凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)又称南美白对虾，主要分布于加利福尼亚湾至秘鲁北部的太平洋沿岸水域，是当今世界上产量最高的养殖对虾品种之一^[1]。良好的养殖水环境是凡纳滨对虾养殖成功的保障，氨氮(NH₃-N)和溶解氧(DO)是对虾养殖水体环境中的重要理化因子，特别是工厂化高密度养殖模式下最值得关注的2个水质理化因子^[2]。中国就凡纳滨对虾仔虾、幼虾、成虾阶段对氨氮的耐受性已有报道^[3-5]；对低溶氧胁迫的研究主要集中在行为、生理、免疫等方面^[6-7]。有关凡纳滨对虾高氨氮、低溶氧抗逆性状遗传育种的研究少见报道。氨氮、溶解氧等胁迫因子对养殖凡纳滨对虾的遗传基础、抗逆性以及病原微生物的致病力均有较显著的影响。深入了解凡纳滨对虾高氨氮、低溶氧抗逆性的遗传性能，可为凡纳滨对虾抗逆遗传改良奠定基础。

配合力是筛选和评估人工选育亲本的重要遗传参数，最早应用于玉米杂交育种^[9]研究中。配合力是指亲本(纯系、自交系或品种)材料在由其所产生的杂种后代的产量或其他性状表现中所起作用相对大小的度量^[8]，包括一般配合力和特殊配合力。一般配合力是由于基因加性效应所致，而特殊配合力主要是双亲杂交后通过互作表现出的非加性效应，即基因的显性、超显性和上位效应^[10]。在水产动物育种研究中，吴杨平等^[11]研究了红壳色文蛤(Meretrix meretrix)3个地理群体在早期发育阶段的壳长性状配合力，发现了红壳色文蛤最具优势的杂交组合。MALLET等^[12]分析了野生牡蛎3个群体的生长和存活性状配合力，结果显示牡蛎早期发育阶段的生长和成活率受母体效应的影响较大。季士志等^[13]通过双列杂交设计，研究了2个大菱鲆(Scophthalmus maximus)养殖群体的杂交效果，结果表明不同养殖群体间的杂交有可能是大菱鲆遗传改良的有效途径。林壮柄等^[14]报道了杂色鲍(Haliotis diversicolor)双列杂交的杂种优势。国内外均有关于凡纳滨对虾不同群体配合力分析及杂种优势利用的研究报道^[15-16]，但关于群体间抗逆性状配合力分析的研究尚未见报道。该研究利用3个地理群体的凡纳滨对虾，采用Griffing双列杂交育种法Ⅰ，建立9个自繁和杂交组合F₁代，比较其对高氨氮、低溶解氧的耐受性，分析交配组合杂种优势，进一步采用线性模型均数加权二乘分析法估算凡纳滨对虾各理化因子耐受性状的配合力，评估亲本和子代对各理化因子的耐受性能，为进一步家系选育提供候选材料和抗逆凡纳滨对虾新品系选育提供理论依据。

1.   材料与方法

1.1   实验材料

3个引进的凡纳滨对虾群体于2013年4月~6月分批相继运抵海威水产养殖有限公司东海对虾良种场(广东海洋大学产学研基地)。3个凡纳滨对虾引进群体包括美国迈阿密SIS群体、美国夏威夷SIS群体和泰国正大群体，分别命名为UM、UH和TZ群体。亲虾暂养稳定后，雌虾进行单侧眼柄切除，投喂冰冻鱿鱼、牡蛎和鲜活沙蚕进行促熟。选取性腺成熟的亲虾，通过完全双列杂交设计，成功建立了9个自繁和杂交群体，具体交配信息见表 1。每个交配组合分别有9~21尾雌虾成功孵出幼体，合计128个全同胞家系。采用标准化的方式对每个自交和杂交群体进行幼体培育直至仔虾。尽量保持各阶段的培育条件一致，以减少环境条件(主要包括各个阶段水的盐度、温度、幼体密度、饵料及充气等条件)差异对生长发育的影响。仔虾体长生长到3~4 cm时对9个群体进行凡纳滨对虾高氨氮和低溶氧的耐受性比较。

表  1  凡纳滨对虾3个引进群体的完全双列杂交

Table  1.  Complete diallel cross of three introduced populations of L.vannamei

引进群体(♀) introduced population	引进群体(♂) introduced population
	UM	UH	TZ
美国迈阿密SIS群体UM	UM×UM	UM×UH	UM×TZ
美国夏威夷SIS群体UH	UH×UM	UH×UH	UH×TZ
泰国正大群体TZ	TZ×UM	TZ×UH	TZ×TZ

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1.2   耐受性试验设计

根据相关文献[17-18]设定氨氮和溶解氧梯度，进行胁迫因子的48 h耐受性预试验，得出48 h半致死温度、盐度值，即正式试验中高氨氮和低溶氧胁迫浓度值，分别为98 mg · L^-1和0.7~0.9 mg ·L^-1。采用单因素试验设计，每个群体挑选大小相近的凡纳滨对虾个体30尾，置于14 cm×12 cm×12 cm的小网箱中，每组的9个网箱放在同一个1.6 m×1.2 m×0.4 m的泡沫箱中。实验设3个平行组和1个对照组(对照组48 h内均全部成活)，共计72个小网箱和8个泡沫箱。每隔12 h观察凡纳滨对虾的活力，当对虾停止任何运动，用玻棒触及无反应，则视为死亡^[12]，及时取出死亡个体。胁迫因子的调控在泡沫箱中完成，每12 h换水一次，清理粪便、蜕皮及死亡个体，实验持续48 h，实验结束时统计成活率。

1.3   理化因子的控制

高氨氮和低溶解氧等水环境全部通过人工48 h不间断调节控制，主要调控方法：1)氨氮控制系统。实验溶液以NH4ClA.R.溶于过滤海水中制得，使用5B-2N轻巧便携型氨氮测定仪随时监控实验组水体中氨氮含量；2)低溶解氧控制系统。通过向泡沫箱水体中充入不同的空气和氮气的比例来调节。供气系统由氮气罐、氧气罐、气阀、输气管和气石等组成。溶解氧用Mi605便携式溶解氧测试仪直接快速测量，随时监控试验组水体溶解氧。

1.4   数据处理

利用Excel 2007软件对成活率数据进行初步整理，用SPSS 19.0软件对成活率数据进行平方根反正弦转换后作单因素方差分析，多重比较法分析不同群体间的差异显著性。杂种优势(Heterosis)参照CRUZ等^[19]的方法计算：

其中MP是中亲优势；F₁为杂交组均值；P₀是相应双亲均值；BP为超亲优势；P_B是杂交组较好的亲本均值。

配合力分析统计模型^[20]为：

式中Y_ijk代表第i个父本群体与第j个母本群体的第k个杂种个体的表型观测值，u表示总体均数，S_i、D_j分别为第i个父本和第j个母本一般配合力效应，SD_ij为第i个父本与第j个母本的互作效应即正交特殊配合力效应，E_ijk表示随机误差效应，并假设其独立地服从N(0，σ_e²)分布。整个群体的变异可以剖分为一般配合力(GCA)、特殊配合力(SCA)、随机误差等组成部分。模型采用二因素有互作的均数加权最小二乘分析法进行配合力分析。其正规方程为(X′X)b=X′Y

其约束条件为$ \sum_i \hat{S}=\sum_j \hat{D}=\sum_i \hat{S} D=\sum_j \hat{S} D=\sum \sum_{i j} \hat{S} D=0$

2.   结果与分析

2.1   急性胁迫耐受性比较

F₁代9个群体幼虾各理化因子48 h急性胁迫耐受成活率见表 2。9个群体低溶氧48 h急性胁迫耐受成活率为15.56%~84.45%，其中TZ×UM群体成活率最低，UM×UH群体成活率最高。UH×TZ群体低盐48 h急性胁迫耐受成活率最低[(16.67±1.93)%]，UM×UH群体高氨氮48 h急性胁迫耐受成活率最高[(64.44±2.39)%]。各交配组合耐低溶氧和高氨氮成活率单因素方差分析多重比较，差异均达到显著水平(P < 0.05)，表明可以进一步进行交配组合的杂种优势和配合力分析。

表  2  各理化因子48 h胁迫下不同凡纳滨对虾群体的耐受成活率

Table  2.  Effect of physicochemical factors on survival rate of different populations of L.vannamei

杂交组合 cross combination	耐受成活率/% survival rate
	低溶氧lower DO	高氨氮higher ammonia nitrogen
UM×UH	84.45±6.19a	64.44±2.94a
UM×UM	53.33±3.33de	21.11±1.06de
UM×TZ	80.00±7.70ab	55.56±6.37ab
UH×UH	66.67±3.47b	54.44±8.29ab
UH×TZ	50.00±3.85e	16.67±1.93f
UH×UM	55.55±7.78cd	56.67±5.09bc
TZ×UM	15.56±2.44f	21.11±5.56ef
TZ×UH	65.55±2.22c	62.22±2.82ab
TZ×TZ	52.22±4.84e	47.78±7.78cd
均值mean	62.59±4.63	44.44±4.61
注：不同字母表示组间差异达到显著水平(P < 0.05) Note：Different letters indicate significant difference among treatments at 0.05 level.

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2.2   各理化因子耐受性的杂种优势

成活率数据经平方根反正弦转换后的杂种优势分析结果见表 3。6个杂交组合耐低溶氧和高氨氮性状的中亲优势和超亲优势均存在较大差异。耐低溶氧性状MP和BP的变化为-52.48%~31.39%和-54.34%~24.66%，其中UM和UH群体的杂交中亲优势均值最高(13.10%)；耐高氨氮性状MP和BP的变化为14.09%~42.57%和1.860%~26.18%，UM和UH群体的杂交中亲优势均值最高(36.48%)。

表  3  各理化因子48 h胁迫下各杂交组合耐受成活率的杂种优势

Table  3.  Survival rate of heterosis of different populations of L.vannamei under stress in 48 h

理化因子 physicochemical factor		杂交组合cross combination
		UM×UH	UH×UM	均值mean	UM×TZ	TZ×UM	均值mean	UH×TZ	TZ×UH	均值mean
中亲优势MP/%	溶氧	31.39	-5.19	13.10	29.73	-52.48	-11.38	2.36	-14.79	-6.22
	氨氮	42.57	30.39	36.48	35.60	25.33	30.47	14.09	31.47	22.78
超亲优势BP/%	溶氧	21.99	-11.97		24.66	-54.34		-1.25	-17.79
	氨氮	12.29	2.70		10.21	1.86		9.51	26.18

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2.3   配合力分析

低溶氧和高氨氮胁迫下成活率性状一般配合力与特殊配合力方差分析见表 4。结果表明低溶氧和高氨氮的一般配合力和特殊配合力方差检验均达到显著(P < 0.05)或极显著水平(P < 0.01)，说明这些耐受性性状遗传除受加性遗传效应控制，还受亲本间互作效应的影响。表 5显示了不同群体不同性状的配合力效应值。可以看出，UH群体耐高氨氮和低溶氧性状的一般配合力较高，分别为0.215 7和0.124 2；UM群体和UH群体组合的各抗逆性状的特殊配合力效应值较高，体现了两亲本群体较高的非加性效应。

表  4  各理化因子耐受成活率性状配合力的方差分析

Table  4.  Variance components of combining ability of survival rate of L.vannamei under stress

性状 trait	来源 source	一般配合力general combining ability		特殊配合力 specific combining ability	残差 residual
		父本♂	母本♀
低溶氧lower DO	MS	0.344 1	0.079 3	0.240 0	0.023 4
	F	14.715 0**	3.390 9	10.262 0**
高氨氮higher ammonia nitrogen	MS	0.130 0	0.011 1	0.147 6	0.035 9
	F	3.621 7*	0.309 4*	4.110 0*
注：*表示差异显著(P < 0.05)；* *表示差异极显著(P < 0.01). Note：* and * * represent P < 0.05 and P < 0.01，respectively.

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表  5  凡纳滨对虾群体各耐受性状配合力效应值分析

Table  5.  Combining ability of survival rate of L.vannamei under stress

	杂交群体 cross combination	理化因子physicochemical factors
		低溶氧lower DO	高氨氮higher ammonia nitrogen
一般配合力general combining ability	UM父本	0.151 5	-0.042 0
	UH父本	0.034 4	0.071 5
	TZ父本	-0.185 9	-0.029 5
	UM母本	-0.190 5	-0.189 8
	UH母本	0.089 9	0.144 2
	TZ母本	0.100 7	0.045 6
	UM群体	-0.039 0	-0.231 8
	UH群体	0.124 2	0.215 7
	TZ群体	-0.085 3	0.016 0
母本效应maternal effect	UM群体	-0.342 0	-0.147 8
	UH群体	0.055 5	0.072 7
	TZ群体	0.286 6	0.075 1
特殊配合力specific combining ability	UM×UH	0.081 7	0.108 0
	UM×TZ	-0.060 5	-0.025 0
	UH×TZ	-0.034 0	0.070 0

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3.   讨论

3.1   一般配合力

氨氮是对虾养殖水环境中最主要的污染物质之一，主要以离子氨和非离子氨的形式存在，对对虾的生长、蜕皮、耗氧量、氨氮排泄、渗透压调节及抗病力等多个方面有不利影响^[21]。而溶解氧含量也直接影响水生动物的生长和成活。因此，提高凡纳滨对虾对养殖环境的应激适应力是对虾健康种质改良的重要方向。大量研究^[22-24]表明，虾苗胁迫耐受性强，在后期养成过程中会具有更高的成活率和显著的生长优势。目前有关对虾耐高氨氮和低溶氧性状选育的研究报道较少，孙苗苗等^[23]利用巢式设计构建了13个斑节对虾(Penaeus monodon)家系，评估了稚虾对氨氮的耐受性；何玉英等^[24]比较了中国对虾(Fenneropenaeus chinensis)家系幼体的pH和氨氮的耐受性，为中国对虾的抗逆选育提供了基础。该研究中UH群体的耐低溶氧、高氨氮等性状的一般配合力效应值均为正向效应，分别为0.124 2和0.215 7，表明该群体内存在丰富的加性遗传变异。可见凡纳滨对虾不同交配群体对氨氮的耐受性存在较大的遗传变异，这为选育耐高氨氮性状的对虾品系提供了理论依据，也使得从对虾种质改良方面解决对虾养殖环境恶化与追求高产量间的矛盾成为可能。而养殖水质环境与遗传育种工作相结合进行选育的研究工作处于刚起步阶段。该研究以溶氧和氨氮48 h急性胁迫的耐受性成活率为指标，比较分析不同群体之间的体质差别；并将其作为抗逆性状进一步分析杂种优势和配合力效应，比较不同交配组合之间的遗传差别，可为凡纳滨对虾遗传选育工作提供参考。

3.2   特殊配合力和母本效应

凡纳滨对虾高氨氮和低溶氧抗逆性状的表现与其亲本的配合力密切相关，通过亲本配合力分析可以评估各亲本材料作为杂交亲本时的优劣，以及对每个杂交组合的性状好坏作出判断^[25]。分析该研究中正反交组合耐高氨氮和低溶氧性状的特殊配合力效应值表明，群体UM和群体UH的杂交后代耐低溶氧、高氨氮等性状的特殊配合力效应值具有较明显的正向优势，杂交后代杂种优势明显，存在较高的抗逆非加性效应，而群体UM或群体UH与群体TZ组合均表现为负的特殊配合力效应值，因此在留种群体中可适当增加UH群体和UM群体数量。此外该研究使用材料为3~4 cm仔虾，有研究指出对虾早期生长性状受母本效应影响显著，黄永春等^[26]研究发现，正、反交凡纳滨对虾的抗WSSV遗传上偏向母本，即母体效应占主导地位。该实验中耐高氨氮和低溶氧性状均存在较高的母本效应。因此推断凡纳滨对虾无论是生长性状、抗病性状还是抗逆性状，其早期发育阶段均受到母本效应显著影响，此方面有待深入研究。

3.3   性状相关性

刘海英等^[27]研究表明，对虾在氧浓度高的水体中氨氮耐受性强于氧浓度低的水体。对其他水产动物，如大菱鲆^[28]、半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)^[29]、黄颡鱼(Pelteobagrus fulvidraco)^[30]等的研究也有相似结果。该研究中3个群体凡纳滨对虾双列杂交F₁幼虾高氨氮耐受性与低溶氧耐受性间表型相关系数为0.730，相关性检验显著(P < 0.05)，而一般配合力相关系数为0.637，相关性检验不显著(P>0.05)，其具体原因还有待进一步探讨。但是，该实验发现UM×UH交配组合低溶氧与氨氮耐受性均较好，说明耐低溶氧与耐高氨氮的基因有可能在同一凡纳滨对虾个体上表达。因此，在制定对虾育种方案时，可以采用选择指数法同时考虑高氨氮耐受性和低溶氧耐受性，培育出既耐低溶氧又耐氨氮的凡纳滨对虾品种。NIELSEN等^[31]采用选择指数法，提高了鲤(Cyprinus carpio)的生长性状和成活率性状。OFLYNN等^[32]利用选择指数法同时提高了大西洋鲑(Salmo salar)幼鲑的成活率和抗BKD成活率。随着研究进一步的深入，笔者将优化育种方案，结合现代育种技术，构建半同胞、全同胞家系，利用最佳线性无偏估计法(BLUP法)估算高氨氮和低溶氧耐受性状遗传参数；确定家系或者个体的选择指数，加快选育速度，培育出具有中国自主知识产权的凡纳滨对虾抗逆新品种。