Genetic diversity analysis of Sillago japonica based on mitochondrial DNA ND2 gene
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摘要: 以莱州、胶南、舟山、厦门、汕头和北海6个群体119尾少鳞鱚 (Sillago japonica)为研究对象，采用PCR扩增测序获得长度为450 bp的线粒体DNA NADH脱氢酶亚基2 (ND2)基因片段，共检测到77个变异位点，其中简约信息位点30个，单变异位点28个，无碱基缺失。119条序列定义了61个单倍型，平均单倍型多样性(Hd)和核苷酸多样性(π)分别为0.945 3±0.015 5和0.009 718±0.005 445。6个群体间的平均遗传距离为0.008 3，遗传分化指数FST均小于0.05，各群体间无显著遗传分化。AMOVA分析得出少鳞鱚的遗传变异主要来自于种群内个体间(99.96%)。中性检验的Tajima's D和Fu's Fs统计值均为负值且显著偏离中性，核苷酸不配对分布图呈现明显的单峰分布，表明少鳞鱚历史上经历了群体扩张事件，估算扩张时间大约在 (0.12~0.29)百万年前的第四纪更新世晚期。Abstract: A total of 119 individuals of Sillago japonica were collected from six sampling sites (Laizhou, Jiaonan, Zhoushan, Xiamen, Shantou and Beihai). The length of 450 bp NADH dehydrogenase subunit 2 (ND2) gene fragment was amplified and sequenced. No base insertion or deletion mutations occurred and 77 mutation sites were detected, including 30 parsimony informative sites and 28 singleton polymorphic sites. Sixty-one haplotypes were defined in 119 sequences. The average haplotype diversity (Hd) and nucleotide diversity (π) were 0.945 3±0.015 5 and 0.009 718±0.005 445, respectively. The average genetic distance among the six populations was 0.008 3, and the genetic differentiation index FST value was less than 0.05, indicating no significant genetic differentiation among the populations. Analysis of molecular variance (AMOVA) shows that genetic variation of S. japonica mainly resided among individuals within populations (99.96%). The neutral tests (Tajima's D and Fu's Fs) were both negative and deviated from the neutral significantly. Besides, the nucleotide mismatches distribution showed a unimodal distribution, indicating that S. japonica had experienced population expansion in history. The estimated expansion time was about 0.12−0.29 million years ago in late Pleistocene.
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少鳞鱚 (Sillago japonica)是鲈形目、鱚科、鱚属的一种小型海洋经济鱼类，主要分布在红海、印度洋、太平洋西部和南部，盛产于我国南海和东海的浅水区或河口区[1-2]。少鳞鱚肉质鲜美、营养丰富，深受人们喜爱，也是近岸渔业捕捞对象和游钓鱼种。20世纪末开始，日本学者围绕少鳞鱚渔业管理[3]、繁殖发育学[4-7]、组织胚胎学[8-9]和资源生物学[10-11]领域开展了大量基础性研究工作，近年来国内有关其形态学和遗传学方面的研究主要集中在外部形态特征描述[12]、耳石形态多元统计分析[13]、分子系统学研究[14-15]、线粒体控制区[16]和微卫星分子标记开发[17]。遗传多样性反映了生物对环境变化的适应能力，是物种多样性的基础和决定性因素，体现在表型、染色体、蛋白质和DNA多个层次水平的变异上，开展遗传多样性研究对于探讨物种的系统进化、遗传分化和资源保护都具有十分重要的意义[18]。
线粒体DNA (Mitochondrial DNA，mtDNA)具有分子量小、结构简单、排列紧凑，几乎不发生重组且遵循母系遗传的特性，目前已广泛应用在鱼类分子系统学、生物地理学和种群遗传学等诸多领域[19-20]。在mtDNA包含的13个蛋白质编码基因中，NADH脱氢酶亚基2 (NADH dehydrogenase subunit 2，ND2)基因由于进化速率相对较快，能较好地反映种内与群体间的遗传变异及系统分类地位，正逐渐应用于鱼类系统发育和种群划分研究中[21-25]。本研究采集了中国沿海6个地理种群的少鳞鱚样本，基于线粒体ND2基因序列开展其群体遗传多样性的研究，以期为少鳞鱚种质资源的保护提供理论依据。
1. 材料与方法
1.1 实验材料
本研究所用少鳞鱚样本分别于2017—2018年间采自莱州(LZ，19尾)、胶南(JN，20尾)、舟山(ZS，20尾)、厦门(XM，20尾)、汕头(ST，20尾)、北海(BH，20尾)，共计119尾样品(图1)。所有样品取背部新鲜肌肉组织存放于5 mL离心管，加入无水乙醇固定，4 ℃保存备用。
1.2 基因组DNA提取及PCR扩增
剪取适量已浸泡在无水乙醇中的背部肌肉组织，采用传统的酚-氯仿法[26]提取少鳞鱚基因组DNA，用无水乙醇沉淀和75%乙醇润洗后经自然风干的DNA溶解于100 μL灭菌水中，置于4 ℃保存备用。
参考少鳞鱚线粒体基因组全序列(GenBank登录号KR363149)，采用Primer primer 6.0软件设计扩增ND2基因的引物，分别为上游引物ND2-1F (5'-CACG AACGCCCCTATACTCA-3')和下游引物ND2-1R (5'-CCTGGTAGGTTGTTAGGGGA-3')。PCR总反应体系为25 μL，包括0.25 μL浓度为5 U·μL−1的Taq酶，各1 μL正反向引物(10 μmol·L−1)，2 μL的dNTPs (2.5 mmol·L−1)，2.5 μL的10×buffer缓冲液(含Mg2+)，1 μL的模板DNA (50~100 ng)，以及17.25 μL的灭菌双蒸水。PCR反应程序为95 ℃预变性5 min；95 ℃变性0.5 min，52 ℃退火0.5 min，72 ℃延伸1 min，总计循环35次；72 ℃延伸5 min。用1.5%琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物，凝胶成像系统拍照后，挑选条带亮度较高的PCR产物送至上海美吉生物有限公司进行测序。
1.3 数据分析
所获序列均由DNAstar[27]软件包进行编辑、校对和排序；采用DnaSP 6.0[28]和Arlequin[29]软件进行多态位点数目(number of polymorphic sites)、单倍型数目(number of haplotype)、核苷酸多样性(nucleotide diversity)和单倍型多样性(haplotype diversity)等计算；使用MEGA 7.0[30]软件基于Kimura 2-parameter model参数计算少鳞鱚群体间平均遗传距离、碱基组成和碱基转换/颠换，并采用邻接法(neighbor-joining，NJ)基于1 000次Bootstrap重抽样构建单倍型系统发育树；运用Network软件基于中间连接法(median-joining)绘制少鳞鱚单倍型网络图。使用Arlequin[29]软件统计少鳞鱚群体间的遗传分化水平，分子变异水平分析(analysis of molecular variance analysis，AMOVA)种群间遗传变异情况；使用Tajima's D和Fu's Fs中性检验以及核苷酸不配对分布(mismatch distribution)来估算种群的历史动态变化。使用公式τ=2ut[31]估算种群扩张时间，其中τ为扩张时间参数(Tau)，u为进化速率，u=μk，其中μ为每个碱基的变异速率，k为所分析序列的长度，t表示自扩张以来所经历的代数，扩张时间T=t×代时，μ参考Bermingham和Mccafferty[32]的研究，采用每百万年2%的突变速率。
2. 结果
2.1 序列变异及遗传多样性组成
使用DNAstar软件包中SeqMan程序进行序列比对，得到长度为450 bp的ND2基因片段。119尾少鳞鱚样本平均碱基组成为A=20.96%，T=30.38%，G=14.05%，C=34.6%，A+T含量(51.34%)略高于G+C (48.66%)，其中C含量最高，G含量最低，碱基组成偏向于嘧啶碱基。所获得序列中多态位点数目77个，占所获得序列长度的19.84%，没有发现碱基的插入和缺失。119条序列共检测到61个单倍型，从各群体所含单倍型分布来看，厦门群体检测到的单倍型数量最多，而莱州群体检测到的单倍型数量最少。遗传多样性参数显示，厦门群体的单倍型多样性最高(0.984 2±0.020 5)，北海群体单倍型多样性最低(0.910 5±0.053 8)；汕头群体核苷酸多样性最高(0.014 225±0.007 953)，莱州群体核苷酸多样性最低(0.005 788±0.003 723，表1)。
表 1 基于线粒体ND2基因的少鳞鱚6个种群遗传多样性Table 1. Genetic diversity in seven S. japonica populations based on mtDNA ND2 gene种群
population样本数
number of individuals单倍型数目
number of haplotypes多态位点数目
number of polymorphic sites单倍型多样性
Hd核苷酸多样性
π莱州 LZ 19 12 16 0.924 0±0.045 8 0.005 788±0.003 723 胶南 JN 20 13 17 0.957 9±0.025 5 0.007 800±0.004 739 舟山 ZS 20 13 34 0.947 4±0.032 3 0.013 019±0.007 349 厦门 XM 20 17 21 0.984 2±0.020 5 0.010 282±0.005 993 汕头 ST 20 14 48 0.915 8±0.054 6 0.014 225±0.007 953 北海 BH 20 13 19 0.910 5±0.053 8 0.007 678±0.004 677 总计 total 119 51 77 0.945 3±0.015 5 0.009 718±0.005 445 2.2 群体遗传结构和聚类分析
在MEGA软件中采用Kimura 2-parameter模型计算少鳞鱚6个群体间的遗传距离(表2)，种群间的遗传距离在0.006 85~0.010 02，其中厦门和汕头的遗传距离最大 (0.010 02)；莱州和北海的遗传距离最小 (0.006 85)，遗传分化尚未达到种级水平[33]。
表 2 少鳞鱚不同群体间平均遗传距离Table 2. Average genetic distances among different S. japonica populations种群
population北海
BH胶南
JN莱州
LZ汕头
ST厦门
XM胶南 JN 0.007 74 莱州 LZ 0.006 85 0.006 88 汕头 ST 0.008 64 0.008 51 0.007 66 厦门 XM 0.009 11 0.009 02 0.008 50 0.010 02 舟山 ZS 0.008 04 0.007 95 0.007 42 0.008 98 0.009 17 少鳞鱚不同群体间遗传多样性指数(FST)分析发现两两群体间的FST介于−0.014 16 ~0.044 38，除莱州和厦门、舟山群体之间差异显著外，其余群体间P均大于0.05 (表3)。采用分子方差分析(AMOVA)对6个少鳞鱚群体遗传变异来源和结构进行统计(表4)。结果表明，少鳞鱚遗传变异主要来自群体内个体间(99.96%)，其P检验也不显著(P=0.426 20±0.015 26)，表明少鳞鱚群体间存在广泛的基因交流，使得遗传分化程度较低、遗传差异不显著。
表 3 基于ND2序列单倍型频率的少鳞鱚群体FST (对角线下) 和相应P (对角线上)Table 3. F-Statistics (below diagonal) and FST P value (above diagonal) from haplotype frequencies of S. japonica种群
population北海
BH胶南
JN莱州
LZ汕头
ST厦门
XM舟山
ZSBH 0.625 00 0.201 17 0.898 44 0.535 16 0.564 45 JN −0.008 44 0.434 57 0.693 36 0.457 03 0.517 58 LZ 0.000 93 0.012 84 0.638 67 0.018 55 0.021 48 ST −0.005 06 −0.011 29 −0.002 92 0.355 47 0.654 30 XM −0.001 54 −0.004 82 0.044 38 0.003 94 0.826 17 ZS −0.002 41 −0.005 85 0.035 13 −0.013 66 −0.014 16 表 4 少鳞鱚群体线粒体ND2基因的AMOVA分析Table 4. AMOVA analysis of S. japonica populations based on mtDNA ND2 gene变异来源
source of variation自由度
df平方和
SS方差分量
variance components变异百分比
percentage of variation种群间 among populations 5 9.720 0.000 78Va 0.04 种群内 within populations 113 217.911 1.928 41Vb 99.96 总计 total 118 227.630 1.929 19 固定值 fixation index (FST) 0.000 41 注：Va. 组群间方差、Vb. 组群内群体间方差
Note: Va. variance between groups; Vb. variance between groups within the group从GenBank数据库下载近缘种多鳞鱚 (S. sihama，GenBank登录号KR363150)和中国鱚 (S. sinica，GenBank登录号KR363151) 作为外群，采用邻接法(neighbor-joining，NJ) 构建系统发育树 (图2)，聚类树中不同群体的个体相互交织，没有形成明显的分支，种群之间存在广泛的基因交流。
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图 2 基于ND2序列构建的少鳞鱚NJ树外群为中国鱚和多鳞鱚Figure 2. NJ phylogenetic tree of haplotypes based on ND2 sequences of S. japonicaS. sinica and S. sihama are selected as outgroups.2.3 群体历史动态及分化时间
在1 000次模拟抽样的情况下，用Arlequin软件对6个群体的少鳞鱚进行中性检验(表5和表6)和核苷酸不配对分析(图3)。当Tajima's D为负，且在统计学上达到显著水平，表明种群分化偏离中性突变理论模型，预示着群体在进化过程中不仅受到随机漂变因素影响，还有可能经历过大规模的群体扩张或受到过选择压力、瓶颈效应的影响[34]。Fu's Fs检验中，如果Fs大于零，表明种群趋于稳定，反之则表明种群趋于扩张[35]。结果表明，无论是从群体还是个体角度来看，Tajima's D和Fu's Fs均为负值且显著偏离中性(P<0.05)，表明少鳞鱚在历史进化过程中经历过群体扩张事件。此外，偏离方差(SSD)和Raggedness index (Rg)均较小，统计检验不显著，进一步表明群体扩增假说的成立[29]。核苷酸不配对分布图呈单峰且中性检验差异显著，表明少鳞鱚群体近期可能受到了瓶颈效应的打击。根据核苷酸不配对分布得到的Tau，少鳞鱚性成熟时间为1年，代时取1，计算得到少鳞鱚群体发生扩张的时间大约在 (12~29) 万年前的第四纪更新世(Pleistocene)晚期。
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图 3 基于少鳞鱚ND2基因单倍型的核苷酸不配对分布图Figure 3. Mismatch distribution based on ND2 gene haplotypes of S. japonica表 5 少鳞鱚群体中性检验及分化时间Table 5. Neutral test and differentiation time of fit for S. japonica中性检验
neutral test莱州
LZ胶南
JN舟山
ZS厦门
XM汕头
ST北海
BHTajima's D −1.918 06 −1.678 23 −0.721 48 −1.244 16 −2.098 64 −1.378 17 P 0.012 00 0.033 00 0.272 00 0.090 00 0.008 00 0.072 00 Fu's Fs −7.368 12 −6.792 29 −3.610 54 −12.466 49 −4.380 38 −6.687 65 P 0.000 00 0.001 00 0.050 00 0.000 00 0.030 00 0.003 00 Tau 2.2 3.7 3.5 4.3 5.3 3.4 T (Mya) 0.12 0.21 0.19 0.24 0.29 0.18 表 6 少鳞鱚种群中性检验Table 6. Neutral test of population for S. japonica数量
numberTajima's D Fu's Fs 偏离方差
SSDRg D P Fs P 119 −2.223 54 0 −25.916 43 0 0.001 89 0.020 24 3. 讨论
单倍型多样性(h)和核苷酸多样性(π)是衡量物种遗传多样性丰富度的重要指标，也是物种生存适应和发展进化的前提。物种的遗传多样性越高，对环境的适应能力越强，对变化也有更强的调整能力[36]。本研究表明中国沿海少鳞鱚群体遗传多样性较高(h=0.945 3，π=0.009 718)，与薛泰强等[14]和王林燕[17]分别采用控制区序列和微卫星分子标记对不同地理群体少鳞鱚遗传结构的分析结果相似，都呈现出相对丰富的遗传多样性水平。这可能与ND2基因本身具有较高的突变速率有关，另外种群的高单倍型多样性与种群的数量、所处环境的变化以及生活习性有密切联系[37]，少鳞鱚种群繁殖时间较长，单次后代产生数量大，能够弥补因捕食、捕捞等带来的种群缺失，使其存在较高的遗传多样性。
莱州群体核苷酸多样性指数最低，且与厦门、舟山群体间的遗传差异显著。由于莱州位于采样点最北端，受渤海沿岸流和黄海冷水团的共同作用，所处海域水温相对较低，而浙闽沿岸受亚热带海洋性季风气候影响，水温普遍偏高，推测温度变化可能对少鳞鱚遗传变异产生一定影响。鱼类作为变温性动物，温度变化对其分布和生长发育都具有重要影响。温度变化限制了鱼类成体的扩散并促进其适应局限的生存环境，使得彼此间交流的概率大幅降低，这种差异经长期积累并最终导致遗传分化。有文献资料表明，一些海洋鱼类的遗传多样性分布受到温度和纬度变化的影响，如王秀亮[38]对西北太平洋玉筋鱼(Ammodytes personatus) Cyt b基因研究发现，玉筋鱼单倍型频率在地理分布上与水温变化具有相关性，因而推测水域环境温度的改变以及洋流系统对玉筋鱼种群扩散及种群地理分布格局可能有着重要影响；Xu等[39]对中日沿海5个群体褐菖鲉(Sebastiscus marmoratus) ATP6和Cyt b基因所编码的氨基酸替换率进行比较时发现，温度可能是影响群体遗传结构和遗传分化的潜在环境因素。
遗传多样性指数FST是评价物种群体间遗传分化尺度的标准。Wright[40]的研究发现，若FST>0.25，表明群体间存在高度分化，0.15<FST<0.25，表示群体间存在中度分化，0.05<FST<0.15表示群体间存在低度分化，而FST<0.05则表明群体间没有分化。本研究发现少鳞鱚各群体间FST均小于0.05，结合平均遗传距离的大小来看，暗示群体间未发生明显的遗传分化，这与Gao等[16]的研究结果一致。推测少鳞鱚这类小型鱼类群体数量大、分布范围广，加之早期营浮游生活时间长、本身具备较强迁移能力，基因交流频繁造成遗传的同质化，使得种群间遗传分化水平普遍偏低，阻碍了种群的分化。此外，基于邻接法构建的系统关系树显示来自不同群体的个体彼此相互交错分布，没有呈现显著的谱系结构，也反映了少鳞鱚遗传分化水平较低这一结论。
Hewitt[41]通过研究证实，更新世的剧烈气候波动对地球上动植物遗传多样性和分布格局产生了重要影响。基于线粒体控制区序列估算出中日韩不同地理种群少鳞鱚发生群体扩张的时间大约在 (0.423~1.06)百万年前的晚更新世时期[16]，本研究对ND2基因的核苷酸不配对分析得出少鳞鱚群体分化时间大约在 (0.12~0.29)百万年前的第四纪冰川期-间冰期旋回[42]。尽管线粒体不同序列变异速率存在一定差异，但推算出扩张时间均处于第四纪更新世晚期，这一时期气候的急剧变化，全球性大幅度气温变冷，中高纬形成大面积冰盖，大气环流和洋流的变化直接影响动植物生长、演化和分布，导致大量生物种群的迁徙或者灭绝[43]，使得少鳞鱚等海洋鱼类的空间分布格局以及遗传结构发生了较大变化。
鱼类种群结构的时空分布和动态变化与其所处水域的环境因子有着密切关系，过度捕捞、水体污染、工程建设以及外来物种入侵等都会使鱼类资源和遗传多样性遭到破坏。基于线粒体ND2基因分析的结果显示，我国沿海少鳞鱚种群遗传多样性丰富程度较高，种质资源尚处于相对安全状态，具有一定的资源开发与利用潜力，但由于多遗传标记结合对于揭示种群进化历史和谱系地理格局的形成往往更全面、更准确。因此，在今后的渔业资源管理过程中，还需要综合采用多种分子生物学标记技术来监测少鳞鱚的遗传多样性水平，以实现其资源多样性的合理保护和可持续利用。
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图 2 基于ND2序列构建的少鳞鱚NJ树
外群为中国鱚和多鳞鱚
Figure 2. NJ phylogenetic tree of haplotypes based on ND2 sequences of S. japonica
S. sinica and S. sihama are selected as outgroups.
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图 3 基于少鳞鱚ND2基因单倍型的核苷酸不配对分布图
Figure 3. Mismatch distribution based on ND2 gene haplotypes of S. japonica
表 1 基于线粒体ND2基因的少鳞鱚6个种群遗传多样性
Table 1 Genetic diversity in seven S. japonica populations based on mtDNA ND2 gene
种群
population样本数
number of individuals单倍型数目
number of haplotypes多态位点数目
number of polymorphic sites单倍型多样性
Hd核苷酸多样性
π莱州 LZ 19 12 16 0.924 0±0.045 8 0.005 788±0.003 723 胶南 JN 20 13 17 0.957 9±0.025 5 0.007 800±0.004 739 舟山 ZS 20 13 34 0.947 4±0.032 3 0.013 019±0.007 349 厦门 XM 20 17 21 0.984 2±0.020 5 0.010 282±0.005 993 汕头 ST 20 14 48 0.915 8±0.054 6 0.014 225±0.007 953 北海 BH 20 13 19 0.910 5±0.053 8 0.007 678±0.004 677 总计 total 119 51 77 0.945 3±0.015 5 0.009 718±0.005 445 
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表 2 少鳞鱚不同群体间平均遗传距离
Table 2 Average genetic distances among different S. japonica populations
种群
population北海
BH胶南
JN莱州
LZ汕头
ST厦门
XM胶南 JN 0.007 74 莱州 LZ 0.006 85 0.006 88 汕头 ST 0.008 64 0.008 51 0.007 66 厦门 XM 0.009 11 0.009 02 0.008 50 0.010 02 舟山 ZS 0.008 04 0.007 95 0.007 42 0.008 98 0.009 17
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表 3 基于ND2序列单倍型频率的少鳞鱚群体FST (对角线下) 和相应P (对角线上)
Table 3 F-Statistics (below diagonal) and FST P value (above diagonal) from haplotype frequencies of S. japonica
种群
population北海
BH胶南
JN莱州
LZ汕头
ST厦门
XM舟山
ZSBH 0.625 00 0.201 17 0.898 44 0.535 16 0.564 45 JN −0.008 44 0.434 57 0.693 36 0.457 03 0.517 58 LZ 0.000 93 0.012 84 0.638 67 0.018 55 0.021 48 ST −0.005 06 −0.011 29 −0.002 92 0.355 47 0.654 30 XM −0.001 54 −0.004 82 0.044 38 0.003 94 0.826 17 ZS −0.002 41 −0.005 85 0.035 13 −0.013 66 −0.014 16
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表 4 少鳞鱚群体线粒体ND2基因的AMOVA分析
Table 4 AMOVA analysis of S. japonica populations based on mtDNA ND2 gene
变异来源
source of variation自由度
df平方和
SS方差分量
variance components变异百分比
percentage of variation种群间 among populations 5 9.720 0.000 78Va 0.04 种群内 within populations 113 217.911 1.928 41Vb 99.96 总计 total 118 227.630 1.929 19 固定值 fixation index (FST) 0.000 41 注：Va. 组群间方差、Vb. 组群内群体间方差
Note: Va. variance between groups; Vb. variance between groups within the group
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表 5 少鳞鱚群体中性检验及分化时间
Table 5 Neutral test and differentiation time of fit for S. japonica
中性检验
neutral test莱州
LZ胶南
JN舟山
ZS厦门
XM汕头
ST北海
BHTajima's D −1.918 06 −1.678 23 −0.721 48 −1.244 16 −2.098 64 −1.378 17 P 0.012 00 0.033 00 0.272 00 0.090 00 0.008 00 0.072 00 Fu's Fs −7.368 12 −6.792 29 −3.610 54 −12.466 49 −4.380 38 −6.687 65 P 0.000 00 0.001 00 0.050 00 0.000 00 0.030 00 0.003 00 Tau 2.2 3.7 3.5 4.3 5.3 3.4 T (Mya) 0.12 0.21 0.19 0.24 0.29 0.18
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表 6 少鳞鱚种群中性检验
Table 6 Neutral test of population for S. japonica
数量
numberTajima's D Fu's Fs 偏离方差
SSDRg D P Fs P 119 −2.223 54 0 −25.916 43 0 0.001 89 0.020 24
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