Bacteriostasis and safety evaluation of two lactic acid bacteria
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摘要:
该研究利用无菌操作技术对2株乳酸菌[乳酸菌S60 (干酪乳杆菌Lactobacillus casei) 和S72 (植物乳杆菌Lactobacillus plantarum)]开展了常规生化检测、药敏实验、体外抑菌实验和动物实验，验证了其作为渔用益生菌的可行性和安全性。结果显示，2株乳酸菌均能在pH为4.5和0.1%的胆盐环境中存活，对水产动物常见病原菌嗜水气单胞菌 (Aeromonas hydrophila) 等均有一定的抑制作用，且抑菌物质分析结果显示，其有效抑菌物质与其代谢过程中产生的有机酸类相关。安全性评价实验结果显示2株乳酸菌无分解明胶和溶血的能力。死亡统计和血液生化指标结果显示，高达1.0×109 CFU·mL−1的活菌腹腔注射攻毒并未引起实验鱼类[异育银鲫 (Carassius auratus)]的严重死亡和机体损伤。可见2株乳酸菌作为口服益生菌具有较高的安全性。此外，耐药特性研究表明，2株乳酸菌对所用药物中的氨基糖苷类和磺胺甲唑耐受能力强，对氨苄青霉素、恩诺沙星、氟苯尼考和多西环素敏感。因此，2株乳酸菌的应用需要注意管理过程中药物的选择。
Abstract:In this study, two strains of lactic acid bacteria [Lactobacillus casei (S60) and L. plantarum (S72)] were tested by aseptic technique, including routine biochemical detection, susceptibility test, in vitro bacteriostasis test and animal experiment. Their feasibility and safety as probiotics for fishing were also verified. Results show that the two lactic acid bacteria could tolerate acid (pH 4.0) and bile salt (0.1%), and exhibit different antibacterial activities against six pathogens including Aeromonas hydrophila. The results of antimicrobial substances analysis shows that the effective antimicrobial substances were related to the organic acids produced in metabolic process. The results of safety evaluation shows that the two strains of lactic acid bacteria had no ability to decompose gelatin and hemolysis. The results of death statistics and blood biochemical indicators show that the intraperitoneal injection of live bacteria as high as 1.0×109 CFU·mL−1 did not cause serious death and body injury in experimental fish. It is included that the two strains of lactic acid bacteria have high safety as oral probiotics. Drug resistance studies show that the two strains of lactic acid bacteria had strong tolerance to aminoglycosides and sulfamethoxazole, and were sensitive to ampicillin, enrofloxacin, florfenicol and doxycycline. Therefore, the application of the two strains of lactic acid bacteria should pay attention to the selection of drugs in management process.
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Keywords:
- lactic acid bacteria /
- probiotic properties /
- safety /
- drug susceptibility test
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中华绒螯蟹 (Eriocheir sinensis) 俗称河蟹，是我国重要的水生经济生物之一，其养殖业已成为我国最具特色和发展潜力的支柱产业之一，2022年产量高达81万吨[1]，但在养殖产量创新高的同时，由养殖引发的水质污染问题也日益凸显。据报道，上海松江泖港地区成蟹养殖造成水体总氮 (Total nitrogen, TN)、总磷 (Total phosphorus, TP)、pH和高锰酸钾指数 (CODMn) 超标[2]。东太湖中华绒螯蟹围网养殖区的CODMn、TN、硝酸盐氮 (${\mathrm{NO}}_3^{\text{−}} $-N)、透明度等水质指标均略差于非养殖区[3]。同时，中华绒螯蟹养殖尾水的排放会影响周边水域，Zeng等[4]的研究表明中华绒螯蟹养殖排放尾水增加了古城湖被污染的风险。
零换水养殖模式可作为应对中华绒螯蟹池塘水质污染问题、缓解养殖尾水对周边水域的环境压力的潜在解决方案。该模式基于水质指标、养殖容量、中华绒螯蟹摄食量等考虑，具有池塘只进水、零排放的特点。现有研究表明，零换水养殖模式应用于草鱼 (Ctenopharyngodon idella)-鳙 (Aristichthys nobilis) -鲫 (Carassius carassius) 混养，能够显著降低养殖池塘水体的营养盐积累，有效提高养殖系统物质的利用率[5-6]。然而，目前尚未见关于该模式下不同水草对中华绒螯蟹池塘水质影响的研究。
水草在中华绒螯蟹养殖中发挥着至关重要的作用。作为中华绒螯蟹的天然饵料，水草内含的营养物质可以改善中华绒螯蟹的生长和营养品质[7]；水草可为中华绒螯蟹提供蜕壳、栖息、遮蔽的场所，显著降低其蜕壳死亡率[8]；也可净化水质，通过吸收TP抑制蓝藻的爆发[9]。但不同水草对水质的净化效果存在差异，因此需要引入水质评价方法来量化零换水养殖模式下不同水草的水质净化能力。
水质评价基于物理、化学、生物等水质指标，通过评估工具，按照相关标准，有效识别地表水的水质等级，为科学保护和利用水资源提供有力支持。单因素评价法 (Single-factor assessment, SF)[10] 以水体最大污染指标来评价水质，反映水体主要超标情况，虽简单直观，但无法全面评估水质；平均污染指数 (Overall index of pollution, OIP)[11-12]克服了单因素评价法的缺点，给予所有水质指标同等权重，更全面地评估水体情况；加拿大环境部长理事会水质指数 (Canadian Council of Ministers of the environment water quality index, CCME WQI) [13-14]基于至少4个水质指标，通过F1 (范围)、F2 (频率)、F3 (幅度) 生成一个无量纲常数，评价结果准确客观，被广泛用于水质评估，可用于建立评估生活饮用水健康风险的标准[15]；主成分分析 (Principal component analysis, PCA) 法[16]将众多参数优化成主要的参数，即使用少数主成分来表示水质情况。尽管目前关于养殖水体评价的研究相对有限，但鉴于水质评价的适用范围，使用水质评价来研究池塘养殖水质具有可行性。因此，本研究以伊乐藻 (Elodea nuttallii)、苦草 (Vallisneria natans) 和轮叶黑藻 (Hydrilla verticillata) 的零换水池塘为实验组，以水源组为对照组，通过多种水质评价方法比较了中华绒螯蟹养殖池塘水质的差异，以期为该模式的推广提供科学依据。
1. 材料与方法
1.1 实验池塘
实验地点位于江苏省宿迁市霸王蟹产业发展中心 (118°4'60''E, 34°3'54''N)。选用9个面积相等 (长12 m×宽12 m×深1.5 m) 的室外养殖池塘作为实验池塘。池塘分为3组，于2023年4月初分别种植伊乐藻 (Class I)、苦草 (Class II) 和轮叶黑藻 (Class III)，其中苦草选择改良后的四季常青苦草。水草种植选择大小相近的植株，并根据植株规格决定水草种植密度为3 株·丛−1，每丛间隔30 cm。5月初选择水草长势良好的池塘投放140 只·kg−1扣蟹，放养密度为1.5 只·m−2。每天16:00投喂颗粒饲料，养殖后期增加冰鲜鱼，投喂量为塘内蟹体质量的 3%~5%，视中华绒螯蟹摄食情况调整，实验过程中所有实验池塘中华绒螯蟹饲料投喂量一致。实验池塘配备了底层微孔增氧装置，并在夜晚持续运行。实验期间，池塘除加注一斗渠河道内水源 [对照组 (CK)] 外，保持封闭状态，与外界水体零交换。
1.2 水样的监测
水样的监测于2023年5月10日—9月28日进行，每隔20 d采样1次，共计8次，监测时间覆盖扣蟹的养殖周期。由于实验池塘面积不足4 000 m2，按照采样标准，在池塘中间采集水样。对照组水样的采集遵循标准HJ/T 52—1999《水质河流采样技术指导》，采样点设置在河道两侧以及中间位置。水样放置在干净的300 mL聚乙烯瓶中，带回实验室进行测定。
测定指标包括pH、溶解氧 (Dissolved oxygen, DO)、CODMn、TN、氨氮 (${\mathrm{NH}}_4^{\mathrm{+}} $-N)、${\mathrm{NO}}_3^{\text{−}} $-N、亚硝酸盐氮 (${\mathrm{NO}}_2^{\text{−}} $-N)、TP和磷酸盐 (PO4 3−-P)。DO使用便携式多参数水质分析仪 (HQ30d，美国哈希公司) 现场测定，pH用便携式pH计 (PH200，哈维森环境科技有限公司，中国) 测定。其他指标在实验室使用分光光度计 (DR6000，美国哈希公司) 测定，测定方法分别为：CODMn 使用酸性高锰酸钾法，TN使用碱性过硫酸钾消解紫外分光光度法，${\mathrm{NH}}_4^{\mathrm{+}} $-N使用水杨酸法，${\mathrm{NO}}_3^{\text{−}} $-N使用镉还原法，${\mathrm{NO}}_2^{\text{−}} $-N使用N-(1-萘基)-乙二胺分光光度法，TP使用钼酸铵分光光度法，${\mathrm{PO}} _4^{3-} $-P使用抗坏血酸TNT法。营养盐和有机污染综合指标的测定均遵循《水和废水监测分析方法》[17]的标准操作。
1.3 蟹数据采集
实验结束后，随机采集雄蟹和雌蟹各8只作为样本，擦去体表水分后称其终末体质量 (精确至0.01 g)，接着解剖取出全部肝胰腺和性腺称质量。计算特定生长率 (Specific growth rate, SGR)、肝胰腺指数 (Hepatosomatic index, HSI) 和性腺指数 (Gonadosomatic index, GSI)，计算公式为：
$$ \begin{array}{c}{\mathrm{SGR}}=\dfrac{\left(\mathrm{l}\mathrm{n}W-\mathrm{l}\mathrm{n}{W}_{0}\right)}{T}\times 100 {\text{%}}\end{array} $$ (1) $$ \begin{array}{c}{\mathrm{HSI}}=\dfrac{{W}_{\mathrm{H}}}{W}\times 100{\text{%}} \end{array} $$ (2) $$ \begin{array}{c}{\mathrm{GSI}}=\dfrac{{W}_{\mathrm{G}}}{W}\times 100{\text{%}} \end{array} $$ (3) 式中：W为雄蟹或雌蟹的终末体质量 (g)；W0为初始体质量 (g)；T为养殖时间 (d)；WH为肝胰腺质量 (g)；WG为性腺质量 (g)。
1.4 数据分析
使用Microsoft Office Excel 2023和SPSS 27.0软件进行统计分析，同时采用GraphPad Prism 9.5.0软件制作图表。通过单因素方差分析 (One-way ANOVA) 和最小显著性差异 (Least significant difference, LSD) 多重比较法确定各组数据的显著性差异，当p<0.05，认为差异显著。实验数据以“平均值±标准差 ($\bar x $±s) ”表示。为保持评价方法的一致性，均使用相同的水质指标和水质标准。pH、DO、CODMn、TN、${\mathrm{NH}}_4^{\mathrm{+}} $-N、${\mathrm{NO}}_3^{\text{−}} $-N和TP的标准值采用《地表水环境质量标准》(GB 3838—2002) 规定的II类标准值，对未规定的水质指标 ${\mathrm{PO}} _4^{3-}$-P和 ${\mathrm{NO}}_2^{\text{−}} $-N分别参考GB 8979—1996《污水综合排放标准》和GB 5749—2022《生活饮用水卫生标准》的标准值。
1.5 研究方法
1.5.1 单因素评价法
单因素评价法是指将水质指标的监测值与该参数的标准值进行比较，根据其中最差的一项水质指标结果来评价水质类型，计算公式为：
$$ \begin{array}{c}{P}_{i}=\dfrac{{C}_{i}}{{S}_{i}} \end{array} $$ (4) 式中：Pi为因子i的水质指数；Ci为因子i的监测值；Si为因子i的标准值。对于特定水质参数pH和DO，采用其他公式计算 [《环境影响评价技术导则 地表水环境》(HJ 2.3—2018)]。
1.5.2 平均污染指数
平均污染指数属于算术均值型指数，该法在单项污染指数 (即单因素评价法中Pi) 基础上，通过对每个水质指标同等赋权综合得到平均污染指数，计算公式为：
$$ \begin{array}{c}P=\dfrac{1}{n}\displaystyle\sum\limits _{i=1}^{n}{P}_{i} \end{array} $$ (5) 式中：Pi为指标i的水质指数；n为参数的个数。
1.5.3 CCME WQI指数计算
CWQI是由英国哥伦比亚大学建立的WQI (Water quality index) 改进而成，由加拿大环境部长理事会建立[18]。CWQI的水质参数、水质标准值等可以取决于当地水质条件、指数使用目的[19]，计算公式为：
$$ \begin{array}{c}\text{C}\text{W}\text{Q}\text{I}=100-\left(\dfrac{\sqrt{F{1}^{2}+F{2}^{2}+F{3}^{2}}}{1.732}\right) \end{array} $$ (6) $$ \begin{array}{c}F1=\dfrac{{P}}{{N}}\times 100 \end{array} $$ (7) $$ \begin{array}{c}F2=\dfrac{{q}}{{M}}\times 100 \end{array} $$ (8) $$ \begin{array}{c}F3=\left(\dfrac{Q}{0.01Q+0.01}\right) \end{array} $$ (9) 式中：F1为范围，表示超标的水质参数个数占总参数个数的百分比；F2为频率，表示超标的监测次数占总监测次数的百分比；F3为幅度，表示监测值偏离标准值的程度；P为超标的参数个数；N为总参数的个数；q为超标的监测次数；M为监测的总次数；Q为标准化偏移总和，计算方法是将各个测试值的偏移量相加并除以监测的总次数，计算公式为：
$$ \begin{array}{c}{E}_{i}=\dfrac{{C}_{i}}{{S}_{i}}-1 \end{array} $$ (10) $$ \begin{array}{c}{{E}}_{i}=\dfrac{{S}_{i}}{{C}_{i}}-1 \end{array} $$ (11) $$ \begin{array}{c}Q=\dfrac{\left({\displaystyle\sum }_{i=1}^{n}{{E}}_{i}\right)}{{M}} \end{array} $$ (12) 式中：Ei为指标i对应的偏移量。对于越小越优型指标，选择公式 (10)，而对于越大越优型指标，则选择公式 (11)。
1.5.4 主成分分析
主成分分析的基本步骤是首先将原始数据标准化，然后建立变量之间的相关系数矩阵R，并计算出矩阵R的特征值和特征向量，写出特征值≥1的主成分，根据其对应的累计贡献率计算综合得分。
2. 结果
2.1 零换水池塘和水源水环境调查结果
2023年5月10日—9月28日中华绒螯蟹零换水池塘和水源水各水质指标监测结果见表1和图1。CK组pH变化较小 (7.51~7.68)，而Class I—III组pH波动较大，且总体上表现为大于CK组。所有组中Class III组pH超标的月份最多。CK组DO状况最差，未能达到地表水II类标准，而Class I—III组DO甚至优于地表水I类标准。CODMn除初次监测各组浓度不一致外，后续监测基本同步变化，且在第2次监测中观察到超标情况。各组的TN浓度呈现上升趋势，且均存在不同程度的超标情况，其中Class III组TN污染水平最低。${\mathrm{NH}}_4^{\mathrm{+}} $-N表现为CK组远大于Class I—III组，其次各组的 ${\mathrm{NH}}_4^{\mathrm{+}} $-N峰值出现在养殖的不同时期。CK与Class I—III组 ${\mathrm{NO}}_3^{\text{−}} $-N浓度远低于地表水II类标准。TP与TN情况一致，各组在不同月份存在不同程度的超标情况，其中Class III组TP出现异常超标。CK组PO4 3−-P表现优于Class I—III组，未监测到超标，而Class I—III组PO4 3−-P均监测到超标情况，其中Class III组的PO4 3−-P严重超标。各组 ${\mathrm{NO}}_2^{\text{−}} $-N浓度未超出限值，但CK组 ${\mathrm{NO}}_2^{\text{−}} $-N表现远差于Class I—III组。
表 1 各组水质结果和超标情况Table 1. Water quality results and excess condition in each group水质指标
Water quality index组别 Group 标准值
Standard value来源
Source对照 CK Class I Class II Class III pH 7.58 8.83 9.11* (1.06) 9.03* (1.02) 6~9 地表水环境质量标准 溶解氧DO/(mg·L−1) 4.74* (2.89) 9.70 8.71 9.90 ≥6.0 地表水环境质量标准 高锰酸钾指数CODMn/(mg·L−1) 3.35 3.38 3.29 3.40 ≤4.0 地表水环境质量标准 总氮TN/(mg·L−1) 2.62* (4.24) 1.98* (2.96) 2.1* (3.19) 1.59* (2.18) ≤0.5 地表水环境质量标准 氨氮NH4 +-N/(mg·L−1) 0.66* (0.32) 0.23 0.19 0.24 ≤0.5 地表水环境质量标准 硝酸盐氮 NO3 −-N/(mg·L−1) 0.88 0.64 0.26 0.21 ≤10.0 地表水环境质量标准 总磷TP/(mg·L−1) 0.65* (5.54) 0.69* (5.89) 0.69* (5.89) 1.80* (16.99) ≤0.1 地表水环境质量标准 磷酸盐PO4 3−-P/(mg·L−1) 0.24 0.22 0.22 0.94* (0.88) ≤0.5 污水综合排放标准 亚硝酸盐氮NO2 −-N/(mg·L−1) 0.263 0.021 0.009 0.012 ≤1.0 生活饮用水卫生标准 注：*. 指标不符合标准值。表中结果以总平均值表示，括号内数据为超标倍数。 Note: *. The index does not meet the standard value. The results in the table are expressed as the total average, and the data in parentheses are multiples of the excesss. ![]()
图 1 各组水质理化参数变化和超标情况注：横虚线为该水质指标的标准值。监测序数1—8分别对应监测日期为5月10日、5月31日、6月21日、7月11日、7月31日、8月20日、9月9日、9月28日。Figure 1. Change in physicochemical parameters and excess condition of water quality in each groupNote: The horizontal dashed lines represent the standard value of this water quality index. The monitoring serial numbers 1−8 correspond to the monitoring dates of May 10, May 31, June 21, July 11, July 31, August 20, September 9 and September 28, respectively.2.2 水质评价
2.2.1 单因素评价结果
单因素评价以总平均值计算 (表1)。结果显示，CK组的4个指标超标，其中DO超标值为4.74 mg·L−1，TN、${\mathrm{NH}}_4^{\mathrm{+}} $-N和TP的超标倍数分别为4.24、0.32和5.54，主要污染物为TN和TP。Class I组主要污染物TN和TP的超标倍数分别为2.96和5.89。Class II组3个指标超标，其中pH超标值为9.11，TN和TP的超标倍数分别为3.19和5.89。Class III组4个指标均不符合标准，pH超标值为9.03，TN、TP和${\mathrm{PO}}^{3{\text{−}}}_4 $-P的超标倍数分别为2.18、16.99和0.88。所有组别水质的单因素评价结果均为V类水。
2.2.2 平均污染指数评价结果
根据平均污染指数P值划分水质类别，依次为：P≤0.20，清洁；P值介于0.21~0.40，尚清洁；P值介于0.41~1.00，轻度污染；P值介于1.01~2.00，重度污染；P≥2.01，严重污染。CK组P值为2.00，水质类别为重度污染。各指标的平均贡献率依次为：pH 1.62%、DO 16.19%、CODMn 4.66%、TN 29.15%、${\mathrm{NH}}_4^{\mathrm{+}} $-N 7.34%、${\mathrm{NO}}_3^{\text{−}} $-N 0.49%、TP 36.40%、${\mathrm{PO}}^{3{\text{−}}}_4 $-P 2.69% 和 ${\mathrm{NO}}_2^{\text{−}} $-N 1.47%。Class I组P值为1.65，水质类别为重度污染。各指标的平均贡献率依次为：pH 6.18%、DO 8.34%、CODMn 5.71%、TN 26.17%、${\mathrm{NH}}_4^{\mathrm{+}} $-N 3.05%、${\mathrm{NO}}_3^{\text{−}} $-N 0.43%、TP 46.49%、${\mathrm{PO}}^{3{\text{−}}}_4 $-P 2.94% 和 ${\mathrm{NO}}_2^{\text{−}} $-N 0.14%。Class II组P值为1.59，水质类别为重度污染。各指标的平均贡献率依次为：pH 7.39%、DO 3.55%、CODMn 5.75%、TN 29.30%、${\mathrm{NH}}_4^{\mathrm{+}} $-N 2.59%、${\mathrm{NO}}_3^{\text{−}} $-N 0.18%、TP 48.16%、${\mathrm{PO}}^{3{\text{−}}}_4 $-P 3.02%和 ${\mathrm{NO}}_2^{\text{−}} $-N 0.06%。Class III组P值为2.97，水质类别为严重污染。各指标的平均贡献率依次为：pH 3.79%、DO 5.04%、CODMn 3.18%、TN 11.88%、${\mathrm{NH}}_4^{\mathrm{+}} $-N 1.76%、${\mathrm{NO}}_3^{\text{−}} $-N 0.08%、TP 67.22%、PO4 3−-P 7.01% 和 ${\mathrm{NO}}_2^{\text{−}} $-N 0.04% (图2)。
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图 2 平均污染指数评价中各水质指标平均贡献率注：图中监测序数1—8分别对应监测日期为5月10日、5月31日、6月21日、7月11日、7月31日、8月20日、9月9日、9月28日。Figure 2. Average contribution rate of each water quality index in average pollution index evaluationNote: The monitoring serial numbers 1—8 correspond to the monitoring dates of May 10, May 31, June 21, July 11, July 31, August 20, September 9 and September 28, respectively.根据平均污染指数的结果，水质从好到差排序依次为Class II、Class I、CK和Class III组，表明水草类型对养殖池塘水质产生了一定影响。
2.2.3 CWQI评价结果
CK组共有4个指标 (DO、TN、${\mathrm{NH}}_4^{\mathrm{+}} $-N、TP) 超标，29次监测未达到标准值，CWQI得分53.93，水质级别为及格；Class I组2个指标 (TN、TP) 超标，20次监测未达到标准值，CWQI得分64.60，水质级别为中等；Class II组3个指标 (pH、TN、TP) 超标，20次监测未达到标准值，CWQI得分61.14，水质级别为中等；Class III组4个指标 (pH、TN、TP、PO4 3−-P) 超标，28次监测未达到标准值，CWQI得分47.48，水质级别为及格。根据CWQI得分得出，Class I和Class II组水质优于CK和Class III组 (表2)。
表 2 各组别CWQI结果和评价等级Table 2. CWQI result and evaluation grade for each group组别
GroupCWQI 评价等级
Evaluation
gradeF1
范围
ScopeF2
频率
FrequencyF3
幅度
Amplitude结果
Result对照 CK 44.44 40.28 53.93 53.43 及格 Class I 22.22 27.78 49.93 64.60 中等 Class II 33.33 29.17 50.68 61.14 中等 Class III 44.44 38.89 69.2 47.48 及格 注：根据CWQI值将评价结果分为5类：得分95~100，水质级别为极好；得分80~94，水质级别为好；得分60~79，水质级别为中等；得分45~59，水质级别为及格；得分0~44，水质级别为差。 Note: The evaluation results are divided into five categories according to the CWQI value. When the score is 95−100, the water quality is excellent; when the score is 80−94, the water quality is good; when the score is 60−79, the water quality is medium; when the score is 45−59, the water quality is a pass; when the score is 0−44, the water quality is poor. 2.2.4 主成分得分结果
将所有水质的月均值数据按照时间序列进行主成分分析。结果显示，KMO (Kaiser-Meyer-Olkin) 值为0.605，Barlett球形检验Sig值小于0.001，满足主成分分析要求。根据特征值和贡献率大小，一共提取出3个主成分，其特征值分别为3.744、2.110和1.315，对应的方差贡献率依次为41.60%、23.45%和14.61%，累计贡献率为79.66%，表明本次主成分提取有效。主成分载荷 (表3) 表明，PC1 (绝对值>0.8)为pH、${\mathrm{NH}}_4^{\mathrm{+}} $-N和 ${\mathrm{NO}}_2^{\text{−}} $-N；PC2 (绝对值>0.9)为TP和PO4 3−-P；第3主成分 (绝对值>0.7)为TN。主成分得分结果显示Class I—III组得分整体低于CK组 (图3)。
表 3 各指标载荷Table 3. Load of each index水质参数
Water quality parameter主成分 Principle component PC1 PC2 PC3 pH −0.831 −0.106 −0.352 溶解氧DO −0.795 −0.230 −0.023 高锰酸钾指数CODMn −0.270 −0.486 0.661 总氮TN 0.459 0.104 −0.749 氨氮NH4 +-N 0.829 0.167 0.273 硝酸盐氮NO3 −-N 0.757 −0.289 −0.187 总磷TP −0.236 0.903 0.168 磷酸盐PO4 3−-P −0.211 0.932 0.102 亚硝酸盐氮NO2 −-N 0.881 0.046 0.212 ![]()
图 3 各组主成分得分动态变化注：图中监测序数1—8分别对应监测日期为5月10日、5月31日、6月21日、7月11日、7月31日、8月20日、9月9日、9月28日。Figure 3. Dynamic changes of principal component score in each groupNote: The monitoring serial numbers 1−8 correspond to the monitoring dates of May 10, May 31, June 21, July 11, July 31, August 20, September 9 and September 28, respectively.2.3 中华绒螯蟹养殖性能和品质
中华绒螯蟹养殖性能和品质结果见表4。Class III组中华绒螯蟹终末体质量高于Class I和Class II组，其中雄蟹终末体质量组间存在显著性差异 (p<0.05)。Class III组的特定生长率大于其他2组。肝胰腺指数GSI结果显示，Class III组雄蟹GSI显著小于Class I和Class II组(p<0.05)，3组间雌蟹GSI无显著性差异 (p>0.05)。在性腺指数HSI方面，Class I组雄蟹HSI显著大于Class II和Class III组 (p<0.05)，3组间雌蟹HSI无显著性差异 (p>0.05)。
表 4 不同组别中华绒螯蟹养殖性能和品质Table 4. Aquaculture performance and quality of E. sinensis in different groups项目Item Class I Class II Class III 雄蟹
Male crab雌蟹
Female crab雄蟹
Male crab雌蟹
Female crab雄蟹
Male crab雌蟹
Female crab终末体质量 Final body mass/g 213.7±10.9a 128±7.7a 210.6±6.8a 130.8±7.7a 220.8±6.9b 133.4±5.6a 特定生长率 SGR /(%·d−1) 1.59 1.35 1.58 1.36 1.60 1.37 肝胰腺指数 GSI/% 8.0±0.6a 11.3±0.8a 7.8±1.3a 11.4±0.5a 7.4±0.2b 11.6±0.4a 性腺指数 HSI/% 2.8±0.2a 7.3±0.6a 2.5±0.3b 7.2±0.4a 2.6±0.2b 7.2±0.4a 注：同行数据上标字母不同表示组间差异显著 (p<0.05)。 Note: Values with different superscripts within the same row are significantly different (p<0.05). 3. 讨论
3.1 零换水池塘和水源水环境调查分析
零换水池塘和水源水环境调查结果显示，3组池塘与水源组的pH、DO、TN、${\mathrm{NH}}_4^{\mathrm{+}} $-N、${\mathrm{NO}}_3^{\text{−}} $-N和 ${\mathrm{NO}}_2^{\text{−}} $-N存在相同的差异。3组池塘由于人工栽植，其沉水植物的密度和生物量远高于天然河道，而水体pH随着沉水植物的生物量增长而升高[20]，因此池塘水体的pH偏高。中华绒螯蟹养殖池塘水体的DO模型显示，有88.2%的DO来源于水生植物的光合作用，9.2%来源于机械曝气[21]。本研究中池塘DO高于水源水的这部分浓度，推测可能大部分来源于水生植物的光合作用。中华绒螯蟹养殖池塘中氮 (N) 的主要来源是投喂的配合饲料[22]，但由于沉水植物的吸收固化作用[23-25]，导致3组池塘TN和含N营养盐 (${\mathrm{NH}}_4^{\mathrm{+}} $-N、${\mathrm{NO}}_3^{\text{−}} $-N和 ${\mathrm{NO}}_2^{\text{−}} $-N) 浓度基本低于水源组。这些差异表明水草的栽植对外界水源具有一定的净化作用。
目前用于中华绒螯蟹养殖池塘的水草种类较多，不同种类的水草及其生长对于各种水质指标的影响存在差异。与伊乐藻和轮叶黑藻相比，苦草对CODMn的净化效能最强[26-27]，因此苦草种植池塘的CODMn总浓度最低。伊乐藻在水温持续高于30 ℃时极易诱发凋亡[28]，进而导致水体固氮能力下降，故养殖中后期即第6和第7次监测时，水体的TN浓度明显高于其他2组。本研究中监测到轮叶黑藻种植池塘的 TP浓度异常增加，究其原因，一方面由于轮叶黑藻对TP的吸收能力较苦草要弱[29-30]；另一方面，养殖后期观察到轮叶黑藻种植池塘有大量残叶漂浮在水面上，而且相较于伊乐藻残叶的分解，轮叶黑藻残叶的分解会释放出更多的磷 (P) 元素[31]。3组池塘中仅苦草种植池塘的${\mathrm{NH}}_4^{\mathrm{+}} $-N在第3次监测中超标，这可能与苦草的生长特性有关。茎叶作为苦草吸收 ${\mathrm{NH}}_4^{\mathrm{+}} $-N的主要部位[32]，其在中华绒螯蟹养殖前期未长全，易造成水体 ${\mathrm{NH}}_4^{\mathrm{+}} $-N积累超标。因此，零换水池塘栽植不同种类的水草会导致水质出现差异。
3.2 水质评价
单因素评价结果显示各组水体均被评为V类水，而主要污染物均为TN和TP。由于单因素评价的特性，无法对同一等级的水体进行优劣比较[33]，因此不能对各组水体的水质进行排序。平均污染指数结果显示，水源水、伊乐藻和苦草种植池塘的水质等级均为重度污染，而轮叶黑藻种植池塘的水质评价为严重污染，主要是由于其TP贡献率高达67.22%。此外，各组TN、TP累计贡献率均超过50%，结合单因素评价的主要污染物结果，表明该区域水体环境富营养化。单因素评价和平均污染指数评价结果表明，降低TN和TP的浓度是提高池塘水质等级的关键。而有研究表明，沉水植物组合能取得比单一植物更好的N、P去除效果[34]，可考虑将沉水植物组合应用到中华绒螯蟹养殖上，进一步提高水质等级。且张光宝等[35]研究证明，轮叶黑藻和伊乐藻混合种植模式可以提高雄蟹的最终体质量、成活率和产量，同时降低饲料系数。
CWQI可以对水体进行定性定量分析。通过各组CWQI水体得分比较零换水养殖模式下不同水草的水质净化能力，由强至弱依次为伊乐藻、苦草和轮叶黑藻。上述结果与前人研究有所差异，黄子贤等[36]对4种沉水植物的N、P去除能力研究表明，轮叶黑藻的水质净化能力并不比伊乐藻和苦草差。本研究中养殖前期的主成分得分也进一步证明，轮叶黑藻种植池塘的水质优于伊乐藻和苦草种植池塘。造成差异的原因可能与养殖生物中华绒螯蟹有关，中华绒螯蟹对轮叶黑藻的破坏作用明显，使得养殖后期轮叶黑藻固定的N、P元素又重新回到水体，轮叶黑藻种植池塘主成分得分上升，水质变差[37]。此外，本研究中各项水质评价结果均较差，这主要是因为采用的水质标准更为严格，若降低水质标准进行评价，其水质评价等级将会上升[38]。
综上所述，在中华绒螯蟹零换水养殖模式下，池塘水质的主要污染物类型为N、P污染，而栽植伊乐藻和苦草可有效抑制N、P污染，提高水质等级，使外界水源用于中华绒螯蟹养殖后得到净化。此外，栽植轮叶黑藻应及时清理中华绒螯蟹破坏的残叶，避免污染水质。因此，在中华绒螯蟹零换水养殖模式中推荐栽植伊乐藻和苦草。未来研究可着眼于探究复合水草种植对零换水池塘水质、中华绒螯蟹品质和产量的影响。
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图 3 2株乳酸菌在血平板上的溶血表现
Figure 3. Hemolysis activity of two strains of lactic acid bacteria on blood plate
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图 5 2株乳酸菌分解明胶的能力
Figure 5. Gelatinolytic activity of two strains of lactic acid bacteria
表 1 乳酸菌对酸、胆盐的耐受能力
Table 1 Acid and bile tolerance of two strains of lactic acid bacteria
n=3 pH 乳酸菌 lactic acid bacteria 胆盐/%
bile salt抑菌圈直径/mm inhibition zone diameter S60 S72 S60 S72 3.5 − − 0 8 8 4.5 + + 0.1 8 8 5.5 + + 0.2 12 12 7.4 + + 0.3 15 16 0.5 19 19 注：−. 无菌生长；+. 有菌生长
Note: −. bacteria can not grow; +. bacteria can grow
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表 2 乳酸菌对鱼源致病菌的抑菌活性
Table 2 Antimicrobial activity of two strains of lactic acid bacteria against six fish pathogens
$\overline{{\mathit{\boldsymbol{ X }}}} {\bf \pm} {\bf{SD,}}\;{\mathit{\boldsymbol{n}}}{\bf = 5} $ 致病菌
pathogens抑菌圈直径/mm inhibition zone diameter S60 S72 嗜水气单胞菌 A. hydrophila 26.88±2.43b 24.9±1.48C 维氏气单胞菌 A. veronii 28.85±2.45b 28.25±2.46B 创伤弧菌 V. vulnificus 33.87±1.96a 35.6±1.07A 无乳链球菌 S. agalactiae 8.33±2.38d 9.7±0.96E 副溶血弧菌 V. parahemolyticus 15.23±0.78c 13.1±1.82D* 迟缓爱德华氏菌 E. tarda 9.23±2.42d 13.05±1.92D* 注：不同大小写字母表示2株乳酸菌分别针对不同病原菌的抑菌能力的差异显著(P<0.05)；*. 2株乳酸菌对同一病原菌的抑菌能力差异显著(P<0.05)Note: Different letters indicate statistical difference in bacteriostatic ability of the same lactobacillus strain among different pathogenic bacteria (P<0.05); *. statistical difference in bacteriostatic ability of different lactobacillus strains on the same pathogenic bacteria (P<0.05)
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表 3 2株乳酸菌的耐药特性
Table 3 Results of antibiotic susceptibility test of two strains of lactic acid bacteria
菌株
bacterial strain药物质量浓度/μg·mL−1 drug concentration S60 S72 抑菌圈直径/mm
inhibition zone diameter256 128 64 32 16 256 128 64 32 16 氨苄青霉素 ampicillin 30 26 24 20 17 40 35 32 30 28 硫酸卡那霉素 kanamycin 8 8 8 8 8 11 8 8 8 8 链霉素 streptomycin 8 8 8 8 8 12 9 8 8 8 恩诺沙星 enoxacin 26 21 19 17 10 19 16 13 8 8 氟苯尼考 flufenicol 32 29 26 20 15 34 29 25 24 18 盐酸多西环素 doxycycline 37 34 28 24 21 34 28 24 21 16 磺胺甲唑 sulfamethoxazole 8 8 8 8 8 8 8 8 8 8 生理盐水 physiological saline 8 8 8 8 8 8 8 8 8 8
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表 4 2株乳酸菌对银鲫血液生化指标的影响
Table 4 Effects of two strains of lactic acid bacteria on blood biochemical index of C. auratus challenged with two lactic acid bacteria
U·L−1；n=5 项目
index对照组
control乳酸菌 lactic acid bacteria 嗜水气单胞菌组
A.hS60 S72 谷丙转氨酶 ALT 6.39±1.94 6.19±3.24 4.96±1.84 4.21±1.19 谷草转氨酶 AST 323.52±65.91 321.44±105.27 391±133.81 330.55±118.34 乳酸脱氢酶 LDH 116.53±38.97 88.54±43.39 65.14±37.26 73.35±31.90
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