Molecular cloning and expression analysis of aspartate aminotransferase (AST) in Penaeus monodon under ambi-ent ammonia stress
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摘要:
为了探索天门冬氨酸转氨酶(AST)在斑节对虾(Penaeus monodon)氨氮(NH3-N)解毒代谢中的作用, 该研究利用RACE技术获得了斑节对虾AST基因(PmAST)的cDNA全长序列, 进行了相关生物信息学分析, 在此基础上采用荧光定量与氨氮胁迫实验的方法研究了PmAST基因在斑节对虾的不同组织以及不同浓度氨氮胁迫过程中差异表达情况。该序列全长1 957 bp, 开放阅读框(ORF)为1 242 bp, 3′非编码区(UTR)为584 bp, 包括含有30个碱基的poly(A)尾, 5′非编码区(UTR)为131 bp。ORF可编码413个氨基酸, 预测分子量为45.852 kD, 理论等电点为8.85。序列含有1个AAT-like超家族结构域、15个磷酸化位点和2个糖基化位点。PmAST的mRNA在斑节对虾各组织中都有表达, 在肝胰腺中表达量最高, 其次为鳃组织, 在胃和脑组织中的表达量最低。96 h氨氮胁迫后荧光定量PCR分析结果表明, PmAST在肝胰腺和鳃组织中都具有不同程度的表达上调, 显著高于对照组(P < 0.05)。研究结果表明斑节对虾的PmAST基因在氨氮胁迫条件下会出现表达上调, 并且氨氮浓度越高其上调幅度也越大, 所以PmAST参与了斑节对虾的急性氨氮胁迫应答。
Abstract:To explore the function of aspartate aminotransferase gene in the process of the ammonia nitrogen metabolism of black tiger shrimps (Penaeus monodon), the full-length cDNA sequence of aspartate aminotransferase from P.monodon (PmAST) was obtained by high throughput transcriptome sequencing and rapid amplification of cDNA ends.On this basis, the expression of the PmAST in different tissues under different ambient ammonia stress were detected by fluorescence-quantitative real time PCR.The cDNA length of PmAST was 1 957 bp, including a 5′UTR of 131 bp and a 3′UTR of 584 bp.The length of the open reading frame (ORF) was 1 242 bp encoding a polypeptide of 413 amino acid.The molecular mass of the deduced amino acid (aa) sequence was 45.852 kD with an estimated pI of 8.85, and there was a tailing signal (poly A) with 30 bp length.Like other animals′ ASTs, the structure of PmAST protein included an AAT-I superfamily domain.There were 15 phosphorylation sites and 2 glycosylation sites in this protein.Analysis of the tissue expression pattern of the PmAST shows that PmAST mRNA was expressed in all tested tissues, including ovary, haemolymph, brain, lymph, stomach, muscle, thoracic ganglia, heart, hepatopancreas and gill.The PmAST expression reached the maximum value in hepatopancreas and was the lowest in brain.After ambient ammonia stress experiment, the expression of the PmAST in hepatopancreas and gill was significantly higher than that in the control (P < 0.05), and the expression profiles differed between hepatopancreas and gill.The result shows that the higher the ambient ammonia concentration is, the greater the increase of PmAST expression will be.Therefore, the PmAST takes part in acute ammonia stress.
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Keywords:
- Penaeus monodon /
- AST /
- ambient ammonia stress /
- gene clone /
- tissue expression
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黄鳍金枪鱼 (Thunnus albacares) 隶属于鲭科、金枪鱼属，是一种喜集群的大洋性洄游鱼类，因背鳍、臀鳍及小鳍同为橘黄色，又名黄鳍鲔[1]。广泛分布于太平洋、大西洋、印度洋的热带和亚热带海域[2]。众所周知，金枪鱼具有生长速度快、粗蛋白和不饱和脂肪酸含量高的特点，深受消费者喜爱[3]。金枪鱼的丰度还可以支持珊瑚礁、沿海渔业和海水养殖等产业的可持续开发和利用[4]。其种群是组成远洋生态系统的关键部分，也是世界上最大和最有价值的渔业之一[5]。
对水生动物来说，pH是一个重要的环境因子，其极细微的变化也会产生深远影响[6]；从而引起生态系统内一系列的化学变化，影响大多数水产生物的生长、繁殖、代谢与生存[7]。当水体pH下降到一定程度，超过机体的最大调控范围，就会出现细胞内酸中毒和环境高碳酸血症[8]。二氧化碳 (CO2)排放过量引起的海洋酸化改变了海洋环境，扰乱了海洋动物机体的新陈代谢、酸碱平衡和生物体内多种酶的活性[9]。有研究表明，水体酸化会使金头鲷 (Sparus aurata) 的抗氧化能力受到抑制[10]；过酸的养殖水体会显著影响脊尾白虾 (Exopalaemon carinicauda) 的非特异性免疫力[11]；酸化导致了青鳉 (Oryzias melastigm) 幼鱼脂质代谢紊乱[12]；严重的酸化条件与舌齿鲈 (Dicentrarchus labrax) 显著升高的最大代谢率有关[13]；海洋酸化会导致金枪鱼的生物量减少[14]。
大气中过多的CO2被海水吸收后形成碳酸，增加了海水酸度，然而少有酸化胁迫对黄鳍金枪鱼幼鱼生理特性影响的报道。随着捕捞量的增加，金枪鱼的资源量急剧下降，无法满足市场需求。本研究通过测定相关酶活性，评估海水酸化胁迫对黄鳍金枪鱼幼鱼抗氧化防御系统和免疫功能的影响，为海洋生态环境和金枪鱼野生种群的保护提供参考。
1. 材料与方法
1.1 实验材料
黄鳍金枪鱼幼鱼平均体长为 (18.21±1.09) cm、平均体质量为 (354.98±149.77) g，由中国水产科学研究院南海水产研究所热带水产研究开发中心提供。实验用水为砂滤后的自然海水，水温 (22.5±1.0) ℃，溶解氧质量浓度 (7.5±0.5) mg·L−1，盐度 (33.00±0.80)‰，氨氮质量浓度 <0.05 mg·L−1，亚硝酸盐质量浓度 <0.05 mg·L−1。
1.2 实验设计
正式实验开始前，先将金枪鱼幼鱼在驯养池中暂养7 d，期间投喂冰鲜杂鱼。随机挑选72尾行为活泼、体表健康的幼鱼，在直径和水深均为1.5 m的圆形钢化桶中进行48 h的酸化胁迫实验，暂养期间与正式实验期间水质保持一致。实验共设置4组，以自然海水pH 8.1为对照组，pH 7.6、7.1、6.6为实验组，每组设3个重复，每个重复6尾鱼。实验期间金枪鱼幼鱼处于停食状态。并通过1.0 mmol·L−1的氢氧化钠 (NaOH) 溶液或1.0 mmol·L−1的盐酸 (HCl) 溶液调节海水pH。使用pH分析仪 (PH848) 测定海水酸度，每2 h矫正1次，使pH变化幅度保持在 ±0.1。实验至第48小时，统计死亡的幼鱼数量 (以鱼体侧躺、沉入水底不再游动为准)，计算成活率。
1.3 样品采集与处理
实验结束后每组随机选取6尾黄鳍金枪鱼幼鱼，经丁香酚麻醉后进行解剖，解剖全程在冰盒上进行。分别采集肝、鳃、红肌、皮肤组织于2 mL无菌冻存管中，置于液氮中冷冻，之后保存在−80 ℃冰箱中用于后续免疫和代谢酶的测定。准确称取组织0.1~0.2 g，加入9倍体积的0.9% (w) 盐水，冰水浴条件下机械匀浆后，3 000 r·min−1离心10 min，取上清液测定相关酶活性和总蛋白含量。选取丙二醛 (MDA) 为抗氧化物质的标志物；超氧化物歧化酶 (SOD)、过氧化氢酶 (CAT)、谷胱甘肽过氧化物酶 (GSH-Px) 和过氧化物酶 (POD) 作为抗氧化防御系统的标志物；酸性磷酸酶 (ACP)、碱性磷酸酶 (AKP)、溶菌酶 (LZM) 作为免疫系统的标志物。上述所有检测均使用南京建成生物工程研究所试剂盒，所有指标的测定严格按照说明书进行操作。采用酶标仪 (SYNERGY-HT) 或分光光度计 (UV-1800BPC) 测定各项指标。
1.4 数据处理
采用Excel 2010软件整理数据，以“平均值±标准差 ($\overline { x}\pm s $) ”表示 (n=3)。实验结果通过SPSS 25.0软件进行单因素方差分析 (One-way ANOVA)，并用邓肯检验法分析组间差异性，显著性水平α为0.05。使用Origin 2022软件作图。
2. 结果
实验至第48小时，仅pH 6.6处理组的幼鱼出现死亡，成活率为83%。各组之间无显著性差异 (P>0.05，图1)。
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图 1 酸化胁迫对黄鳍金枪鱼幼鱼成活率的影响注：相同字母表示组间无显著性差异 (P>0.05)。Figure 1. Effect of acidification stress on survival rate of juvenile yellowfin tunaNote: Same letters represent no significant differences among groups (P>0.05).2.1 酸化胁迫对黄鳍金枪鱼幼鱼抗氧化能力的影响
与对照组相比，各实验组皮肤的MDA含量均有所下降，红肌和鳃的MDA含量均有所上升。除对照组外，相同pH下肝脏中的MDA含量均显著高于其他组织 (P<0.05)，且随着pH的降低呈上升趋势，在pH 6.6时含量最高 (图2)。
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图 2 酸化胁迫对黄鳍金枪鱼幼鱼丙二醛含量的影响注：相同pH下不同字母表示不同组织间差异显著 (P<0.05)。Figure 2. Effect of acidification stress on MDA of juvenile yellowfin tunaNote: Different letters represent significant differences among different tissues with same pH (P<0.05).随着pH的降低，皮肤中的SOD活性呈先下降再上升的趋势，肝中的SOD活性呈下降趋势，二者均在pH 8.1时达到最高。红肌中的SOD活性在pH 7.6时最高。鳃中的SOD活性在pH 7.1时达到最高，且随着pH的降低呈先上升后下降的趋势；除对照组外，相同pH下鳃中的SOD活性均显著高于其他组织 (P<0.05，图3-a)。
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图 3 酸化胁迫对黄鳍金枪鱼幼鱼超氧化物歧化酶、过氧化氢酶、谷胱甘肽过氧化物酶和过氧化物酶活性的影响注：相同pH下不同字母表示不同组织间差异显著 (P<0.05)。Figure 3. Effects of acidification stress on SOD, CAT, GSH-Px and POD activities of juvenile yellowfin tunaNote: Different letters represent significant differences among different tissues with the same pH (P<0.05).随着pH的降低，皮肤中的CAT活性呈下降趋势，在pH 8.1时活性最高。鳃和红肌中的CAT活性呈先上升再下降的趋势，在pH 7.1时达到最高；除对照组外，相同pH下鳃中的CAT活性均显著高于其他组织 (P<0.05)。肝中的CAT活性变化平稳，在pH 6.6时达到最高。相同pH下，肝和鳃中的CAT活性均显著高于皮肤和红肌 (P<0.05，图3-b)。
随着pH的降低，皮肤、红肌和鳃中的GSH-Px活性变化相似，均呈先上升后下降的趋势，且均在pH 7.1时达到最高，此时皮肤中的GSH-Px活性显著高于其他组织 (P<0.05)。肝中的GSH-Px活性呈上升趋势，在pH 6.6时达到最高 (图3-c)。
随着pH的降低，皮肤中的POD活性呈下降趋势，在pH 8.1时活性最高。红肌中各实验组的POD活性均高于对照组，在pH 6.6时达到最高。鳃中的POD活性呈先上升后下降的趋势，在pH 7.1时达到最高；相同pH下鳃中的POD活性均显著高于其他组织 (P<0.05)。肝中的POD活性呈先下降再上升的趋势，在pH 8.1时活性最高。除对照组外，相同pH下红肌和鳃中的POD活性均显著高于皮肤和肝 (P<0.05，图3-d)。
2.2 酸化胁迫对黄鳍金枪鱼幼鱼免疫酶活性的影响
随着pH的降低，肝和皮肤各实验组的ACP活性与对照组相比均有所下降；相同pH下肝中的ACP活性均显著高于其他组织 (P<0.05)。红肌中的ACP活性呈先上升后下降再上升的趋势，在pH 7.6时达到最高；鳃中的ACP活性呈先上升后下降的趋势，在pH 7.1时达到最高。相同pH下鳃中的ACP活性均显著低于其他组织 (P<0.05，图4-a)。
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图 4 酸化胁迫对黄鳍金枪鱼幼鱼酸性磷酸酶、碱性磷酸酶和溶菌酶活性的影响注：相同pH下不同字母表示不同组织间差异显著 (P<0.05)。Figure 4. Effects of acidification stress on ACP, AKP and LZM activities of juvenile yellowfin tunaNote: Different letters represent significant differences among different tissues with the same pH (P<0.05).随着pH的降低，鳃、红肌和皮肤中的AKP活性呈先下降后上升的趋势，均在pH 8.1时最高。肝中的AKP活性呈上升趋势，在pH 7.1时达到最高。相同pH下红肌中的AKP活性均显著低于其他组织 (P<0.05，图4-b)。
随着pH的降低，皮肤中的LZM活性呈先上升后下降的趋势，在pH 7.1时达到最高。鳃和红肌中的LZM活性呈上升趋势，均在pH 6.6时达到最高；相同pH下鳃中的LZM活性均显著高于其他组织 (P<0.05)。肝中的LZM活性在pH 7.1时达到最高 (图4-c)。
3. 讨论
3.1 环境胁迫对水产动物不同组织抗氧化能力的影响
MDA是脂质过氧化的重要产物[15]，反映机体受氧化损伤的程度[16]，其含量随着机体氧化应激水平升高而增加，含量越高表明鱼体所受的压力越大[17]。肝脏有排泄、解毒等多种功能，可清除外来有害物质和机体产生的有害废物[18]；且含有大量与免疫相关的细胞，具有重要的免疫调节功能，在机体的免疫应答中发挥重要作用[19]。本研究中肝脏的MDA含量随海水酸度升高呈上升趋势，且累积含量显著高于其他组织。可能是由于金枪鱼处于应激状态，体内产生大量的活性氧自由基，脂质过氧化水平升高，机体出现了氧化损伤，与克氏原螯虾 (Procambarus clarkii)[20]的结果相似。
SOD和CAT活性的变化可在一定程度上反映出机体受环境胁迫时免疫机能的变化[21]。GSH-Px在清除过氧化氢 (H2O2)、把脂质过氧化物还原成无毒产物方面起着至关重要的作用[22]，其与CAT在清除自由基方面既是互补也是竞争关系[23]。SOD、CAT和GSH-Px协同作用，是抗氧化系统的重要组成部分[24]。POD和生物应激相关，可水解H2O2，对细胞起保护作用[25]。
鳃是鱼类主要的呼吸和免疫器官，表面积大且与水体直接接触，易受有害物质伤害[26]；其黏膜中含有丰富的免疫分子，在抵御外界侵袭中发挥重要作用[27]。本研究中，各处理组鳃中的SOD、CAT和POD活性显著高于其他组织，且在pH 7.1时达到最高。说明酸性胁迫下金枪鱼组织中的活性氧自由基含量升高，诱导SOD、CAT和POD的活性升高，鱼体通过激活抗氧化酶系统促进蛋白质合成，改善代谢产物，保护细胞不受损伤，从而使鱼体能够适应低pH环境，达到新的动态平衡。但水体酸度过高时，鱼体会产生过量的氧自由基 (·O2−)，机体无法产生足够的SOD和CAT来清除 ·O2−，且动物机体在受到环境胁迫时，SOD和CAT可能会发生抑制的应激变化[28]，因此本研究鳃中的CAT活性在pH 6.6时有所回落。与沙塘鳢 (Odontobutis potamophila)[29]、瓦氏黄颡鱼 (Pelteobagrus vachelli)[30]和方斑东风螺 (Babylonia areolata)[31]的研究结果相似。
鱼类皮肤的腺层内含有丰富的腺细胞，分泌的黏液中含有丰富的免疫因子，如溶菌酶、补体类物质等[32]，构成了机体的第一道防线[33]。本研究中，皮肤的GSH-Px活性在pH 7.1时达到最高，显著高于其他组织，而CAT活性低于其他组织，可能是由于H2O2没有被CAT及时分解，诱导机体生成更多的GSH-Px来清除多余的H2O2。GSH-Px的活性升高，谷胱甘肽 (GSH) 等抗氧化物质就会消耗过大，可能导致机体受到损伤[34]。本研究中皮肤的GSH-Px活性在pH 7.1时大幅上升，推测此时鱼体无法适应过酸的海水，机体出现了损伤。与尖吻鲈 (Lates calcarifer) 幼鱼[35]和点篮子鱼 (Siganus guttatus) 幼鱼[36]的表现类似。
3.2 环境胁迫对水产动物不同组织免疫酶的影响
磷酸酶又称正磷酸单酯水解酶，可以催化各种含磷化合物的水解，根据他们的特性 (即起催化作用的最适pH)，可分为ACP和AKP两类[37]，前者主要起催化效果，后者主要起调理和调节的作用[38]。当水体中溶解氧含量低于正常水平时，鱼体发生应激反应，并通过提高AKP和ACP的活性来增强非特异性免疫力[39]。
本研究中，肝脏的ACP活性显著高于其他组织，且随着pH的降低呈下降趋势；但AKP活性呈上升趋势，可能因为二者在肝脏中的作用不同。分析出现上述结果的原因，可能是海水酸度过高，机体为了维持酸碱和离子平衡而采取的一种调节措施，是生物体主动防御的表现。类似的报道还有脊尾白虾[11]和栉孔扇贝 (Chlamys farreri)[21]。鳃中的ACP和AKP变化不一致，可能是此时的环境pH影响了鳃细胞参与免疫的水解酶活性。类似的结果还见于翘嘴鳜 (Siniperca chuatsi) 幼鱼[40]和缢蛏 (Sinonovacula constricta) 成贝[41]。
LZM是衡量鱼类非特异性免疫的指标之一[42]，在面对外界环境胁迫时，其活性会升高[43]，活性越强，机体的非特异性免疫力就越强[44]。鳃中的LZM活性显著高于其他组织，且随海水酸度的升高呈上升趋势。可能是由于海水酸度的增加使金枪鱼处于应激状态，鱼体通过增加LZM的活性以抵抗外源环境的压力，属于自身的应急保护反应。
4. 结论
本研究通过设置4组酸化梯度 (pH 8.1、7.6、7.1、6.6) 对黄鳍金枪鱼幼鱼进行48 h的环境胁迫，结果显示，酸化胁迫对黄鳍金枪鱼幼鱼的免疫功能和抗氧化防御系统影响显著。抗氧化物质在pH 6.6时达到最高；抗氧化酶的活性多数在pH 7.1时达到最高；非特异性免疫酶变化不一，不同酶的活性因组织不同而呈类似或不同的变化趋势。提示黄鳍金枪鱼幼鱼在pH大于7.1的酸化环境中有一定的调节能力，pH小于7.1时免疫系统发生紊乱。整体而言，肝脏和鳃中的酶活性高于红肌和皮肤，这表明在面对海水酸度升高时，肝脏和鳃中的抗氧化酶和免疫酶能更好地表达，二者抗氧化酶和免疫酶的变化可以代表黄鳍金枪鱼幼鱼机体免疫功能和抗氧化防御系统的变化。
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图 1 斑节对虾AST基因的核酸和氨基酸序列
两边每行标注的序号是指核苷酸和氨基酸的位置; 起始密码子(ATG)和终止密码子(TAA)用下划线标出; poly(A)尾巴用斜体字标出; 字体加粗标注为多肽结合位点; 灰色阴影标注为糖基化位点; 方框所示为谷AAT-like超家族结构域; 圆框中为磷酸吡哆醛结合位点; 三角框中为Lys催化残基。
Figure 1. Nucleotid and amino acid sequences of PmAST
The serial numbers on both sides of each row refer to the location of nucleotides and amino acids; start codon (ATG) and termination codon (TAA) are underlined; "*" indicates stop codon; the poly (a) signals are in italics; eight poly peptide sites are highlighted in bold; shadow area indicates two glycosylation sites; the completed AAT-I superfamily domains are shown in the box; ten PLP binding sites are represented by round frames; the catalytic residue is marked by a triangle.
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图 2 斑节对虾AST蛋白与小鼠AST蛋白三维结构空间示意图
Figure 2. Three-dimensional ribbon structures of PmAST protein and M.musculus AST
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图 3 PmAST的氨基酸序列与其他物种AST的氨基酸多重序列比对
Figure 3. Multiple alignment of predicted amino acid sequence of PmAST with other eukaryote AST amino acid sequences
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图 4 利用MEGA 6.0软件构建的基于PmAST基因所编码氨基酸序列的NJ系统进化树
Figure 4. NJ phylogenetic tree based on PmAST amino acid sequences by MEGA 6.0
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图 5 斑节对虾AST基因在各组织表达情况
HE.肝胰脏; G.鳃; M.肌肉; H.心脏; TG.胸神经; O:卵巢; HA.血淋巴L.淋巴; S.胃; B.脑; 图中数值为平均值±标准差(X ±SD), 小写字母不同表示差异性显著(P < 0.05)。
Figure 5. Expression of P.monodon AST in different tissues
HE.hepatopancreas; G.gill; M.muscle; H.heart; TG.thoracic ganglia; O.ovary; HA.haemolymph; L.lymph; S.stomach; B.brain; values (X ±SD) with different letters are significantly different from one another (P < 0.05).
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图 6 斑节对虾肝胰腺和腮中PmAST基因在氨氮胁迫过程中表达变化情况
图中数值为“平均值±标准差(X ±SD)”, 同一时间内小写字母不同表示实验组与对照组差异性显著(P < 0.05)。
Figure 6. Expression profiles of PmAST gene in P.monodon hepatopancreas and gill during ambient ammonia stress
Values (X ±SD) with different lowercase letters at the same time are significantly different with the control (P < 0.05).
表 1 斑节对虾AST基因克隆与表达分析所用引物序列
Table 1 Oligonucleotide primers used in the experiment
引物名称
primer引物序列(5′→3′)
primer sequence用途
functionTZ-F AATACGCTTCGCTCCGC 已知片段验证 TZ-R TTGCCTGCTTTGTTTACCAT TZS1 CCATCAGAGACTGGAGTCACATCA 3′RACE TZS2 TTCTGTGTACCTGACAAAGGATGG TZA1 CACCAACGCCAAGATTC 5′RACE TZA2 TGTCACGCTTGAATGCC β-actin-F AGTAGCCGCCCTGGTTGTAGA 内参基因 β-actin-R TTCTCCATGTCGTCCCAGT TZD-F AGCCCAGTTATTGCCGATG 荧光定量 PCR TZD-R GAAGGTGGAGCCAATACGGA 
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