and a single oil globule that was not sticky. At an incubation temperature of (26±0.3) ℃, salinity of 34–36 and pH 7.8±0.5, the embryos underwent seven stages of development for 27 periods, taking 27 h 45 min. The total length of newly hatched larvae were (3.120±0.349) mm, transparent, with a large amount of branched lutein scatterring on the surface of the body, followed by the juvenile stage (0–17 d) and the larval stage (17–25 d). The juvenile stage was 25 d later, when the fin spines and fin ray were fully developed, typically with three black bands on the head, trunk and tail, and a snowy silvery body color. Statistical models show that the early stages of growth were slow, but accelerated after 7 dah. At 8 dah, the juveniles showed cannibalism and aggressive behavior.
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克氏原螯虾 (Procambarus clarkii)又称小龙虾，于20世纪30年代引入中国，因环境适应能力强、食性广、繁殖快、产量高等特点受到养殖者的青睐，近年来已发展成为我国重要的水产养殖品种。2021年，我国克氏原螯虾产业总值达到4 221.95亿元，经过40年的发展，已形成集繁育养殖、加工出口、物流餐饮、文化节庆为一体的完整产业链，成为我国农业发展的重要支柱产业之一[1]。随着克氏原螯虾大面积养殖的兴起，其品质参差不齐的问题也随之显现。因此，如何采用复合蛋白来源提升其养殖健康和品质[2]，亟须深入研究。
代谢组学技术是研究小分子物质及其在生物体中动态变化的技术[3]，检测方式上可以分为非靶向代谢组学和靶向代谢组学，广泛应用于临床医学[4]、食品科学[5]、环境功能[6]等多个研究领域。代谢组学常结合核磁共振技术 (NMR)[7]、液相色谱-质谱联用技术 (LC-MS)[8]、气相色谱-质谱联用技术 (GC-MS)[9]等检测手段满足不同的实验需求[10]。近年代谢组学也已应用于水产领域，刘慧茹等[11]利用代谢组学技术，结合斑马鱼 (Danio rerio) 评价模型，发现皂苷类成分可能与抗疲劳活性有关；张彦坤等[12]通过代谢组学分析测定剑鱼 (Xiphophorus helleri) 肝脏内源物的变化，探究了饥饿胁迫对水生动物的影响。
饲料不仅应给动物体提充足的营养和能量[13]，还应具有提升养殖功效的活性物质[14]。目前，关于提升水产养殖功效的报道多集中在考察养殖产品的生长、生化指标和肠道微生物检测等方面[15-16]。近些年针对不同日粮下动物肌肉中代谢产物变化的研究逐渐增多，认为肌肉中氨基酸、脂类和功能物质等代谢产物的变化直接影响了肌肉品质[17-18]，并结合代谢组分析更加全面准确地把握营养代谢乃至相关基因调控等方面的信息[19-20]。但目前关于克氏原螯虾代谢组学相关的研究报道较少。针对以上问题，本文利用非靶向代谢组学技术结合超高效液相色谱-质谱技术 (UHPLC-MS)，通过多元统计分析进行差异代谢物筛选，并对差异代谢物进行 KEGG (Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes) 通路分析，对比两种日粮模式下克氏原螯虾肌肉代谢组的差异及主要特征标志物，探究不同日粮下克氏原螯虾肌肉代谢产物的变化，以为提升克氏原螯虾养殖品质提供参考。
1. 材料与方法
1.1 实验设计与样品采集
挑选附肢健全、活力较好的克氏原螯虾于2022年6月养于安徽省农业科学院水产研究所基地的克氏原螯虾虾塘。选择临近塘口，保持水源相同，虾塘面积为0.200~0.267 hm2，放养虾苗体质量为5~10 g，放养密度为10尾·m2，养殖周期为60 d，分别投喂蛋白质质量分数为32%的常规饲料和发酵饲料，饲料配方和基本组成见表1。每日07:00和18:00各投饲１次，日投喂量约为虾体质量的4%。养殖期结束后，分别从不同组塘口各取5尾虾共混合5.0 g样品冷冻待测备用，每个处理均取3份作为重复。
表 1 基础饲料组成及营养水平 (干物质基础)Table 1. Composition and nutrient levels of basal diet (Dry matter basis) %项目
Item发酵饲料
Fermented diet常规饲料
General diet原料 Ingredient 鱼粉 Fish meal 6 16 豆粕 Soybean meal 50 12 菜籽粕 Rapeseed meal 12 15 亚麻粕 Flaxseed meal 8 0 玉米淀粉 Corn starch 8 28 小麦粉 Wheat flour 8 19 鱼油 Fish oil 5 3 豆油 Soybean oil 0 4 磷酸二氢钙 Ca(H2PO4)2 1.4 1.4 维生素① Vitamin 0.5 0.5 矿物质① Mineral 1 1 防霉剂 Mould inhibitor 0.1 0.1 合计 Total 100 100 营养水平 Nutrient Level 粗蛋白 Crude protein 32.00 32.00 粗脂肪 Crude fat 6 6 灰分 Ash 12 18 粗纤维 Crude fiber 14 8 赖氨酸 Lys 1.5 1.5 水分 Moisture 18 10 注：① 维生素和矿物质均为预混料，维生素主要含 VC、VE、VB、VD等，其他成分及含量保密。 Note: ① Vitamins and minerals are premixes, and vitamins mainly contain VC, VE, VB, VD, etc.. Other components and contents are confidential. 克氏原螯虾的体质量增长率 (WGR) 和特定生长率 (SGR) 指标按以下公式计算：
$$ \begin{gathered} R_{\mathrm{WG}}=\left[\left(m_t-m_0\right) / m_0\right] \times 100 {\text{%}} \end{gathered} $$ (1) $$ R_{\mathrm{SG}}=\left[\left(\ln m_t-\ln m_0\right) / t\right] \times 100 {\text{%}} $$ (2) 式中：RWG为体质量增长率(%)；RSG为特定生长率(%·d−1)；m0为养殖初始体质量 (g)；mt为养殖末体质量 (g)；t为饲喂时间 (d)。
1.2 仪器与材料
低温高速离心机 (Eppendorf 5430R)；超声破碎仪 (宁波新芝 JY92-II)；MP Fastprep-24 匀浆仪 (MP Biomedicals)；质谱仪AB Triple TOF 6600；超高压液相色谱仪Vanquish UHPLC、色谱柱：Waters，ACQUITY UPLC BEH Amide (1.7 μm, 2.1 mm×100 mm)。甲醇、醋酸铵、甲酸、乙腈、乙酸铵等购于美国CNW Technologies科技公司，均为色谱纯；常规饲料和发酵饲料均购于安徽万士生物制药有限公司。
1.3 样本提取
克氏原螯虾肌肉样品室温下解冻后，称取100 mg到1.5 mL EP管中，加入钢珠和500 µL 提取液[V(甲醇)∶V(乙腈)∶V(水)=2∶2∶1]，−20 ℃低温预冷2 min，经研磨处理4 min，使用匀浆仪混匀，低温超声萃取30 min，重复2次，置于−20 ℃下60 min，然后 4 ℃离心15 min (13 000 r·min−1)，取上清液150 μL (分装管900 μL)。使用0.22 μm的有机相针孔过滤器过滤后，转移到进样小瓶，−80 ℃下保存。质控样本 (Quality control, QC) 由所有样本的提取液等体积混合制备而成，每个QC的体积与样本相同。
1.4 UHPLC-MS分析条件
UHPLC条件：样品采用超高效液相色谱系统进行分离；柱温25 ℃；流速0.5 mL·min−1；进样量2 μL；流动相组成A：水+25 mmol·L−1乙酸铵+25 mmol·L−1氨水，B：乙腈。梯度洗脱程序：0~0.5 min，95%B；0.5~7 min，B下降至65%；7~8 min，B下降至40%；8~9 min，B维持40%；9~9.1 min，B上升至95%；9.1~12 min，B维持95%。整个分析过程中样品置于4 ℃自动进样器中。为避免仪器检测信号波动而造成的影响，采用随机顺序进行样本的连续分析。样本队列中插入QC样品，用于监测和评价系统的稳定性及实验数据的可靠性。
质谱条件：分别采用电喷雾电离 (ESI) 正离子和负离子模式进行检测。离子源温度：600 ℃，喷雾电压 (ISVF)±5 500 V (正负两种模式)；其他参数正负离子模式下相同，毛细管温度为320 ℃；辅助气体加热温度420 ℃；鞘气体流量40 arb；辅助气体流量为20 arb；去簇电压 (DP)：±60 V (正负两种模式)，碰撞能量：(35±15) eV。
1.5 数据分析
生长性能数据采用SPSS 21.0软件统计分析，数据均以“平均值±标准差 (
$\overline { x}\pm { {s}} $ )”表示。采用ANOVA过程进行单因子方差分析，显著性水平为P<0.05。代谢组数据使用ProteoWizard软件，将二级质谱原始数据转成mzXML格式，再使用XCMS进行峰对齐，做保留时间矫正和峰识面积提取等工作，同时使用自撰写R程序包和自建二级质谱数据库对峰进行物质鉴定。采用R软件对鉴定的代谢产物进行主成分分析和正交偏最小二乘法判别分析。根据变量重要性投影评分，将VIP>1且P<0.05的代谢物定义为差异代谢物 (Significant changed metabolites, SCMs)，将得到的差异代谢物通过代谢通路数据进行注释解析，并通过富集分析法分析发酵饲料组与常规饲料组的变化，筛选关键代谢通路。
2. 结果
2.1 不同饲料对克氏原螯虾生长性能的影响
由表2可知，采用两种不同饲料饲喂克氏原螯虾，养殖期第60天结束时，两组间克氏原螯虾的体质量增长率和特定生长率无显著性差异 (P>0.05)。
表 2 不同饲料对克氏原螯虾生长性能的影响Table 2. Effect of different feeds on growth performance of crayfish指标
Index发酵饲料组
Fermented diet (T)常规饲料组
General diet (CK)初始体质量 IBM/g 5.95±0.42a 6.15±0.51a 终末体质量 FBM/g 28.29±2.86a 28.44±2.69a 体质量增长率 WGR/% 375.46±9.21a 362.40±8.88a 特定生长率 SGR/(%·d−1) 2.59±0.12a 2.55±0.19a 注：同行数据不同小写字母表示差异显著 (P<0.05)。 Note: Values with different letters within the same row are significantly different (P<0.05). 2.2 代谢物总览
本研究在正离子和负离子模式下分别筛选出581和495个化合物。通过与数据库匹配，正离子和负离子模式下分别注释到269和273个化合物 (Human Metabolome Database, HMDB)。将所有的代谢化合物进行分类分析，被分为15个一级类别，其中主要为有机酸及其衍生物，其次是脂质和类脂分子，以及有机杂环化合物、核苷酸类等。
2.3 多元统计分析结果
2.3.1 主成分分析 (Principal components analysis, PCA) 结果
由PCA分析图 (图1) 所示，每个散点表示一个样本，样本全部处于95%置信区间，对照组与实验组的检测结果说明代谢产物虽存在一定差异，可被区分，但也有部分相似；这可能是由于蛋白质、脂肪等物质产生的水解产物如肽类、氨基酸、脂肪酸等有一定程度的相似。
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图 1 发酵饲料组和常规饲料组代谢物的 PCA 分析图Figure 1. PCA plots of metabolites in fermented feed group and general feed group2.3.2 正交偏最小二乘法判别分析 (OPLS-DA) 结果
OPLS-DA模型分析结果见图2和图3，可见两组样本明显分离，表明两组数据存在显著性差异。正离子模式下模型R2 Y=0.993、Q2=0.965，负离子模式下模型R2 Y=0.991、Q2=0.927。随着置换保留度逐渐降低，随机模型的R2和Q2均逐渐下降，说明两种模式下原模型不存在过拟合现象，模型稳定性良好。
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图 2 发酵饲料组和常规饲料组代谢物的 OPLS-DA 分析图Figure 2. OPLS-DA plots of metabolites in fermented diet group and general diet group![]()
图 3 差异代谢物的OPLS-DA置换检验结果Figure 3. OPLS-DA model replacement test results of differential metabolites2.3.3 差异代谢物火山图
利用t检验和变异系数法比较两组之间的代谢产物差异，设立筛选条件，对正、负离子模式下检测到的所有代谢物 (含未被鉴定的代谢物) 进行差异分析，采用火山图进行可视化展示 (图4)，T 和 CK 组在正离子和负离子模式下共筛选出差异表达代谢物分别为581和495个，其中正离子代谢产物上调314个、下调267个，负离子代谢产物上调258个、下调237个。
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图 4 发酵饲料组对比常规饲料组的差异代谢物筛选Figure 4. Differential metabolite screening volcano maps of fermented diet group (T) and general diet group (CK)2.3.4 差异代谢物中显著差异代谢物筛选结果
根据差异代谢物做筛选，结果如表3所示。在正离子和负离子模式下分别筛选出17和10种显著差异代谢物。其中VIP表示变量投影重要度；FC表示差异倍数，FC>1表示该代谢物上调，FC<1表示该代谢物下调；m/z表示质荷比；显著性分析P值越小，表示差异越显著；RT代表代谢物在色谱上的保留时间，即出峰时间(s)。
表 3 发酵饲料组和常规饲料组的显著差异代谢物列表Table 3. List of significant different metabolites of fermented diet group and general diet group模式
Mode差异代谢物
Differential metabolite变量投影
重要度
VIP差异倍数
FC质荷比
m/z显著性分析
P value保留时间
RT/s正离子 Positive ion 肌酸苷 Creatinine 3.41 0.32 114.06 0.0007 161.13 正离子 Positive ion 肌酸 Creatine 15.31 0.24 132.08 0.006 334.67 正离子 Positive ion 甲基组胺 Methyl-histamine 3.58 2.83 126.10 0.011 380.87 正离子 Positive ion 苦马豆素 Swainsonine 1.17 0.20 156.10 0.012 352.39 正离子 Positive ion 组氨酸 L-Histidine 7.81 0.39 156.08 0.015 441.29 正离子 Positive ion 精氨酸-谷氨酸 Arg-Glu 2.08 2.16 304.16 0.016 474.58 正离子 Positive ion 4-氨基吡啶 4-aminopyridine 2.78 2.94 95.06 0.024 377.41 正离子 Positive ion 腺苷酸琥珀酸 Adenylosuccinic acid 2.00 3.21 464.08 0.024 483.46 正离子 Positive ion 精氨酸 Arginine 24.77 0.74 175.12 0.027 507.05 正离子 Positive ion 磷脂酰胆碱 Lpc 16:0 6.96 2.01 496.34 0.029 183.71 正离子 Positive ion 戊二醛 Glutaraldehyde 1.82 0.58 83.06 0.029 350.75 正离子 Positive ion 鞘氨醇磷酰胆碱
N-oleoyl-d-erythro-sphingosylphosphorylcholine3.68 1.82 729.59 0.030 168.18 正离子 Positive ion 1-乙基-1,3-二氢-2H-苯并咪唑-2-酮
2h-benzimidazol-2-one,1-ethyl-1,3-dihydro-1.52 3.13 163.09 0.048 61.25 正离子 Positive ion 组氨-丝氨酸 His-Ser 1.83 2.12 243.11 0.044 330.91 正离子 Positive ion 肌氨酸 Sarcosine 1.89 2.49 134.01 0.044 338.91 正离子 Positive ion 3'-岩藻糖基乳糖 3'-fucosyllactose 1.62 17.32 114.06 0.048 391.17 正离子 Positive ion 辅酶 I Coenzyme I 2.22 0.61 664.11 0.049 423.70 负离子 Negative ion 3,4-二氯酚 3,4-dichlorophenol 1.11 1.43 160.94 0.014 315.87 负离子 Negative ion 奎尼酸 Quinate 1.39 14.33 191.05 0.019 330.78 负离子 Negative ion 丁基磷酸 Butylphosphonic acid 1.36 2.38 275.09 0.023 448.38 负离子 Negative ion 苹果酸 Malate 6.21 1.59 133.01 0.028 394.31 负离子 Negative ion 谷氨酸 L-Glutamate 1.01 1.80 168.03 0.029 385.65 负离子 Negative ion N-乙酰蛋氨酸 N-acetyl-l-methionine 1.45 2.49 190.05 0.029 187.41 负离子 Negative ion 磷酸丝氨酸 Phosphoserine 1.71 2.15 369.02 0.042 436.39 负离子 Negative ion 补骨脂定 Psoralidin 1.03 2.15 335.08 0.043 384.21 负离子Negative ion 东革内酯 Eurycomalactone 3.80 5.22 347.17 0.047 26.15 负离子 Negative ion 亚麻木酚素 Secoisolariciresinol 1.95 5.63 361.18 0.049 25.53 2.3.5 差异代谢物的层次聚类分析
图5为显著差异代谢物 (VIP>1, P<0.05) 的层次聚类分析结果，横轴表示发酵饲料组与常规组，纵轴表示相应的差异代谢物，红色代表显著性上调，蓝色代表显著性下调，颜色深浅表示上、下调的程度。由图可见同组的样本聚在同一簇内，说明同组样本之间的相似度高于组间。筛选出的27种差异显著的代谢物，发酵饲料组有19种代谢物发生上调，8种代谢物发生下调。正离子模式下发酵饲料组中腺苷酸基琥珀酸、鞘氨醇磷酰胆碱、岩藻糖基乳糖、磷酯酰胆碱等高表达，负离子模式下发酵饲料组中苹果酸、补骨脂素、磷酯酰丝氨酸、谷氨酸等高表达。
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图 5 发酵饲料组和常规饲料组 的层次聚类分析热力图Figure 5. Hierarchical cluster analysis heat maps of fermented diet group (T) and general diet group (CK)2.3.6 差异代谢物的代谢通路分析
代谢通路分析的结果以气泡图展示 (图6)。通过KEGG注释分析找到所有差异代谢物参与的通路，本实验根据P值选择显著性最高的前20条代谢通路，包含氨基酸生物合成、组氨酸代谢、碳酸氢盐回收循环、丙氨酸-天冬氨酸-谷氨酸代谢、蛋白质消化和吸收、精氨酸合成、氨酰tRNA的生物合成、精氨酸-脯氨酸代谢、氨基酸生物合成等。气泡越大影响因子越大；颜色越深代表P值越小，富集程度越显著。结果显示组氨酸代谢通路、蛋白质消化和吸收代谢通路、精氨酸-脯氨酸代谢通路、氨酰-tRNA合成这４个差异代谢影响因子最大；精氨酸-脯氨酸代谢通路、蛋白质消化和吸收代谢通路和氨酰-tRNA合成通路的富集程度最显著。
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图 6 发酵饲料组对常规饲料组的通路分析气泡图Figure 6. Path analysis bubble chart of fermented diet group and general diet group3. 讨论
本研究对来自不同日粮环境下的两组克氏原螯虾肌肉样本的代谢组进行了比较分析，结果显示两组样本在正离子和负离子模式下，其代谢物均有显著性差异。代谢物主要包括有机酸、氨基酸、脂类和类脂及其衍生物等。显著差异代谢物主要涉及精氨酸-脯氨酸、组氨酸代谢以及蛋白质消化吸收等相关通路。
奎尼酸是一种氨基酸前体物质，在生物体内主要参与脂肪酸代谢过程，有助于维持身体的健康状态，可以帮助将脂肪酸转化为能量[21]。岩藻糖基乳糖是一种多糖类物质，在生物体内可以清除自由基、减轻氧化应激，具有抗氧化、抗炎和免疫调节等作用。亚麻木酚素具有促进血液循环增强机体免疫力的功能[22]。这几种功能物质通常以化合物的形式存在于植物体中，而本研究中，奎尼酸、岩藻糖基乳糖和亚麻木酚素在发酵饲料饲喂环境下在肌肉中的含量均提高了5倍以上，表明克氏原螯虾利用发酵饲料中的植物成分参与了这几种物质的生成和代谢。
本实验中发酵饲料组增幅种类最多的是磷脂类 (包括磷脂酰胆碱、磷脂酰丝氨酸、磷脂酸、鞘磷脂等)，此类物质对大脑和血管各种功能起到重要的调节作用[23]，能影响生物细胞膜的流动性、通透性，并激活多种酶类的代谢和合成。磷脂酰丝氨酸由丝氨酸合成产生，可改善神经细胞功能，是促神经发育重要营养元素[24]。鞘磷脂对人类肠道和肝脏具有保护和修复的生理功能。此类物质常见于大豆的副产物，而发酵饲料主要成分为豆粕，这类物质的提高可以推断克氏原螯虾通过摄食豆类增加了此类物质的合成。饲料的组成显著影响了克氏原螯虾的肌肉代谢，并使其更具营养[25]。这些肌肉代谢物的增加，说明可以利用投喂发酵饲料实现克氏原螯虾肉中磷脂含量的增加[26]。
代谢物中还存在一些其他具有生理调节功能的物质，例如补骨脂定和苹果酸等。补骨脂定有抗氧化、调节细胞凋亡等作用[27]。可以治疗动脉粥样硬化、心脏病以及心肌损伤[28]。苹果酸作为能量代谢中间体参与生物体内三羧酸循环，可以增加线粒体苹果酸脱氢酶的活性，提高氨基酸的合成效率，机体ATP的合成效率也可以得到提高[29]。这些物质影响生物的活动能力，因此推断其在肌肉中含量的升高有利于提升克氏原螯虾的运动能力。
显著差异代谢物中还有一部分氨基酸类物质，发酵饲料组相对常规饲料组发生谷氨酸、精-谷氨酸、N-乙酰蛋氨酸组-丝氨酸和甲基甘氨酸等代谢物显著上调。谷氨酸、精氨酸、脯氨酸和谷氨酰胺在动物机体内可相互转化，并发挥重要作用[30]。有研究表明，日粮中添加谷氨酸可以帮助动物减轻肠道氧化损伤[31]，增强肌纤维强度[32]。精氨酸有抗胁迫能力，影响生物体的性腺发育速度与非特异性免疫调节的功能[33-34]。表明发酵饲料的丰富氨基酸组成，影响克氏原螯虾新陈代谢和营养物质的吸收转化。
经KEGG通路分析发现，差异通路主要涉及氨基酸代谢和神经传导等方面，在组氨酸代谢、氨酰-tRNA生物合成、精氨酸-脯氨酸代谢以及蛋白质消化与吸收这几条通路上差异最显著。本研究中上调的谷氨酸和下调的组氨酸，被富集到氨酰-tRNA生物合成代谢通路和组氨酸代谢上。氨酰-tRNA合成，受特定的酶催化氨基酸与相应tRNA氨酰化，增强生物体遗传信息翻译准确性。谷氨酸可以由组氨酸代谢而来，并且是谷氨酰胺前体，可以在蛋白质合成阶段的后期以谷氨酰尾的形式修饰添加，对肌肉生成有促进作用[35]。表明在发酵饲料饲喂的环境下，克氏原螯虾机体组织相应调整了谷氨酸代谢能力，促进了肌肉的氨酰化反应以及ATP的激活，提升运动能力。下调表达的组氨酸和精氨酸则被富集到精氨酸-脯氨酸代谢和蛋白质消化与吸收通路中，表明在发酵饲料环境下，谷氨酸向精氨酸和脯氨酸的转化受到抑制，克氏原螯虾为适应不同的日粮环境可能相应地降低了部分蛋白质的翻译。
4. 结论
本研究通过代谢组学结合LC-MS的方法，研究了两种日粮模式下克氏原螯虾肌肉代谢产物的变化。结果表明，投喂发酵饲料一方面促进了克氏原螯虾肌肉中多种生理功能物质的合成，推测克氏原螯虾通过摄食获得运动能力和增强免疫；另一方面促进了肌肉中多种磷脂类物质的合成，提升了克氏原螯虾的食用价值。对差异代谢产物进行了KEGG通路富集分析，发现发酵饲料显著影响了组氨酸代谢、精氨酸-脯氨酸、蛋白质消化吸收和氨酰-tRNA合成这几条代谢通路。表明日粮能显著影响克氏原螯虾机体氨基酸代谢，推测发酵饲料在促进克氏原螯虾肌肉中特定蛋白质合成、调节代谢和辅助合成氨酰-tRNA酶类等方面发挥积极作用。
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图 1 尖翅燕鱼胚胎发育
注：a. 受精卵；b. 2 细胞期；c. 4 细胞期；d. 8 细胞期；e. 16 细胞期；f. 32 细胞期；g. 64 细胞期；h. 多细胞期；i. 桑葚期；j. 高囊胚期；k. 低囊胚期；l. 原肠早期；m. 原肠中期；n. 原肠晚期；o. 胚体形成；p. 胚孔封闭；q. 眼泡出现期；r. 肌节出现期；s. 色素形成；t. 晶体形成；u. 尾芽期；v. 心跳期；w. 肌肉效应期；x. 耳石形成；y. 孵化前期；z. 孵化期；za. 初孵仔鱼。
Figure 1. Embryonic development of P. teira
None：a. Fertilized egg; b. 2-cell stage; c. 4-cell stage; d. 8-cell stage; e. 16-cell stage; f. 32-cell stage; g. 64-cell stage; h. Multi-cell stage; i. Morula stage; j. High blastula stage; k. Low blastula stage; l. Early gastrula; m. Middle gastrula; n. Late gastrula; o. Embryo body formation; p. Closure of blastopore; q. Eye vesicle stage; r. Muscle burl stage; s. Formation of pigment; t. Formation of eye lens; u. Caudal bud stage; v. Heart beating stage; w. Muscle contraction; x. Formation of otolish; y. Pre-hatching stage; z. hatching stage; za. Newly hatched larvae.
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图 2 尖翅燕鱼仔稚鱼形态发育
注：a. 1 龄仔鱼；b. 2 日龄仔鱼；c. 3 日龄仔鱼；d. 4 日龄仔鱼；e. 5 日龄仔鱼；f. 7 日龄仔鱼；g. 9 日龄仔鱼；h. 11 日龄仔鱼； i. 13 日龄仔鱼；j. 15 日龄仔鱼；k. 17 日龄仔鱼；l. 19 日龄稚鱼；m. 21 日龄稚鱼；n. 23 日龄稚鱼；o. 25 日龄幼鱼。
Figure 2. Morphological development of larvae and juvenile of P. teira
None: a. 1 dah larvae; b. 2 dah larvae; c. 3 dah larvae; d. 4 dah larvae; e. 5 dah larvae; f. 7 dah larvae; g. 9 dah larvae; h. 11 dah larvae; i. 13 dah larva;j. 15 dah larva; k. 17 dah larva; l. 19 dah juvenile; m. 21 dah juvenile; n. 23 d ah juvenile; o. 25 dah juvenile.
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图 3 尖翅燕鱼早期生长曲线
注：a. 全长与孵化日龄的关系；b. 体长与孵化日龄的关系； c. 体高与孵化日龄的关系；d. 头长与孵化日龄的关系；e. 眼径与孵化日龄的关系；f. 卵黄囊体积与孵化日龄的关系
Figure 3. Early growth curve of P. teira
Note: a. Relationship between total length and dah; b. Relationship between body length and dah; c. Relationship between body height and dah; d. Relationship between head length and dah; e. Relationship between eye diameter and dah; f. Relationship between yolk sac volume and dah.
表 1 尖翅燕鱼胚胎发育过程
Table 1 Embryonic development of P. teira
发育阶段
Developmental
stage发育期
Developmental
period受精后时间
Time after
fertilization持续时间
Duration积温
Accumulative
Temperature/
(h·℃)图1
Fig. 1合子期 Zygo phase 受精卵 Fertilized egg 30 min 30 min 13 a 卵裂期 Cleavage stage 2细胞期 2-cell stage 60 min 30 min 13 b 4细胞期 4-cell stage 1 h 6 min 16 min 7 c 8细胞期 8-cell stage 1 h 40 min 36 min 15.6 d 16细胞期 16-cell stage 1 h 50 min 10 min 4.3 e 32细胞期 32-cell stage 2 h 10 min 20 min 8.6 f 64细胞期 64-cell stage 2 h 30 min 20 min 8.6 g 多细胞期 Multicellular stage 2 h 58 min 28 min 12.1 h 桑葚期 Morula 3 h 23 min 25 min 12.1 i 囊胚期 Blastula stage 高囊胚期 High blastula 4 h 7 min 44 min 19.1 g 低囊胚期 Low blastula 4 h 58 min 51 min 22.1 k 原肠胚期 Gastrula stage 原肠早期 Early-gastrula stage 5 h 41 min 1 h 13 min 31.6 l 原肠中期 Mid-gastrula stage 6 h 45 min 34 min 14.7 m 原肠晚期 Late-gastrula stage 8 h 8 min 1 h 23 min 36 n 神经胚期 Neurula stage 胚体形成期 Embryogenesis period 9 h 49 min 1 h 41 min 43.8 o 胚孔封闭期 Closure of blastopore stage 11 h 1 h 11 min 30.8 p 器官形成期 Organogenesis stage 眼泡出现期 Tail vesicle period 11 h 28 min 28 min 12.1 q 肌节出现期 Appearance of myomere 12 h 4 min 36 min 15.6 r 色素形成期 Formation of pigment 13 h 25 min 1 h 21 min 35.1 s 晶体形成期 Crystal stage of eyes 14 h 42 min 1 h 17 min 33.4 t 尾芽期 Tail-bud period 16 h 55 min 2 h 13 min 57.6 u 心跳期 Heart beating period 19 h 18 min 2 h 23 min 62 v 肌肉效应期 Muscular contraction period 20 h 36 min 1 h 18 min 33.8 w 耳石形成期 Appearance of statolith 22 h 20 min 2 h 14 min 58.1 x 孵化前期 Pre-hatching stage 25 h 30 min 2 h 40 min 69.3 y 孵化期 Hatching stage 26 h 55 min 1 h 25 min 36.0 z 孵化期 Hatching stage 初孵仔鱼 Newly hatched larvae 27 h 20 min 25 min 10.8 za 注：受精卵孵化温度为 (26±0.3) ℃、盐度34~36、pH 7.8±0.5。 Note: The temperature of hatching seawater was (26±0.3)℃; the salinity was 34−36; pH was 7.8±0.5. 
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