2019年我国水产养殖总产量超5 000万t，占水产品总供给量的78%以上^[1]。在水产养殖过程中若管理不善，残余饲料、养殖代谢物和水生生物残体会聚集于水体环境中，形成自源性的养殖尾水或污染物^[2]。当前养殖水体或其尾水的潜在污染源主要有氨氮 (NH₄ ⁺-N)、亚硝氮 (NO₂ ⁻-N)、磷 (P)、有机物及污损生物等^[3]。其中NH₄ ⁺-N、NO₂ ⁻-N等有害氮素在高密度集约化养殖水体中极易大量积累，是影响养殖生物健康的主要胁迫因子^[4-5]，具有严重毒害作用，可致使养殖生物抗病机能下降甚至诱发疾病或死亡^[6-8]。因此，有效控制有害氮素成为水产养殖水环境控制的关键技术环节之一^[9]。

应用微生物处理养殖水体具有环境友好、不易产生二次污染等优点，因此一直被认为是调控或处理水质的优选方法之一^[10-12]。Grommen等^[13]将复合菌液用于养殖尾水氮素净化，4 d内NH₄ ⁺-N即可由10 mg·L⁻¹降至检测限以下。由于硝化菌、反硝化菌相对难以分离纯化，国内外大多数研究者都采用活性污泥来富集培养，较少采用纯菌扩大培养方式^[14-15]。全向春等^[16]从城市污水处理厂活性污泥中筛选了2株假单胞菌 (Pseudomonas aeruginosa和P. putida)，其对模拟废水中的总氮 (TN)、NH₄ ⁺-N、NO₂ ⁻-N的去除率达64%以上。王光玉等^[17]认为基于硝化菌群的富集培养技术所构建的适用于水产养殖的生物脱氮系统，可高效、稳定地去除养殖水体中的有害氮素。但当前在水产养殖领域有关硝化菌群定向培育及硝化功能菌株的研究较少^[18-19]。

笔者从对虾集约化养殖中后期水体中富集驯化获得具有高效去除NH₄ ⁺-N和NO₂ ⁻-N能力的硝化菌群，筛选出土著菌株NB5，开展了不同盐度、pH、温度、通气量条件下菌株NB5生长及其对NH₄ ⁺-N的去除效果研究，并对菌株进行了菌种鉴定，以期分析评估菌株的环境适应性、生态功能效率，并为养殖水体NH₄ ⁺-N去除的实际应用提供菌种资源。

1.   材料与方法

1.1   菌株

菌株NB5筛选自对虾集约化养殖中后期水体的硝化菌群。此硝化菌群经富集驯化获得，原水体环境为盐度23~25，pH 7.3~8.5，温度28~30 ℃。

1.2   培养基

筛选基础液体培养基为：氯化铵 (NH₄Cl) 1 g·L⁻¹，醋酸钠 [C₂H₃NaO₂·3 (H₂O)] 3 g·L⁻¹，酵母膏1 g·L⁻¹，硫酸镁 (MgSO₄) 0.2 g·L⁻¹，磷酸二氢钾 (KH₂PO₄) 0.5 g·L⁻¹，生长因子1 mL·L^{−1 [19-20]}。其中生长因子的配方为氯化钙 (CaCl₂) 50 g·L⁻¹，硫酸锰 (MnSO₄) 2.5 g·L⁻¹，硫酸亚铁 (FeSO₄) 5 g·L⁻¹，谷氨酸 (C₅H₉NO₄) 0.2 g·L⁻¹。固体培养基在上述液体培养基的基础上添加琼脂粉20 g·L⁻¹。种子液培养基为：将基础液体培养基中NH₄Cl的添加量降为0.068 g·L⁻¹。实验培养液为：将筛选基础液体培养基中NH₄Cl的添加量降为0.068 g·L⁻¹，另添加亚硝酸钠 (NaNO₂) 0.134 g·L⁻¹，使培养液的初始NH₄ ⁺-N和NO₂ ⁻-N质量浓度分别约24和20 mg·L⁻¹。

1.3   不同盐度、pH和温度条件下菌株NB5的生长及其对NH₄ ⁺-N和NO₂ ⁻-N的去除效果

实验设置不同的盐度、pH和温度梯度，每组设3个平行。各实验组菌株NB5的初始菌浓度为10⁷个·mL⁻¹，对照组不加菌。将保存的菌株NB5于固体平板活化后，接入600 mL灭菌的实验培养液后放入摇床。实验共9 d，于第0、第1、第2、第3、第4、第5、第6、第9天取样，依照GB 17378.4—2007的方法检测培养液中NH₄ ⁺-N、NO₂ ⁻-N质量浓度，同时用血球计数板在光学显微镜下计数，检测菌量变化。

1.3.1   盐度

实验组的盐度分别设置为5、15、25、35、45，对照组的盐度为25且不加菌。实验的培养温度为30 ℃、转速200 r·min⁻¹、pH 6.0。

1.3.2   pH

实验组的pH分别设置为4.5、6.0、7.5、9.0、10.5，对照组的pH为6.0且不加菌。实验的培养温度为30 ℃、转速200 r·min⁻¹，每天测定培养液pH并进行调节，使各实验组pH维持初始设定水平。

1.3.3   温度

实验组的温度分别设置为5、15、25、30、35和45 ℃，对照组的温度为30 ℃且不加菌。实验的培养温度为30 ℃、转速200 r·min⁻¹，盐度和pH分别设为25和7.5。

1.4   不同通气条件下菌株NB5的生长及其对NH₄ ⁺-N和NO₂ ⁻-N的去除效果

采用Biostat B型自控通气2 L发酵罐，设置1和2 L·min⁻¹ 2个通气量组，每组设3个平行。实验前矫正发酵罐的溶氧和pH，实验过程中系统自动记录溶氧量变化，并自动调节罐内培养液的温度和pH。各实验组菌株NB5的初始菌浓度为10⁷个·mL⁻¹，实验过程中的pH设置为7.5、盐度25、温度30 ℃，转速为200 r·min⁻¹，实验共进行5 d，每天取样，测定指标同1.3。

1.5   菌株鉴定

将菌株NB5于固体平板活化，挑取单菌落，采用细菌基因组提取试剂盒提取DNA。对其16S rDNA片段进行PCR扩增。通用引物8F (5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3')，1492R (5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3')，反应体系50 μL，其中加入2 μL模板DNA。反应条件95 ℃ 4 min；95 ℃ 1 min，48 ℃ 1 min，72 ℃ 2 min，30个循环；72 ℃ 10 min。扩增产物经琼脂糖凝胶电泳检测后，送上海生工生物工程有限公司测序。测序结果在NCBI数据库BLAST检索中进行核酸序列同源性比较，挑选近缘菌株16S rDNA基因序列，利用MEGA 7.0软件以邻接法构建系统发育进化树。根据菌株分子鉴定结果，利用硝酸盐还原的生化鉴定管检测了菌株对硝酸盐的作用特性。

1.6   数据统计分析

NH₄ ⁺-N和NO₂ ⁻-N去除率计算公式为：去除率R= (初始浓度C₀−培养后浓度C_t)/初始浓度C₀×100%。采用SPSS 20.0软件对结果进行方差分析 (ANOVA)，显著水平设为P<0.05。数据以“平均值±标准差 ($\overline X \pm {\rm{SD}} $) ”的形式绘制数据图。

2.   结果

2.1   不同盐度下菌株NB5的生长及其对NH₄ ⁺-N和NO₂ ⁻-N的去除效果

菌株NB5在中高盐度 (盐度25~45) 生长较好，盐度25、35、45的条件下分别在第5、第4、第5天菌量达到最高，超过10⁹个·mL⁻¹ (图1-a)。盐度为15时，菌株NB5的生长延迟，在第6天达到10⁹个·mL⁻¹。盐度5时菌株NB5在第6天后才进入对数生长期。

图  1  不同盐度条件下菌株NB5的菌量、培养液中氨氮和亚硝氮的质量浓度变化

Figure  1.  Changes of strain NB5 amount, ammonia nitrogen and nitrite nitrogen mass concentrations at different salinities

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实验过程中对照组NH₄ ⁺-N质量浓度维持在19.58~24.40 mg·L⁻¹，盐度45、35和25条件下培养液的NH₄ ⁺-N质量浓度均在第4天降至最低，其最大去除率分别为96.24%、88.93%和75.08%，显著高于低盐度组 (盐度5和15，P<0.01)。但在第4天达到最大去除率后，盐度45、35和25的NH₄ ⁺-N质量浓度逐步上升，于第9天回升至11.79~12.77 mg·L⁻¹(图1-b)。在9 d的实验过程中各实验组和对照组培养液中的NO₂ ⁻-N质量浓度介于13.13~20.46 mg·L⁻¹，各组均无显著变化 (P>0.05，图1-c)。

2.2   不同pH下菌株NB5的生长及其对NH₄ ⁺-N和NO₂ ⁻-N的去除效果

菌株NB5在pH 6~9生长良好，pH 6.0、7.5、9.0条件下分别在第4、第1、第1天菌量超过10⁹个·mL⁻¹ (图2-a)。而pH过高 (10.5) 或过低 (4.5)，菌株NB5基本不生长。

图  2  不同pH条件下菌株NB5的菌量、培养液中氨氮和亚硝氮的质量浓度变化

Figure  2.  Changes of strain NB5 amount, ammonia nitrogen and nitrite nitrogen mass concentrations at different pHs

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实验过程中对照组NH₄ ⁺-N质量浓度维持在18.92~23.45 mg·L⁻¹，pH 7.5和9.0培养液的NH₄ ⁺-N质量浓度在第2天降至最低，最大去除率分别为99.53%和99.37%，显著优于pH 6.0条件下的60.07%和pH 10.5组的23.41%及pH 4.5组的14.22% (P<0.01)。但达到最大去除率后，其NH₄ ⁺-N质量浓度逐步上升，于第9天回升至12.48~15.65 mg·L⁻¹ (图2-b)。

在9 d的实验过程中，pH 6.0~10.5实验组和对照组培养液中的NO₂ ⁻-N质量浓度介于15.08~20.87 mg·L⁻¹，无显著差异 (P>0.05，图2-c)。pH 4.5培养液的NO₂ ⁻-N质量浓度在第3天降至最低，其最大去除率为47.96%，显著高于其他组 (P<0.05)。

2.3   不同温度下菌株NB5的生长及其对NH₄ ⁺-N和NO₂ ⁻-N的去除效果

菌株NB5在温度15~35 ℃之间生长良好，在温度15、25、30和35 ℃下分别在第2、第2、第1和第1天菌量超过10⁹个·mL⁻¹，之后维持稳定 (图3-a)。而温度过高 (45 ℃) 或过低 (5 ℃)，菌株NB5生长较慢或基本不生长。

图  3  不同温度条件下菌株NB5的菌量、培养液中氨氮和亚硝氮的质量浓度变化

Figure  3.  Changes of strain NB5 amount, ammonia nitrogen and nitrite nitrogen mass concentrations at different temperatures

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实验过程中对照组NH₄ ⁺-N质量浓度维持在23.56~25.64 mg·L⁻¹，温度30、25、15和35 ℃培养液的NH₄ ⁺-N质量浓度分别在第2、第4、第4和第2天降至最低，最大去除率分别为99.53%、97.22%、97.29%和71.26%，显著优于温度5和45 ℃组 (P<0.01)。温度30、25和35 ℃组在达到最大去除率后，其NH₄ ⁺-N质量浓度逐步上升，于第9天回升至7.40~13.98 mg·L⁻¹(图3-b)，而温度15 ℃组的NH₄ ⁺-N质量浓度一直维持在1.34 mg·L⁻¹以下。在9 d的实验中各实验组和对照组培养液中的NO₂ ⁻-N质量浓度介于16.06~22.57 mg·L⁻¹，各组均无显著变化 (P>0.05，图3-c)。

2.4   不同通气条件下菌株NB5的生长及其对NH₄ ⁺-N和NO₂ ⁻-N的去除效果

菌株NB5在通气量为1和2 L·min⁻¹时均生长良好，在第1天的菌量即超过10⁹个·mL⁻¹，之后维持稳定 (图4-a)。培养液中的溶解氧饱和度在第15小时达到最低，随后不断升高并稳定在85%以上 (图4-b)。菌株NB5在通气量为2和1 L·min⁻¹时，第1天对NH₄ ⁺-N的去除率分别可达99.87%、99.82%，此后这两组培养液中的NH₄ ⁺-N质量浓度略有回升，最后第5天对NH₄ ⁺-N的去除率为85.47%、82.42% (图4-c)。两实验组的NO₂ ⁻-N质量浓度维持在18.95~23.15 mg·L⁻¹，均无显著变化 (P>0.05，图4-d)。

图  4  不同通气量条件下菌株NB5的菌量和培养液中溶解氧、氨氮、亚硝氮的质量浓度变化

Figure  4.  Changes of strain NB5 amount, dissolved oxygen, ammonia nitrogen and nitrite nitrogen mass concentrations at different ventilations

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2.5   菌株NB5的鉴定

以菌株NB5的16S rDNA序列在美国国家生物技术信息中心 (NCBI) 数据库中进行核酸数据比对，结果显示NB5与Nitratireductor aquimarinus CL-SC21的序列相似度达100%，与该属的其他种，如N. pacificus、N. kimnyeongensis、N. lacus、N. indicus、N. aestuarii等距离较远 (图5)。由此表明，菌株NB5可鉴定为海水硝酸盐还原菌 (N. aquimarinus)。

图  5  菌株NB5的系统发育树

Figure  5.  Phylogenetic tree of strain NB5

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根据菌株的分子鉴定结果，利用硝酸盐还原的生化鉴定管检测了菌株NB5对硝酸盐的作用特性，结果发现菌株NB5具有硝酸盐还原特性。

3.   讨论

硝化菌具有转化水产养殖水体有害氮素的功能^[20-21]，基于硝化菌群的富集培养技术构建适用于水产养殖的生物脱氮系统具有良好的应用前景^[17]。笔者研究团队通过富集驯化从对虾集约化养殖水体中获得了具有高效去除有害氮素 (NH₄ ⁺-N和NO₂ ⁻-N) 能力的硝化菌群。但由于硝化菌群的富集驯化过程耗时较长，且随着转接次数增加，其硝化功能存在逐渐减弱甚至丧失的问题^[18-19]。为了缩短硝化菌群的起效时间、强化硝化效果，本研究从硝化菌群中筛选出了对NH₄ ⁺-N具有良好去除效果的菌株NB5，研究了其在不同培养条件下的生长及对NH₄ ⁺-N的去除效果。

水产养殖中，盐度、温度、pH和溶氧是重要水质理化指标。华南地区的养殖生产中适宜的水体盐度、pH、温度的覆盖区间分别为0~38.1，6.9~8.7，15~35 ℃^[22]。本研究表明，菌株NB5在盐度25~45、pH 6.0~9.0、15~35 ℃条件下生长良好，这与Chen等^[23]和Pan等^[24]分离到的Nitratireductor 属菌株的最适温度和pH基本一致，但不同菌株所适应的盐度范围有所不同。Chen等^[23]分离菌株N. soli在温度15~37 ℃ (最适为25~30 ℃)、pH为6.0~10.0 (最适为7.5)、盐度0~80 (最适为5) 下生长良好；Pan等^[24]从受石油污染的盐渍土中筛选到分离自福建九龙江河口的菌株N. aestuarii，该菌株可在温度25~45 ℃、pH 5.0~9.0、盐度5~20条件下生长。从对NH₄ ⁺-N的去除效果来看，菌株NB5在盐度45、35和25下对NH₄ ⁺-N的最大去除率分别为96.24%、88.93%和75.08%，pH 7.5和9.0分别为99.53%和99.37%，温度30、25、15和35 ℃分别为99.53%、97.22%、97.29%和71.26%，通气量为2和1 L·min⁻¹时分别为99.87%和99.82%。由此可见，与菌株NB5的生长适宜范围基本一致，在中高盐度 (25~45)、中性偏碱环境 (pH 7.5~9.0)、温度15~35 ℃、通气量1~2 L·min⁻¹的条件下菌株NB5对NH₄ ⁺-N的去除效果显著 (P<0.05)。与田雅洁等^[19]筛选的Rhodococcus rhodochrous XH2和胡晓娟等^[18]研究的Citreicella thiooxidans XH1相比，菌株NB5更适合中高盐度的池塘环境。

菌株NB5属于硝酸盐还原菌属 (Nitratireductor)，隶属于Proteobacteria门、Alphaproteobacteria纲、Rhizobiales目、Phyllobacteriaceae科^[23-24]。目前针对该属的研究主要集中于新菌种资源的挖掘上^[25-26]。Manickam等^[26]从农药污染的土壤中分离到一株新型N. lucknowense菌株；Chen等^[23]从苯酚污染的土壤中分离到Nitratireductor属的一株新种N. soli，该菌株与N. pacificus的序列相似度为98.5%，与其他Nitratireductor属菌株的序列相似度低于97%，该菌株能将硝酸盐还原为亚硝酸盐。但并非该属所有菌株都具有硝酸盐还原特性，Ou等^[27]从福建九龙江河口分离到新菌株N. aestuarii，经证实该菌株不能降解硝酸盐。本研究分离的菌株来自对虾养殖水体，其与N. aquimarinus CL-SC21的序列相似度达100%，鉴定其为N. aquimarinus，且具有硝酸盐还原的特性。研究表明，微生物可利用硝化作用将NH₄ ⁺-N转化为NO₂ ⁻-N、硝氮 (NO₃ ⁻-N) 等，也可将NH₄ ⁺-N同化为生长所需的含氮物质，还可将NH₄ ⁺-N转化为含氮气体^[28]。本研究中实验组中菌株NB5的对数生长期与NH₄ ⁺-N浓度大幅下降期相吻合，说明菌量的增加与对NH₄ ⁺-N的去除效果基本同步，而NO₂ ⁻-N的浓度没有明显变化，这可能是菌株将大部分NH₄ ⁺-N用于其自身生长繁殖^[18-19]。后期NH₄ ⁺-N的回升，可能是由于该菌株具有硝酸盐还原特性，在培养液中的大部分NH₄ ⁺-N被菌株同化吸收后，菌株再将NO₃ ⁻-N等其他氮源还原，代谢产生NH₄ ⁺-N。鉴于在未对菌株NB5进行菌种鉴定前，研究的关注点在于其对NH₄ ⁺-N和NO₂ ⁻-N等有害氮素的去除效果，而后续研究将综合分析其对不同氮素的作用效果与转化机制，及其与硝化菌群协同净化水质的作用效果。