Vitamin B2 requirement of juvenile golden pompano (Trachinotus ovatus)
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摘要:
为研究卵形鲳鲹(Trachinotus ovatus)幼鱼对饲料中维生素B2的最适需要量，配制维生素B2水平为0 mg·kg–1、4.4 mg·kg–1、6.2 mg·kg–1、8.0 mg·kg–1、11.3 mg·kg–1、15.5 mg·kg–1的6种实验饲料，每种饲料设3个平行，每个平行放25尾初始均质量为(11.63±0.17) g的卵形鲳鲹幼鱼，每日2次饱食，投喂8周。结果显示，4.4 mg·kg–1组幼鱼的增重率、特定生长率均显著高于0 mg·kg–1组(P<0.05)，血清中谷草转氨酶、谷丙转氨酶活性显著低于0 mg·kg–1组(P<0.05)，但饲料中维生素B2水平对饲料系数、成活率、肝脏维生素B2含量、血清免疫指标、全鱼粗脂肪和粗蛋白、肌肉水分、粗脂肪和灰分均无显著影响(P>0.05)；6.2 mg·kg–1组肝脏D-氨基酸氧化酶(D-AAO)活性显著高于0 mg·kg–1组(P<0.05)。折线模型分析显示，卵形鲳鲹获得最佳生长和肝脏D-AAO活力达到最大时对饲料中维生素B2的需要量分别为4.23 mg·kg–1和6.24 mg·kg–1。
Abstract:To determine the optimal dietary vitamin B2 requirement of juvenile golden pompano (Trachinotus ovatus), six experimental diets were formulated which contained 0 mg·kg–1, 4.4 mg·kg–1, 6.2 mg·kg–1, 8.0 mg·kg–1, 11.3 mg·kg–1 and 15.5 mg·kg–1 of vitamin B2. Each diet was assigned to three parallels of 25 fish [initial mass of (11.63±0.17) g] which were fed twice daily for eight weeks. The results show that the weight gain rate and specific growth rate of the fish fed with diet of 4.4 mg·kg–1 vitamin B2 were significantly higher than those of 0 mg·kg–1 group (P<0.05), and the activities of aspartate aminotransferase and alanine aminotransferase in the serum were significantly lower than those in 0 mg·kg–1 group (P<0.05). No significant effect was found on the fish coefficient, survival rate, liver vitamin B2 content, serum immune parameters, crude protein and crude fat content in whole body, moisture, crude fat and crude ash in muscle (P>0.05); the liver D-AAO activity in 6.2 mg·kg–1 group was significantly higher in 0 mg·kg–1 group (P<0.05). Broken-line model analysis estimates that the dietary vitamin B2 requirement of juvenile golden pompano is 4.23 mg·kg–1 for optimal growth, and 6.24 mg·kg–1 for maximum liver D-AAO activity.
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Keywords:
- Trachinotus ovatus /
- vitamin B2 /
- requirement /
- growth /
- D-amino acid oxidase
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Pellino蛋白是一类重要的E3泛素连接酶，在脊椎动物和无脊椎动物中广泛存在且高度保守[1]。Pellino蛋白首次在黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)中发现，因其能与黑腹果蝇Pelle (IRAK的同源蛋白)结合的特性而得名[2]。在哺乳动物中发现了3种Pellino蛋白[3]。作为泛素连接酶，Pellino具有正向调节TAK1介导激活的NF-κB通路的功能[4]。Pellino1和Pellino2是TLR (Toll-like receptor)信号通路的上游调节介质，通过将白细胞介素-1受体相关激酶IRAK1多聚泛素化，激活下游的转录因子NF-κB和丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)通路，促炎细胞因子增加[5]。Pellino3不仅可以催化IRAK1的多聚泛素化，行使泛素连接酶的功能，还可以抑制NF-κB通路的激活，在免疫调节中发挥复杂的作用[6-7]。在甲壳动物中，Li等[8]研究发现凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)的Pellino基因在副溶血性弧菌(Vibrio parahemolyticus)、金黄色葡萄球菌 (Staphylococcus aureus) 、WSSV、LPS等刺激下表达均上调，可正向调节NF-κB通路的激活。Gayathri等[9]发现在罗氏沼虾(Macrobrachium rosenbergii) Pellino中存在潜在的阳离子抗菌肽MrDN，且具有一定的免疫活性。此外，作为泛素连接酶，Pellino蛋白对底物的特异性识别和选择过程是泛素化调控的关键，在泛素-蛋白酶体途径(ubiquitin-proteasome pathway，UPP)中发挥关键作用[10]。而UPP途径是真核细胞内蛋白质选择性降解的重要机制[11]，UPP广泛参与机体的免疫应答[12]、DNA损伤修复[13]、细胞凋亡[14]、信号转导[8]、转录调控[15]等多种生理过程。Pellino还可介导转化生长因子-β (TGF-β)途径与NF-κB的相互作用，调节多种免疫基因的表达，在先天性免疫中发挥重要作用[4]。
斑节对虾(Penaeus monodon)是世界三大养殖虾类品种之一，具有重要的经济价值[16]。近年来，对虾养殖产业受到细菌、病毒、真菌等多种病原体的威胁[17]，以氨氮浓度升高为标志的养殖水质恶化直接影响斑节对虾的免疫力，间接地增加其对病原菌的易感性。氨氮是养殖水体环境中主要的污染物，氨氮过高会造成对虾呼吸困难、摄食停止、免疫力下降、昏迷甚至死亡等现象，影响其存活和生长[18-19]。作为决定泛素化性质的关键酶，Pellino在抵御外界环境因子的刺激中发挥重要作用。然而在甲壳动物中，对Pellino抵御病原微生物和环境因子的研究很少，Pellino发挥作用的分子机理尚未明确。为了探究斑节对虾Pellino基因在氨氮胁迫和微生物刺激下的表达变化情况，本研究通过RACE技术克隆了斑节对虾Pellino基因，并对其序列特征进行了生物信息学分析，利用qPCR技术研究了其在不同浓度氨氮、哈维氏弧菌(V. harveyi)、鳗弧菌(V. anguillarum)、金黄色葡萄球菌刺激下的表达水平变化，为进一步探究Pellino家族基因的结构特征及其在斑节对虾抵御外界刺激过程中的调控机理提供研究基础。
1. 材料与方法
1.1 实验材料
实验所用的斑节对虾均来自中国水产科学研究院南海水产研究所深圳试验基地。实验用虾在循环水池中暂养3 d后使用，盐度30，水温(25±1) ℃。选取雌、雄各3尾健康的对虾进行解剖，分别取肝胰腺、鳃、肠、肌肉、胃、淋巴、眼柄神经、脑神经、胸神经和卵巢等组织，用作各组织cDNA模板的制备。选取体长7~8 cm、体质量6~7 g的幼虾用于急性氨氮胁迫实验；选取体长6~7 cm、体质量5~6 g的幼虾用于细菌感染实验。斑节对虾急性氨氮胁迫实验和微生物刺激实验在南海水产研究所深圳试验基地进行。RNALater购自Life公司、氯化铵(分析纯)购自普博生物有限公司；RNA提取试剂盒购自Magen公司；逆转录试剂盒(PrimeScript II 1st Strand cDNA Synthesis Kit)、荧光定量试剂盒(TB GREEN)购自TaKaRa公司。
1.2 总RNA的提取与cDNA的合成
按照Magen说明书提取斑节对虾不同组织的总RNA，用1.2%琼脂糖凝胶电泳检测RNA条带的完整度，用超微量分光光度计NanoDrop 2000检测RNA的浓度和纯度。用于做RACE模板的样品按照PrimeScript II 1st Strand cDNA Synthesis Kit (TaKaRa)试剂盒合成cDNA第一条链。各组织分别取1 μg总RNA用做荧光定量PCR的样品，按照PrimeScript RT reagent Kit With gDNA Eraser试剂盒进行反转录。所得cDNA经EF-1α引物(表1)检测后–80 ℃保存备用。
表 1 实验所用引物及其序列Table 1. Primers and sequences used in this study引物名称
primer name引物序列
primer sequenceORF-F 5'-ATGCCCGACCCTCCTATAATTGA-3' ORF-R 5'-TCAGTCGCAGTTGTCTTGAAAAATG-3' PmPellino 3'RACE1 5'-CAGGCATCTGGAGGGAAGTGTCGG-3' PmPellino 3'RACE2 5'-GCAGCCTGTAGTGTATCTGAACTGTGGC-3' PmPellino 5'RACE1 5'-TTCGCACCACATAATGCCGAGCAGG-3' PmPellino 5'RACE2 5'-TGGCGTCTGTGCAACACAAACTTGC-3' Pellino-qF 5'-AAGCGGTGATTGTGGAGTAT-3' Pellino-qR 5'-AGTGGTGCGAGTTGTTCT-3' EF-1α-F 5'-ATTGGAGGTATTGGAACAGTGCC-3' EF-1α-R 5'-TCGGTAAGAGCTTCGTGGTGC-3' 1.3 斑节对虾Pellino基因的克隆
根据本实验室构建的斑节对虾cDNA文库中的EST序列，使用Primer 5.0软件设计验证PmPellino基因的ORF引物和RACE引物(表1)，得到PmPellino基因的全长。
1.4 PmPellino基因序列分析
利用NCBI (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)的BLAST工具将斑节对虾Pellino与其他物种Pellino蛋白进行同源性比对，用SignalP 4.1 (http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP)预测Pellino家族基因的信号肽；用CD Search (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi)分析蛋白结构域；用Compute PI/Mw工具(http://web.expasy.org/compute_pi)预测蛋白的分子量和等电点；用Clustal X 1.83进行多重序列比对，并用Texmaker作图；使用MEGA 6.0的邻接法(neighbor-joining，NJ)构建系统进化树。
1.5 PmPellino基因在不同组织中的表达
选取健康的斑节对虾雌、雄各3尾进行解剖取样，提取不同组织的总RNA，以其反转录产物为模板，以PmPellino的基因全长为基础，设计荧光定量的特异性引物(表1)，以EF-1α为内参基因，以双蒸水代替模板作阴性对照，按照TB GREEN说明书进行荧光定量PCR检测，每个样品和内参均设置3个重复。采用相对ΔCT法(2–ΔΔCT法)分析PmPellino基因在斑节对虾各组织中的相对表达量。
1.6 急性氨氮胁迫
通过预实验得出斑节对虾96 h急性氨氮胁迫的半致死浓度(LC50)以及安全浓度(SC)。预实验设置7个氨氮浓度梯度，分别为0 mg·L–1、20 mg·L–1、40 mg·L–1、60 mg·L–1、80 mg·L–1、100 mg·L–1和120 mg·L–1。每个梯度选取混合家系大小均匀的30尾虾随机放置在7个黑桶中。每个黑桶中加入200 L过滤海水及2个气头。预实验期间不投喂饲料，每隔固定时间记录死亡情况至第96小时实验结束，捞取死虾，每天换全部海水。实验结束后通过直线内插法[20]计算LC50和SC。
正式实验分为2组，低浓度胁迫组和高浓度胁迫组，以第0小时的样品为对照组，使用过滤后的养殖海水。低浓度胁迫组的胁迫浓度为SC；高浓度胁迫组的胁迫浓度为96 h LC50。每组设3个重复，每个重复30尾虾。实验所用的黑桶和斑节对虾选取方法与预实验相同。实验通过添加氯化铵(NH4Cl)控制各实验组的氨氮浓度，每隔2 h记录死亡情况并捞取死虾，每24 h更换全部海水。于胁迫后第0、第3、第6、第12、第24、第48、第72和第96小时进行取样。取样时每组选取3尾活力较好的个体，取肝胰腺、鳃、肠等组织–80 ℃保存在RNALater (Ambion)中。
1.7 微生物刺激
为了研究不同微生物刺激对斑节对虾泛素连接酶Pellino基因的激活作用，实验选取健康的斑节对虾进行了微生物刺激。实验分为4组：1)注射金黄色葡萄球菌(革兰氏阳性菌)；2)注射哈维氏弧菌(革兰氏阴性菌)；3)注射鳗弧菌(革兰氏阴性菌)；4)注射PBS作为对照组。刺激后分别在第0、第3、第6、第9、第12、第24、第48和第72小时取对虾的肝胰腺、鳃等组织，样品于RNALater中−80 ℃保存，提取总RNA后合成cDNA模板进行qPCR实验。以EF-1α作为内参基因。
1.8 统计学分析
使用SPSS 23.0对定量结果进行单因素方差分析(One-Way ANOVA)，结果以“平均值±标准差(
${\overline{X}}\pm {\rm SD}$ )”表示。分析差异显著性(Turkey)，P<0.05为差异显著，P<0.01为差异极显著。若组间存在差异，则用Turkey方法进行多重比较分析。2. 结果
2.1 PmPellino的cDNA序列特征
将开放阅读框(ORF)序列与3'RACE和5'RACE的测序结果进行拼接，得到PmPellino基因的cDNA全长。PmPellino基因cDNA全长为1 961 bp (GenBank accession No. MH746213)，包括1 299 bp的ORF，89 bp的5'非编码区(UTR)，573 bp的3'UTR (图1)。预测PmPellino基因编码432个氨基酸，分子量为47.303 7 kD，理论等电点为7.02。PmPellino无信号肽，有FHA (forkhead-associated)结构域(118~188 aa)和RING结构域(299~350 aa)。
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图 1 PmPellino cDNA序列及其氨基酸序列起始密码子(ATG)与终止密码子(TGA)为黑色背景，位于N端的FHA结构域用黑色方框框出，位于C端的RING结构域用黑色下划线标识，polyA尾用灰色背景斜体表示Figure 1. Nucleotide and deduced amino acid sequence of PmPellinoThe initiation code (ATG) and termination code (TAG) are in black background. The FHA domain at N-terminus is framed in box; the RING domain at C-terminus is underlined; and the polyA tail is indicated in italics in gray background.2.2 同源性和系统进化树分析
多重序列比对(图2)结果显示PmPellino与凡纳滨对虾、拟穴青蟹(Scylla paramamosain，SAY41342.1)、黑腹果蝇(NP_524466.1)、小鼠(Bos taurus，XP_002690998.1)和人Pellino2 (Homo sapiens，NP_067078.1)的Pellino蛋白的序列相似度分别为100%、96%、72%、60%和60%。
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图 2 PmPellino和其他物种Pellino氨基酸序列多重比对Figure 2. Multiple alignment of deduced amino acid sequences of PmPellino from P. monodon and other species根据PmPellino氨基酸序列构建系统进化树(图3)，结果显示Pellino聚类为无脊椎动物和脊椎动物两大类。无脊椎动物Pellino蛋白聚类为2个亚群，其中PmPellino与甲壳动物凡纳滨对虾独立聚为一支，再与拟穴青蟹聚为一支，最后与肢口纲的美洲鲎(Limulus polyphemus，XP_013777211.1)、蛛形纲的温室希蛛(Parasteatoda tepidariorum，XP_015916048.1)和络新妇蛛(Nephila clavipes，PRD24637.1)共同聚为一个亚群，它们具有较高的同源性，在进化关系上较为接近；昆虫纲的黑腹果蝇、埃及伊蚊(Aedes aegypti，XP_021709421.1)、棉铃虫(Helicoverpa armigera，XP_021196073.1)、丛林斜眼褐蝶(Bicyclus anynana，XP_023954918.1)、湿木白蚁(Zootermopsis nevadensis，XP_021932730.1)、欧洲熊蜂(Bombus terrestris，XP_012168580.1)、美洲东部熊蜂(Bombus impatiens，XP_024223585.1)、白蜡窄吉丁(Agrilus planipennis，XP_018328487.1)聚为另一个亚群。脊椎动物小鼠与人的Pellino1 (NP_065702.2)、Pellino2 (NP_067078.1)和4种Pellino3 (NP_659502.2，NP_001091980.1，NP_001230064.1，NP_001230065.1)聚为一支。
2.3 PmPellino在不同组织的表达分析
以EF-1α为内参基因，通过qPCR检测PmPellino在各组织中的表达状况 (图4)。PmPellino在所有被检测的组织中均有表达，在斑节对虾的鳃和肠中表达量最高，在脑神经、精巢、心脏、眼柄神经、淋巴、胸神经中表达量中等，在肌肉、表皮、胃、肝胰腺、精荚等组织中表达量较低。
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图 4 PmPellino在各组织中的表达图中值为平均值±标准差(n=3)；不同小写字母表示组间有显著性差异 (P<0.05)Figure 4. Relative expression of PmPellino in different tissuesValues are $\overline X \pm {\rm SD} $ (n=3); different lowcase letters indicate signigicant difference between groups (P<0.05).2.4 不同浓度氨氮胁迫下PmPellino的表达变化
不同浓度氨氮胁迫后，PmPellino在肝胰腺组织中的表达变化见图5-a。结果表明，该基因在高浓度组的表达量先上升，在第24小时达到最大值(为对照组的13.08倍)后下降。第6、第12、第24、第48和第72小时的表达量极显著高于对照组(P<0.01)，第96小时的表达量仍显著高于对照组(P<0.05)。低浓度组在第3小时表达量迅速达到最大值(为对照组的11.61倍)。在第3~第12小时呈下降趋势，在第12小时到达最低点且与对照组无显著差异。在第12~第48小时呈上升趋势，在第48小时达到第二个峰值后下降，第96小时与对照组无显著差异。在第3、第6、第24、第48和第72小时变化极显著(P<0.01)。
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图 5 急性氨氮胁迫后PmPellino在肝胰腺 (a)、鳃 (b) 中的相对表达量*. 与第0小时对照组差异显著(P<0.05)；**. 与第0小时对照组差异极显著(P<0.01)；图6同此Figure 5. Relative expression level of PmPellino in hepatopancreas (a) and gill (b) after acute ammonia nitrogen stress*. significant difference with control group at 0th hour (P<0.05); **. very significant difference with control group at 0th hour (P<0.01); the same case in Fig.6.在鳃组织中，PmPellino的表达变化(图5-b)与在肝胰腺中有所不同。氨氮胁迫后，高浓度组与低浓度组mRNA水平均呈下降趋势，在第3小时与对照组有极显著差异(P<0.01)。随后高浓度组呈上升趋势，在第12小时达到最大值且与对照组无显著差异，第12~第96小时呈下降趋势。第48、第72、第96小时与对照组有极显著差异(P<0.01)。低浓度组胁迫后PmPellino的表达整体低于对照组(P<0.01)。第6小时降到最小值(为对照组的0.15倍)，在第6~第72小时呈上升趋势，在第72小时达最大值(为对照组的0.54倍)后下降。
2.5 微生物刺激下PmPellino基因的表达变化
微生物刺激的结果见图6。哈维氏弧菌刺激后，PmPellino基因在鳃组织中的表达量均高于对照组，在第3小时迅速上升到最大值，为对照组的16.10倍(P<0.01)，在第48小时显著上调，为对照组的15.78倍(P<0.05)。而在肝胰腺组织中，哈维氏弧菌刺激后PmPellino在第3、第6、第9和第72小时的表达被显著抑制(P<0.01)，其最小值为对照组的0.32倍。
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图 6 不同微生物刺激后PmPellino在肝胰腺 (a)、鳃 (b) 中的相对表达量Figure 6. Relative expression level of PmPellino in hepatopancreas (a) and gill (b) after being challenged with different kinds of microorganism鳗弧菌刺激后，PmPellino在鳃组织中的表达量与对照组无显著差异；而在肝胰腺中的表达量均低于对照组，在第3、第9、第72小时极显著下调(P<0.01)，其最小值为对照组的0.20倍，抑制效果明显。
金黄色葡萄球菌刺激后，PmPellino在鳃中的表达量在第3和第6小时显著上调(P<0.05)，在第12、第48和第72小时的表达量极显著上调(P<0.01)，其表达最高值为对照组的16.20倍；在肝胰腺中PmPellino的表达量在第6、第24和第96小时显著上调(P<0.01)，在第6~第9小时急剧下降至最小值(为对照组的0.40倍)，在第9~第48小时显著上调并在第48小时达最大值(为对照组的4.67倍)，在第48~第72小时显著下调(P<0.01)。
3. 讨论
Pellino蛋白羧基端具有RING结构域，在泛素化过程中发挥E3泛素连接酶的作用并能促进IRAK1的多聚泛素化，其氨基端FHA结构域可以促进磷酸化IRAK1/Pelle的相互作用[21-23]。本研究对PmPellino的生物信息学分析表明，斑节对虾的Pellino基因具有RING结构域和FHA结构域，这表明PmPellino属于泛素连接酶家族，对对虾NF-κB通路可能具有调节功能，并且在DNA损伤修复以及错误蛋白的水解过程中可能发挥一定的作用。斑节对虾与凡纳滨对虾的氨基酸序列非常相似，在进化关系上最为接近。研究发现，凡纳滨对虾Pellino可以正向调节转录因子NF-κB通路，这些转录因子可以激活相应的免疫应答相关基因[8]。因此，斑节对虾Pellino基因可能具有积极的免疫调控作用。
Pellino基因在斑节对虾各组织中均有表达，在鳃中的表达量最高，在肝胰腺中的表达量相对较低。鳃是大多数水生动物的氨氮排泄器官[24]，也是对虾免疫应激的第一道防线，Pellino在鳃组织中的高表达，有助于对虾抵御外界环境刺激。Schauvliege等[1]的研究表明，Pellino在不同组织中的表达不同；在相同组织中，不同信号刺激下Pellino的表达水平也不同。PmPellino在不同组织中同样具有表达差异，提示其功能具有组织特异性。
在急性氨氮胁迫下，甲壳动物可通过肝胰腺和鳃等组织的解毒代谢途径降低机体的氨氮浓度，减轻高浓度氨氮对组织器官的损伤[25]。肝胰腺是氨氮代谢的主要场所，是对虾非特异性免疫的重要器官，在应激调控中发挥重要作用[26-27]。定量结果表明，在不同浓度的氨氮胁迫下，Pellino基因在肝胰腺组织中的表达量显著上调，这与陈劲松等[28]研究斑节对虾氨氮代谢通路上的关键基因谷氨酰胺合成酶的表达模式相似，表明Pellino基因可能参与了斑节对虾氨氮解毒反应。而在鳃组织中，Pellino基因的表达被显著抑制，这与谷胺酰胺酶的表达趋势一致，推测在氨氮胁迫下，斑节对虾鳃组织遭到了损坏。曽媛媛等[29]发现氨氮胁迫会使拟穴青蟹的鳃组织受到氧化损伤，鳃上皮细胞受损随氨氮浓度的升高而加重。推测鳃组织损伤可能是Pellino基因表达被抑制的主要原因。Pellino基因在肝胰腺和鳃中的组织特异性可能也导致了其表达情况的不同。
为了探究PmPellino及其介导的信号通路是否参与了对虾免疫应答，选取2种革兰氏阴性菌和1种革兰氏阳性菌进行微生物刺激实验。定量结果显示，在哈维氏弧菌、鳗弧菌和金黄色葡萄球菌的刺激下，PmPellino基因的表达变化情况不尽相同。以往的研究表明，对不同病原体入侵，无脊椎动物的TLR/NF-κB通路具有多种不同的信号转导调节模式[30]。在不同微生物刺激下，Pellino基因可能参与了不同途径的信号调节。在PmPellino高表达的鳃组织中，哈维氏弧菌和金黄色葡萄球菌的刺激能显著提高Pellino基因的表达量，这与凡纳滨对虾的菌刺激实验结果相一致。Li等[8]发现凡纳滨对虾在哈维氏弧菌、金黄色葡萄球菌等刺激作用下，LvPellino在血细胞中的表达量均显著上调，表明Pellino基因参与了微生物刺激下的免疫应答，可能具有正向调节NF-κB通路的功能。然而，鳗弧菌的刺激效果不显著。在PmPellino低表达的肝胰腺组织中，革兰氏阴性菌的刺激显著抑制了Pellino的表达，而革兰氏阳性菌的刺激显著激活了Pellino的表达。革兰氏阳性菌的主要成分是肽聚糖(PGN)，在革兰氏阳性菌或真菌感染下，果蝇Toll通路被激活后可调控转录因子来抵御病原体入侵[31]。而Pellino介导IRAK1的多聚泛素化在TLR (Toll-like receptors)通路上发挥关键作用[32]，此外，Pellino还可与TLR通路上的TRAF6及TAK1等组分相互作用[33]。推测革兰氏阳性菌感染下，Pellino参与了TLR通路的调节。革兰氏阴性菌主要被IMD途径识别[34]，鳗弧菌及哈维氏弧菌可以激活IMD信号通路，从而抑制Toll通路的信号转导，推测这是Pellino表达被抑制的主要原因。本研究中，革兰氏阳性菌金黄色葡萄球菌对PmPellino在肝胰腺、鳃组织中的表达均有显著激活作用，不同的革兰氏阴性菌对Pellino的作用不同，同一种革兰氏阴性菌在斑节对虾不同组织中的作用也不同，表明PmPellino蛋白在抵御病原体入侵的免疫应答中发挥着复杂的作用。
综上，本研究克隆获得了PmPellino基因的全长，对PmPellino基因的结构进行了生物信息学分析，探讨了斑节对虾在急性氨氮胁迫、不同微生物刺激下PmPellino的表达变化情况。Pellino积极参与了氨氮胁迫应激和微生物刺激的免疫应答，并在不同胁迫下的表达情况不尽相同，具有功能的组织特异性。研究结果为进一步探讨泛素连接酶Pellino蛋白家族在甲壳动物抵御环境刺激中的免疫调节机制提供了基础。
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图 1 卵形鲳鲹幼鱼特定生长率与饲料维生素B2含量的关系
Figure 1. Relation between specific growth rate and dietary vitamin B2 content for juvenile T. ovatus
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图 2 维生素B2 含量对卵形鲳鲹幼鱼肝脏D-氨基酸氧化酶活性的关系
Figure 2. Relation of dietary vitamin B2 content and liver D-amino acid oxidase activity of juvenile T. ovatus
表 1 基础饲料组成及营养水平 (干质量)
Table 1 Composition and nutrient levels of basal diet (dry mass)
% 项目 item 含量 content 项目 item 含量 content 原料 ingredient 矿物质预混料2 mineral premix 1 酪蛋白 (不含维生素) vitamin-free casein 20 磷酸二氢钙 monocalcium phosphate 1 大豆浓缩蛋白 soy protein concentrate 18 甜菜碱 betaine 1 鱼粉 fish meal 16 微晶纤维素 microystalline cellulose 3.5 面粉 wheat flour 23 合计 total 100 鱼油 fish oil 8 营养成分 nutrient component 大豆卵磷脂 soy lecithin 4 水分 moisture 7.66 氯化胆碱 choline chloride (50%) 2 粗蛋白 crude protein 45.23 乙氧基喹啉 ethoxyquin 0.5 粗脂肪 crude lipid 14.20 维生素预混料1 vitamin premix 2 灰分 ash 6.63 注：1. 维生素预混料 (mg·kg–1)：维生素A 32 mg，维生素D 5 mg，维生素E 120 mg，维生素K 10 mg，维生素C 2 000 mg，硫胺素 25 mg，D-泛酸钙 60 mg，烟酸 200 mg，吡哆醇 20 mg，叶酸 1.2 mg，生物素 32 mg，维生素B12 0.1 mg，肌醇 800 mg，乙氧喹150 mg，微晶纤维素 14 565 mg；2. 矿物质预混料(mg·kg–1 diet)：硫酸亚铁 160 mg，五水合硫酸铜 20 mg，硫酸锌100 mg，硫酸锰 120 mg，硫酸镁 2.4 g，磷酸二氢钙 6.0 g，氯化钠 200 mg，氯化钴(1%) 100 mg，氟化钠 4 mg，碘化钾 1.6 mg，沸石粉30.9 g[19] Note: 1. pyridoxine-free vitamin mixture (mg·kg–1 diet): vitamin A (500 000 IU) 32 mg, vitamin D (500 000 IU) 5 mg, vitamin E (50%) 120 mg, vitamin K 10 mg, vitamin C 2 000 mg, vitamin B1 25 mg, calcium pantothenate 60 mg, nicotinic acid 200 mg, vitamin B6 20 mg, folic acid 1.2 mg, biotin 32 mg, vitamin B12 0.1 mg, inositol 800 mg, ethoxyquin 150 mg, avicel 14 565 mg. 2. mineral premix (mg·kg–1 diet): FeSO4∙H2O 160 mg, CuSO4∙5H2O 20 mg, ZnSO4∙H2O 100 mg, MnSO4∙H2O 120 mg, MgSO4∙7H2O 2.4 g, Ca(H2PO4)2∙H2O 6.0 g, NaCl 200 mg, CoCl2∙6H2O (1%) 100 mg, NaF 4 mg, KI 1.6 mg, zelote power 30.9 g[19] 
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表 2 饲料中维生素B2 水平对卵形鲳鲹幼鱼生长性能的影响
Table 2 Effects of dietary vitamin B2 content on growth performance of juvenile T. ovatus
项目
itemw(维生素B2)/mg·kg–1 dietary vitamin B2 content 0 4.4 6.2 8.0 11.3 15.5 初均体质量/g initial body mass 11.50±0.14 11.75±0.11 11.72±0.15 11.54±0.04 11.70±0.22 11.56±0.22 末均体质量/g final body mass 41.63±5.60a 51.95±2.48b 51.05±2.37b 50.02±4.05b 50.44±1.62b 50.34±3.84b 采食量/g feed intake 1 156.34±77.96a 1 356.93±77.58b 1 175.58±60.52a 1 477.88±1144b 1 477.88±101.58b 1 427.92±83.93b 增重率/% WGR 262.37±52.35a 342.14±25.80b 335.72±16.67b 333.71±42.89b 336.14±21.44b 335.26±22.26b 特定生长率/% SGR 2.29±0.27a 2.65±0.10b 2.62±0.12b 2.62±0.03b 2.62±0.11b 2.62±0.14b 饲料系数 FCR 1.93±0.34 1.68±0.19 1.62±0.13 1.65±0.07 1.67±0.05 1.60±0.10 脏体比/% VSI 5.61±0.13 5.51±0.30 5.79±0.10 5.72±0.28 5.43±0.22 5.83±0.20 肝体比/% HSI 0.88±0.05a 0.84±0.04a 1.00±0.04b 0.94±0.09ab 0.91±0.05ab 0.87±0.01a 肥满度/g·cm3 CF 3.18±0.04 3.30±0.10 3.32±0.08 3.27±0.07 3.29±0.12 3.22±0.02 成活率/% SR 0.85±0.06 0.86±0.07 0.79±0.09 0.81±0.06 0.84±0.06 0.93±0.09 注：同一行数据上标字母不同表示差异显著(P<0.05)，后表同此 Note: Values with different superscript letters within the same row indicate significant difference (P<0.05). The same case in the following tables.
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表 3 饲料中维生素B2 水平对卵形鲳鲹幼鱼全鱼和肌肉营养成分的影响 (干质量)
Table 3 Effects of dietary vitamin B2 content on nutritive components of whole fish and muscle of juvenile T. ovatus (dry mass)
% 成分
componentw(维生素B2)/mg·kg–1 dietary vitamin B2 content 0 4.4 6.2 8.0 11.3 15.5 全鱼 whole body 水分 moisture 64.22±0.31b 63.50±0.43a 63.07±0.50a 63.32±0.47a 63.71±0.46ab 66.24±0.33b 粗蛋白质 crude protein 58.92±1.78 60.34±0.92 58.42±1.21 59.94±2.23 57.65±2.16 59.48±3.11 粗脂肪 crude fat 24.35±1.47 25.82±0.94 27.04±1.84 24.45±3.31 27.40±3.44 27.36±2.83 灰分 ash 15.33±0.49b 14.09±0.40a 14.68±0.50ab 14.62±0.52ab 14.99±0.38b 15.20±0.30b 肌肉 muscle 水分 moisture 72.25±2.13 72.84±2.97 72.34±2.11 71.94±1.84 73.28±1.70 72.74±1.50 粗蛋白质 crude protein 84.47±0.33a 85.04±0.82ab 82.89±0.69b 83.94±1.20ab 82.96±2.16ab 84.80±0.74ab 粗脂肪 crude fat 4.34±1.03 4.77±0.58 6.02±0.42 4.77±0.89 5.63±1.13 4.77±0.08 灰分 ash 7.15±0.30 6.77±0.44 6.76±0.63 6.90±0.13 7.07±0.17 7.02±0.04
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表 4 饲料中维生素B2 水平对卵形鲳鲹幼鱼血清生化指标的影响
Table 4 Effects of dietary vitamin B2 content on plasma biochemical indices of juvenile T. ovatus
指标
indexw(维生素B2)/mg·kg–1 dietary vitamin B2 content 0 4.4 6.2 8.0 11.3 15.5 葡萄糖/mmol·L–1 GLU 9.63±0.25c 9.18±0.17bc 9.28±0.60bc 8.79±0.05ab 8.41±0.35a 8.27±0.18a 总胆固醇/mmol·L–1 TCHO 3.40±0.26 3.79±0.27 3.61±0.17 3.76±0.13 3.76±0.13 3.68±0.54 甘油三酯/mmol·L–1 TG 0.92±0.10b 0.87±0.03ab 0.91±0.06b 0.90±0.06ab 0.84±0.14ab 0.74±0.10a 谷草转氨酶/U·L–1 AST 37.67±5.77b 27.00±4.36a 23.00±1.00a 29.00±1.00a 27.67±1.53a 23.00±1.73a 谷丙转氨酶/U·L–1 ALT 4.96±0.28b 3.33±0.58a 3.33±0.58a 3.33±0.58a 2.67±0.29a 2.78±0.69a 总蛋白/g·L–1 TP 20.56±0.48a 23.97±0.85c 21.47±0.45ab 21.80±1.93ab 22.67±1.27bc 21.30±0.10ab
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表 5 饲料中维生素B2 水平对卵形鲳鲹幼鱼血清免疫指标的影响
Table 5 Effects of dietary vitamin B2 content on plasma immune parameters of juvenile T. ovatus
指标
indexw(维生素B2)/mg·kg–1 dietary vitamin B2 content 0 4.4 6.2 8.0 11.3 15.5 溶菌酶/U·mL–1 LZM 197.61±2.77 203.64±1.81 200.62±4.46 200.62±1.88 197.31±4.70 199.77±3.58 补体3/g·L–1 C3 2.94±0.05 2.98±0.08 3.08±0.10 3.03±0.08 2.95±0.07 3.04±0.05 补体4/g·L–1 C4 0.8±0.01 0.9±0.01 0.9±0.02 0.9±0.34 0.9±0.02 0.9±0.02
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表 6 饲料中维生素B2 水平对卵形鲳鲹幼鱼肝脏维生素B2含量和肝脏D-氨基酸氧化酶活性的影响
Table 6 Effects of dietary vitamin B2 content on liver vitamin B2 content and D-amino acid oxidase activity of juvenile T. ovatus
指标
indexw(维生素B2)/mg·kg–1 dietary vitamin B2 content 0 4.4 6.2 8.0 11.3 15.5 肝脏维生素B2含量/mg·kg–1 liver vitamin B2 content 4.50±0.18 4.59±0.13 4.96±0.41 4.74±0.47 4.72±0.23 4.74±0.26 肝脏D-AAO活性/IU·L–1 liver D-amino acid oxidase activity 258.79±55.87a 305.01±8.12ab 337.70±1.74b 329.15±1.36ab 283.17±65.19ab 284.24±27.53ab
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