软体动物缺乏获得性免疫系统，完全依赖非特异性免疫防御反应来阻止病原入侵。抗菌肽(AMPs)是先天免疫系统的主要成分，构成了宿主抵抗病原体感染的第一道防线^[1-2]。迄今为止，已超过40种软体动物AMPs收录于Antimicrobial Sequences Database (http://aps.unmc.edu/AP/main.php)。在海洋贝类中，AMPs可以直接结合并破坏菌膜从而杀死入侵的细菌^[3]。目前，已经从贝类中鉴定出多种AMPs，包括防御素(defensins)、大防御素(big defensins)、贻贝素(mytilins)、贻贝肽(myticins)、贻贝霉素(mytimycins)和贻贝几丁质结合肽(mytichitins)^[4-6]等。AMPs具有广谱杀菌性、不易产生耐药性且热稳性和水溶性好等特点，使其成为抗生素的潜在替代品^[7-9]。

在众多AMPs中，防御素是最常见的家族之一。贝类防御素是小的阳离子肽(4~5 kD)，存在3个或4个二硫键并具有半胱氨酸稳定的α-螺旋/β-折叠基序(Csαβ)^[10]。鉴于半胱氨酸数量的差异，贝类防御素可分为两大类：1) 六半胱氨酸防御素，属于节肢动物和软体动物-6半胱氨酸防御素，包括斑马贻贝(Dreissena polymorpha)^[11]、池蝶蚌(Hyriopsis schlegelii)^[12]和翡翠贻贝(Perna viridis)^[13]等；2) 八半胱氨酸防御素，属于软体动物型-8半胱氨酸防御素，包括花蛤(Venerupis philippinarum)^[3]、牡蛎(Crassostrea gigas和Magallana gigas)^[14-15]、贻贝(Brachidontes pharaonis)^[2]和河蚌(Cristaria plicata)^[16]等。虽然这2种类型的防御素在一级结构上有所不同，但都具有相似的广谱抗菌活性。

杂色鲍(Halitotis diversicolor)是一种生活在中国南部沿海的土著品种，具有很高的商业价值。近年来，大规模疾病暴发导致杂色鲍产量逐年下滑。而这些突发事件的发生与哈维弧菌(Vibrio harveyi)^[17]的感染有着紧密的关系。因此，了解杂色鲍先天免疫反应的基本知识，是应对和处理类似事件的基础。本研究鉴定和描述了一种新的杂色鲍防御素，研究和讨论了其预测蛋白的3D结构和组织特异性表达模式，同时还研究了哈维弧菌感染后该基因的瞬时表达变化。

1.   材料与方法

1.1   杂色鲍HdDef1的基因克隆

基于杂色鲍RNA-seq数据库中HdDef1的部分cDNA序列，使用SMARTer^® RACE 5'/3' 试剂盒(TaKaRa，大连)提供的方法，设计4个基因特异性引物以获得3' 和5' 末端(表1)。巢式引物P1 (外部)和P2 (内部)用于5' RACE，巢式引物P3 (外部)和P4 (内部)用于3' RACE。第一轮PCR反应条件为：94 ℃ 30 s，70 ℃ 3 min，5个循环；94 ℃ 30 s，67 ℃ 30 s，72 ℃ 3 min，5个循环；94 ℃ 30 s，64 ℃ 30 s，72 ℃ 3 min，20个循环。第二轮PCR反应条件为：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 3 min，30个循环；72 ℃ 10 min。最后将PCR产物连接到pMD-18T载体(TaKaRa，大连)中并进行双向测序，通过拼接3' 和5' 末端序列获得HdDef1全长序列。

表  1  实验所用引物序列

Table  1.  Sequences of primers used in this study

引物名称 primer name	引物序列 (5'−3') primer sequence	序列信息 sequence information
P1	CATCACCTGCGATCTGCTCTCCTTTA	5' RACE primer out (HdDef1)
P2	TTCTGCCTGTGCTGCTAAATGCCTTG	5' RACE primer in (HdDef1)
P3	ACAGACACAGACGCCACCATGACAG	3' RACE primer out (HdDef1)
P4	GCCATACCGACGATGACAACAACCAAAC	3' RACE primer in (HdDef1)
Def-F	TGGTTGTTGTCATCGTCGGTAT	qRT-PCR primer for HdDef1
Def-R	AGTAACAAGGCATTTAGCAGCAC	qRT-PCR primer for HdDef1
18S-F	ACGCATCTATCAAGTGTCTGCCCTA	qRT-PCR primer for 18S
18S-R	CTGCTGCCTTCCTTGGATGTGGTAG	qRT-PCR primer for 18S

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1.2   HdDef1的生物信息学分析

使用BLAST (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast)和Expert Protein Analysis System (http://www.expasy.org)分析HdDef1的核苷酸和编码的氨基酸序列；使用Simple Modular Architecture Research Tool (http://smart.cmbl-heidelberg.de/)预测信号肽和蛋白质功能结构域；使用APD3 (http://aps.unmc.edu/AP/prediction/prediction_main.php)评估净电荷和疏水比；通过Swiss-model (http://swissmodel.expasy.org/workspace)预测三级结构模型；使用ClustalX程序进行多序列比对；使用MEGA 5.05采用Neighbor-joining (NJ)法构建进化树。

1.3   实验材料、样品采集和感染实验

实验用杂色鲍取自中国水产科学研究院南海水产研究所深圳试验基地，运到实验室后，暂养2周。在此期间，海水水温保持在26 ℃，盐度为30。感染用哈维弧菌为杂色鲍致病菌，由本实验室保存。分别从6只健康鲍中取肠、头、足、外套膜、鳃和肝胰腺，用于HdDef1 mRNA的组织特异性表达分析。在感染实验中，将50 μL (1.6×10⁶ CFU·mL⁻¹)的哈维弧菌稀释液以足部注射方式感染杂色鲍，对照组注射等量的无菌过滤海水(SSW)，在感染后的第2、第4、第6、第12、第24、第48和第72小时采集杂色鲍肝胰腺组织，所有采集样品都经过液氮速冻后−80 ℃保存备用。

1.4   RNA提取和cDNA合成

使用TRIzol试剂盒(Invitrogen，Carlsbad，CA，USA)根据说明书从所有收集的组织中提取总RNA。使用NanoDrop 2000 (Thermo Scientific，Waltham，MA，USA)检测RNA含量，通过1%琼脂糖凝胶电泳检查RNA完整性。采用PrimeScript^TM RT试剂盒(TaKaRa，大连)，在20 μL反应系统中，以1 μg总RNA合成第一链cDNA。反转录中，选用RNA模板的OD₂₆₀/OD₂₈₀均介于1.8和2.0。

1.5   HdDef1表达的荧光定量PCR分析

在LightCycler^®480 (Roche Biochemicals, Indianapolis，IN，USA)上使用SYBR^® Premix Ex Taq^TM II (TaKaRa，大连)试剂盒进行荧光定量分析。选择18S rRNA作为参考基因。实验中使用的相关引物见表1。扩增条件为：95 ℃ 5 min；95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，40个循环。最后进行扩增产物的溶解曲线分析。所有实验包含3个技术重复和3个生物学重复，采用2^−ΔΔCT法^[18]获得基因表达量。

1.6   统计分析

数据采用“平均值±标准误($\overline X \pm {\rm SEM }$)”表示。使用SPSS 19.0统计软件对所有数据进行单因素方差分析(ANOVA)，显著性差异设置为P<0.05。

2.   结果

2.1   目的基因cDNA序列分析

杂色鲍HdDef1 cDNA(GenBank登录号：MK358140)的全长为306 bp，由201 bp的开放阅读框(ORF)、21 bp的5' 非编码区(UTR)和84 bp的3' UTR组成。3' UTR具有典型的多聚腺苷酸加尾信号(AATAAA)和一个多聚A尾。该基因编码66个氨基酸，预测分子量为4.90 kD，理论等电点(pI)为7.82。预测信号肽为N端的1~18个氨基酸，成熟肽中含有6个保守的半胱氨酸残基(图1)。使用APD3软件对HdDef1成熟肽的抗菌特征进行预测，结果显示HdDef1具抗菌肽的特点，如较高的疏水残基比(45%)和净阳性电荷(+1)。

图  1  HdDef1基因的核苷酸序列和氨基酸序列

起始密码子(ATG)和终止密码子(TGA)以红色显示，预测的信号肽使用阴影覆盖，经典的多聚腺苷酸化加尾信号用下划线标示，半胱氨酸残基使用方框标记

Figure  1.  Nucleotide and deduced amino acid sequences of HdDef1

Translation start (ATG) and stop (TGA) codons are highlighted in red. The predicted signal peptide is shaded. The classical polyadenylation signal is underlined. Cysteine residues are boxed.

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将杂色鲍HdDef1与GenBank中其他软体动物和节肢动物防御素的蛋白序列进行比对时发现，杂色鲍HdDef1与其他品种鲍防御素具有最高的相似性，如日本盘鲍(H. discus discus)、皱纹盘鲍(H. discus hannai)和日本鲍螺(H. madeka)，其相似性分别为71.21%、71.21%和72.73%；其次，与来自节肢动物的防御素有较高的相似性，如印度跳蚁(Harpegnathos saltator)、黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)和冈比亚按蚊(Anopheles gambiae)，其相似性分别为50.04%、32.54%和30.80%；然而，与海洋双壳贝类防御素的相似性较低，与紫贻贝(Mytilus galloprovincialis)防御素1的相似性为11.27%，与长牡蛎外套膜防御素的相似性为15%，与菲律宾蛤仔(Ruditapes philippinarum)防御素的相似性为6%。杂色鲍HdDef1的6个半胱氨酸的位置是保守的，且与节肢动物防御素具有相似的二硫键连接模式(C1-C4、C2-C5和C3-C6，图2)。然而，由于2个额外的半胱氨酸残基的存在，在长牡蛎、菲律宾蛤仔和紫贻贝中形成4个二硫键(C1-C5、C2-C6、C3-C7和C4-C8)。此外，在所有物种的防御素中都检测到一个保守的甘氨酸残基(图2)。由Swiss-model预测的杂色鲍HdDef1 3D结构模型与蛋白质数据库中的冈比亚按蚊防御素(2ny9)相似(图3)。这2种防御素都具有一些相似的结构特征，如都含有1个α-螺旋和2个β-折叠，且3个二硫键位于相似的位置。

图  2  杂色鲍HdDef1与其他软体动物和节肢动物防御素成熟肽的多序列比对

黑色阴影显示相同的氨基酸，灰色阴影显示相似的氨基酸，二硫键桥以黑色连线显示

Figure  2.  Multiple alignment of mature HdDef1 sequence and other defensins found in mollusks and arthropod

The black shadow shows identical amino acids and the gray indicates similar amino acids. The disulfide linkages are shown with black lines.

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图  3  杂色鲍HdDef1和冈比亚按蚊防御素结构

A. 冈比亚按蚊防御素的3D结构(PDB登录号：2ny9)；B. 杂色鲍HdDef1的3D结构；C. 杂色鲍HdDef1和冈比亚按蚊防御素的二级结构；6个半胱氨酸残基的相对位置及3个二硫键(半胱氨酸之间的蓝线)用蓝色标记；相似的结构单元用灰色阴影标记

Figure  3.  Structures of HdDef1 and A. gambiae defensin

A. 3D structure of A. gambiae defensin (PDB accession: 2ny9); B. 3D structure of HdDef1; C. secondary structures of A. gambiae defensin and HdDef1; the relative positions of six cysteine residues and three disulfide bonds (blue lines between cysteines) are labelled in blue and the similar elements of structure are shaded in gray.

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使用Mega 5.05将来自软体动物、节肢动物、鱼类和哺乳动物的防御素基于邻接法构建系统发育树(图4)。这些选定的防御素主要分为两大类：无脊椎动物和脊椎动物防御素。在无脊椎动物中，鲍类连同斑马贻贝与节肢动物防御素形成一个分支，而其他双壳贝类防御素形成另一个分支。此外，脊椎动物防御素也分为两大支，分别为鱼类和哺乳动物防御素。

图  4  利用MEGA 5.05基于邻接法构建的HdDef1系统进化树

Figure  4.  Neighbor-joining phylogenetic tree of HdDef1 by MEGA 5.05

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2.2   杂色鲍HdDef1的组织分布

采用qRT-PCR研究了杂色鲍HdDef1的组织分布。在所有组织中都检测到HdDef1的表达，包括肠、头、鳃、足、外套膜和肝胰腺(图5)。HdDef1在肠中的表达量最低；在头、鳃、足和外套膜中的表达量都显著高于肠中的表达量(P<0.05)，但在头、鳃、足和外套膜中表达量差异不显著；肝胰腺中具有最高的表达量并显著高于其他组织(P<0.05)。

图  5  杂色鲍HdDef1的组织表达模式

数据显示为平均值±标准误，小写字母不同表示各组之间具有显著差异(P<0.05)

Figure  5.  Expression level of HdDef1 mRNA in different tissues

Data are shown as $\overline X \pm {\rm{SEM}} $. Different lowercase letters indicate significant difference (P<0.05).

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2.3   病原感染后HdDef1的表达模式

肝胰腺是重要的免疫防御器官，也是HdDef1表达的主要组织，因此本研究检测了杂色鲍经过哈维弧菌感染后，肝胰腺中HdDef1在不同时间点的瞬时表达模式。在感染后的6 h内，HdDef1被诱导表达，且第4和第6小时的表达量显著高于第0小时(P<0.05，图6)。感染后第12小时，HdDef1表达量急剧降低且显著小于第0小时(P<0.05)。之后随着时间的推移，表达量缓慢上调。

图  6  哈维弧菌感染后肝胰腺中HdDef1的时序表达模式

数据显示为平均值±标准误；*. 与0小时对照组差异显著(P<0.05)

Figure  6.  Temporal expression profile of HdDef1 mRNA in hepatopancreas post V. harveyi challenge

Data are shown as $\overline X \pm {\rm{SEM}} $; *. significant difference with control group at 0^th hour (P<0.05)

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3.   讨论

杂色鲍是中国南部沿海地区大规模养殖的经济品种。近年来，由于集约化海水养殖的快速发展和养殖水环境的恶化，增加了杂色鲍对许多病原的易感性(如弧菌属细菌等)。杂色鲍完全依赖于先天免疫，而不具有获得性免疫。因此，亟需掌握杂色鲍先天免疫的基础知识。其中，抗菌肽(AMPs)被认为是海洋无脊椎动物先天免疫系统的主要组成部分^[19-21]。在本研究中，通过转录组测序和RACE技术从杂色鲍中克隆了一种新型防御素HdDef1。

目前，贝类防御素主要分为2种类型。1) 含有6个半胱氨酸残基的多肽，多肽中半胱氨酸残基的排列方式为C-X_5-16-C-X₃-C-X_9-10-C-X_4-7-C-X₁-C，由半胱氨酸形成的二硫键的连接方式为C1-C4、C2-C5和C3-C6；2) 含有8个半胱氨酸残基的多肽，多肽中半胱氨酸残基的排列方式为C-X_5-6-C-X₃-C-X_4-6-C-X_3-4-C-X_7-8-C-X-C-X₂-C，由半胱氨酸形成的二硫键的连接方式为C1-C5、C2-C6、C3-C7和C4-C8^[22-23]。此外，贝类防御素还含有3~4个二硫键稳定的一个α-螺旋和反平行的双链β-折叠结构^{[10, 24]}。在本研究中，杂色鲍HdDef1含有6个半胱氨酸残基，形成3个二硫键(C1-C4、C2-C5和C3-C6)，并以C-X₁₆-C-X₃-C-X₉-C-X₄-C-X₁-C的模式排列。这与日本盘鲍防御素相似，同属于第一种类型^[25]。此外，预测3D模型显示杂色鲍HdDef1同样具有1个α-螺旋和两个反平行的β-折叠链。多重比对和系统发育树分析表明，与含有8个半胱氨酸残基的贝类防御素相比，杂色鲍HdDef1更接近节肢动物防御素。同样，在其他含有6个半胱氨酸残基的贝类防御素中也发现了类似现象，包括斑马贻贝^[11]和翡翠贻贝^[13]等。

由于参与抗菌活动的空间部位不同，贝类防御素具有多种组织表达模式。外套膜是贝类暴露于海洋环境中最多的组织之一，是免疫防御的第一道防线^[26-27]。一些贝类的防御素主要分布于该组织中，包括日本盘鲍^[25]和长牡蛎^[14]。血细胞是无脊椎动物免疫的主要细胞效应物，血细胞可将大量的可溶性抗微生物和细胞毒性物质分泌到血淋巴中。在花蛤中，血细胞为防御素表达的主要组织^[3]。在贻贝中，防御素(MGD1和MGD2)仅在血细胞中产生^[28]。由于和足丝形成相关，斑马贻贝的防御素主要在足部表达^[11]。在本研究中，杂色鲍肝胰腺为表达HdDef1的主要组织，与翡翠贻贝防御素的组织表达分布一致^[13]。肝胰腺是一种重要的免疫组织，它可以合成免疫因子，启动免疫体液反应，并含有许多高度特化的细胞和巨噬细胞^[29-30]，因此HdDef1在肝胰腺中的高表达可能与此有关。

为探讨细菌感染后杂色鲍HdDef1的表达情况，本研究检测了杂色鲍经革兰氏阴性细菌(哈维弧菌)感染后72 h内，肝胰腺中HdDef1的相对表达水平。结果显示，哈维弧菌可显著诱导杂色鲍肝胰腺HdDef1表达。在经过革兰氏阴性菌感染后，斑马贻贝^[11]、美洲牡蛎(Crassostrea virginica)^[31]和翡翠贻贝^[13]的防御素也可被诱导表达。然而，这与长牡蛎的研究结果不同。长牡蛎防御素主要抑制革兰氏阳性菌的生长，而对革兰氏阴性菌的抑制效果有限^[32-33]。在注射哈维弧菌后的第6小时，HdDef1 mRNA达到最高表达水平。而翡翠贻贝和菲律宾蛤仔防御素分别在感染后的第24和第12小时具有最高表达^[13,34]，这可能与物种的生理状态和感染细菌剂量的不同有关。在感染后的第12小时，杂色鲍HdDef1的表达量急剧下降；随后，在第24、第48和第72小时逐渐恢复，此结果与池蝶蚌(Hyriopsis schlegelii)类似^[12]。作为防御反应的第一道防线，杂色鲍HdDef1的下调表达可能与病原体的逐步清除有关。随着病原体的持续入侵，有其他细胞因子开始被转录，以增强免疫防御反应，弥补防御素的衰竭。综上，哈维弧菌感染后杂色鲍肝胰腺HdDef1能够被显著诱导表达，但病原体感染后HdDef1的潜在作用机制还需要进一步研究。