Characterization and expression analysis of ho1 from Sander lucioperca under acute hypoxia stress
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摘要: 梭鲈 (Sander lucioperca) 对低氧极敏感，在集约化养殖和苗种运输过程中易发生低氧应激和死亡现象。为探究血红素加氧酶1 (Heme oxygenase 1, HO1) 在梭鲈响应低氧过程中的调节作用，通过RACE (Rapid amplification of cDNA ends) 技术克隆了梭鲈ho1基因，其cDNA全长为1 256 bp，包含840 bp的开放阅读框 (Open reading frame, ORF)、162 bp的5'非编码区 (Untranslated region, 5'-UTR) 和254 bp的3'-UTR，编码279个氨基酸。多重序列比对显示，梭鲈HO1与翘嘴鳜 (Siniperca chuatsi)、舌齿鲈 (Dicentrarchus labrax) 和大口黑鲈 (Micropterus salmoides) 的氨基酸序列相似性分别为91.84%、88.69%和88.11%。实时荧光定量结果显示，ho1基因在所有检测组织中均有表达，其中在脑组织中高表达，其次是肾、肝、鳃等组织。低氧刺激前3 h，梭鲈ho1主要在皮肤、鳃中响应；低氧胁迫3 h后，ho1主要在心、肝、肾中发挥转录调控作用。复氧12 h，除肝脏外，梭鲈其他组织ho1的相对表达量均可恢复正常，低氧刺激对肝组织ho1的表达产生了较大影响。研究表明，ho1基因参与梭鲈响应低氧的分子调节机制并在其中发挥着重要的生物学功能，可为深入了解梭鲈低氧胁迫遗传机制提供理论参考。Abstract: Sander lucioperca is extremely sensitive to hypoxia, and is prone to hypoxia stress and death during intensive breeding and seedling transportation. In order to investigate the regulating effect of heme oxygenase 1 (HO1) in the response to hypoxia of S. lucioperca, we cloned the full-length cDNA sequence of ho1 gene by RACE (Rapid amplification of cDNA ends) technology. The results indicate that the cDNA length was 1 256 bp (840 bp ORF, 162 bp 5'-UTR and 254 bp 3'-UTR), encoding 279 amino acids. The multiple sequence alignment shows that the similarity of HO1 with Siniperca chuatsi, Dicentrarchus labrax and Micropterus salmoides was 91.84%, 88.69% and 88.11%, respectively. Real-time quantitative PCR discloses that ho1 was expressed in all the tested tissues, with the highest concentration in the brain, followed by the kidney, liver and gills. During the first 3-hour hypoxic stimulation of Pikeperch, ho1 primarily responded in the skin and gills, but mainly played transcriptional regulatory roles in the heart, liver and kidney after 3 h of hypoxic stress. At 12th hour of reoxygenation, the expression levels of ho1 in all the tissues except the liver returned to a normal level, and hypoxia stress had an enormous effect on the expression of ho1 in the liver. The study reveals that ho1 gene is involved in the molecular regulation mechanisms of S. lucioperca in response to hypoxia and plays an important biological role, which provides theoretical references for understanding the genetic mechanism of hypoxic stress.
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Keywords:
- Sander lucioperca /
- ho1 /
- Gene clone /
- Hypoxia stress /
- Gene expression
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海洋中存在产毒微藻，双壳贝类由于其滤食性特征，极易蓄积藻毒素，进入贝类体内的藻毒素及其次生代谢产物通常称为贝类毒素[1-2]。贝类毒素按化学结构分为8类：石房蛤毒素 (Saxitoxin, STX)、软骨藻酸 (Domoic acid, DA)、原多甲藻毒素 (Azaspiracid, AZA)、短裸甲藻毒素 (Brovetoxin, BTX)、环亚胺 (Cyclic imines, CI)、大田软海绵酸 (Okadaic acid, OA)、扇贝毒素 (Pectenotoxin, PTX) 和虾夷扇贝毒素 (Yessotoxin, YTX)，根据其溶解性分为脂溶性贝类毒素和水溶性贝类毒素[3-5]；除STX和DA外，其余均为脂溶性贝类毒素。脂溶性贝类毒素分布范围广，易在贝类的脂肪内蓄积，对消费者健康造成巨大危害。研究表明，OA及其类似物鳍藻毒素 (Dinophysis toxin, DTXs) 可抑制蛋白磷酸酶，导致中毒者出现腹泻、腹痛、呕吐等症状；AZAs对肝脏、心肌产生毒性作用；动物实验表明CI类毒素可作用于细胞的L型钙离子 (Ca2+) 通道使动物快速死亡；YTXs是一种较强的细胞毒素，对肝脏有损伤作用[6-10]。
广西北部湾海域是我国重要的海水养殖区，其海水养殖产量位居中国沿海地区第五，2020年产量为150万吨，其中贝类产量占比过半[11]。近年来监测发现：广西北部湾贝类中普遍存在脂溶性贝类毒素沾染；2017—2018年钦州湾养殖的近江牡蛎 (Crassostrea rivularis) 普遍沾染脂溶性贝类毒素[12]。2018—2019年对广西北部湾海域贝类中脂溶性藻毒素污染调查发现，环亚胺毒素 (Gymnodimine, GYM) 普遍存在，牡蛎中检出率最高的毒素为OA和GYM[13]。物种不同、季节变化等因素均会影响脂溶性贝类毒素的蓄积。2014—2017年，欧盟监测的18 862个贝类样本中，OA含量在春季达到最大值，而DTX-2几乎仅在秋冬季检测到，YTXs含量在8—9月最高[14-15]；在2017—2020年采自中国东南沿海的1 338份贝类样本中，贻贝、扇贝对亲脂性毒素的蓄积水平高于牡蛎、蛤蜊，PTX-2和Homo-YTX分别在6和7月达到最大值，OA在8月达到最大值[16]。
目前，广西北部湾地区尚未见有因食用贝类而引发大范围中毒事件的报道，但我国曾发生与贻贝中OA和DTX-1相关的中毒事件和有毒微藻暴发的记录[17-18]。有害藻类事件数据库 (Harmful algae event database, HAEDAT) 中记录了太平洋和大西洋沿岸与脂溶性贝类毒素相关的中毒事件共648起[17,19]。因此，脂溶性贝类毒素监测是贝类食用安全性评估的重要内容之一。在分析深圳市市售贝类产品中脂溶性贝类毒素的基础上，结合当地居民膳食调查数据发现，深圳居民食用贝类产品的急性风险评估值均低于欧盟规定的急性参考值[17]。有研究表明，2017—2018年钦州湾养殖的近江牡蛎食用安全风险较低，但该评估是以欧盟成员国居民膳食数据为基础[12]。由于各地饮食习惯不同，所食贝类染毒情况存在差异，目前尚缺乏根据本地居民贝肉摄入量和本地居民人体质量等膳食数据进行的食用风险评估。贝类产品是北部湾沿海居民日常膳食的重要组成部分，调查广西北部湾沿海居民膳食中贝类产品摄入情况，分析贝类毒素污染特征，并对居民膳食贝类产品而引发的食用风险进行评价，可为建立毒素限量标准提供科学依据。本研究于2021年11月—2022年10月分别在春、夏、秋、冬四季收集北部湾沿海3市 (钦州、北海、防城港) 居民最常食用的6种贝类，共228份样品。对贝类中9种脂溶性毒素含量和分布特征进行分析，包括OA、DTX1/2、AZA1/3、GYM、SPX1和YTX、Homo-YTX。结合膳食调查数据，评估了当地居民脂溶性贝类毒素的急性和慢性暴露风险。
1. 材料与方法
1.1 化学试剂与仪器
OA、DTX1/2、AZA1/3、GYM、SPX1和YTX、Homo-YTX标准品 (加拿大海洋生物研究所)；甲醇、乙腈 (质谱纯，美国Sigma公司)。
TGL-16M台式高速冷冻离心机 (上海卢湘仪离心机仪器有限公司)；VORTEX-6旋涡混匀器 (上海五久自动化设备有限公司)；液相色谱-质谱联用仪 (Liquid Chromatograph Mass Spectrometer) UPLC-MS/MS Waters UPLC (I-class)(美国Waters公司)；三重四级杆质Waters Xevo TQ-S Micro (美国Waters公司)；色谱柱：Waters ACQUITY UPLC BEH C18 (2.1 mm×50 mm)。
1.2 样品采集
2021年11月—2022年10月按季度从广西北部湾沿海3市、7个主要海鲜批发市场 (钦州市：钦州港、东风、鸿发3个市场；北海市：侨港、南珠2个市场；防城港市：月亮湾、企沙镇2个市场) 收集贝类样品。其中，钦州市90份样品，夏季24份，春、秋、冬季各22份；北海市72份样品，每季度采集18份；防城港市66份样品，冬季18份，春、夏、秋季各采集16份。贝类来源通过分销商收集。采集的贝类品种为牡蛎、贻贝、扇贝、平蛤蜊、栉江珧、蛏子6种，样品置于冰盒中，4 h内运回实验室进行处理。
1.3 样品制备与毒素提取
新鲜贝类样品用自来水清洗干净后，再用纯净水冲洗，去壳，沥干水分，全肉匀浆，匀浆处理后的样品于 −80 ℃保存，直至毒素提取。
取待测样品 [(1.00±0.02) g] 加入3 mL甲醇，涡旋混匀 (300 r·min−1, 3 min)，混合物 (4 ℃, 8 000 r·min−1) 离心10 min，将上清液转移至10 mL容量瓶中，重复3次，合并的上清液定容至10 mL，通过0.22 µm聚酰胺尼龙过滤器过滤到进样瓶中，−20 ℃储存直至进行LC-MS/MS分析。由于OA组毒素易发生酯化反应，需及时对贝肉毒素提取液水解后测定OA组毒素总量：取1 mL上述提取液于进样小瓶中，加入125 μL 2.5 mol·L−1氢氧化钠 (NaOH)，涡旋 0.5 min后 76 ℃加热40 min，待流水冷却至室温后用 125 μL 2.5 mol·L−1盐酸 (HCl) 中和，通过0.22 μm滤膜后，于 −20 ℃保存，待进行 LC-MS/MS 分析。
1.4 LC-MS/MS测定条件与检测方法
毒素检测方法参考刘红河等[20]和Qiu等[21]。流动相A：0.1% (体积分数) 甲酸+5 mmol·L−1甲酸铵的水溶液；流动相B：0.1% (体积分数) 甲酸+5 mmol·L−1甲酸铵的乙腈溶液。流速：0.35 mL·min−1，进样量：2 μL，柱温：40 ℃。质谱条件为：喷雾电压3.0 kV；锥孔电压30 V； 脱溶剂温度400 ℃；脱溶剂气 (N2) 1 000 L·h−1，通过LC-MS/MS测定9种脂溶性贝类毒素，毒素质谱参数见表1。各毒素标准曲线的相关系数均大于0.99。
表 1 9 种脂溶性贝类毒素检测参数Table 1. Detection parameters of nine lipophilic shellfish toxins毒素
Toxin电离模式
ESI mode母离子
Precursor ion/(m/z)子离子
Product ion/(m/z)碰撞电压
Collision energy/eV大田软海绵酸
OA[M+H]− 803.4 255, 563.2 −65, −55 鳍藻毒素1
DTX-1[M+H]− 817.5 255.1, 113.1 −65, −100 鳍藻毒素2
DTX-2[M+H]− 803.5 255.1, 563.2 −65, −55 虾夷扇贝毒素
YTX[M+H]− 1 141.5 1 061.5, 855.5 −65, −50 Homo-虾夷扇贝毒素
Homo-YTX[M+H]− 1 155.5 1 075.5, 869.5 −65, −50 环亚胺毒素
GYM[M+H]+ 508.3 174.3, 490.3 50, 35 螺环内酯毒素
SPX1[M+H]+ 692.5 444.4, 674.4 45, 45 原多甲藻酸1
AZA1[M+H]+ 842.5 806.5, 824.5 40, 50 原多甲藻酸3
AZA3[M+H]+ 828.5 810.4, 792.5 40, 50 1.5 膳食消费量调查
参照“中国居民营养与健康状况监测总体方案”[22]，采用分层抽样方法对钦州、北海、防城港3市共450户家庭合计 1 204名常住成年居民进行 24 h 膳食回顾法调查，问卷调查内容包括性别、年龄、体质量、摄入海产品的种类 (鱼类、贝类、藻类、头足类、甲壳类)、食用频率、食用量等。膳食调查由经过培训的调查员入户访问，对调查户成年家庭成员采用询问调查的方式，让被调查者回忆调查24 h内进食海产品情况，记录在家和在外所食用的全部海产品，统计居民连续7 d海产品进食情况。
1.6 膳食暴露风险评估
广西北部湾沿海居民脂溶性贝类毒素暴露评估依据《食品中化学品风险评估的原则和方法》(WHO & FAO, 2009)，采用海洋生物毒素点评估方法，分别计算膳食中每日毒素摄入量[22-23] 。单位体质量脂溶性贝类毒素每日摄入量 (Estimated daily intake, ESI) 按照公式 (1) 计算：
$$ Q_{\rm{ESI}}= (C_{1}\times M/m_{{\rm{b}}}) \times 10^{-3}$$ (1) 式中：QESI 为每日单位体质量海洋生物毒素的摄入量 [μg·(kg·d)−1]；C1为某种水产品中某种海洋生物毒素的质量分数 (μg·kg−1)；M为某种水产品日消费量(g·d−1)；mb为人体质量(kg)。将计算得到的ESI 值与欧洲食品安全局推荐的急性参考剂量 (Acute reference dose, ARfD) 进行比较，评价其安全性。ARfD 值指消费者在24 h或更短时间内从食物或饮水中摄取某种物质而对其健康无明显危害的估计量[19,23]。
急性膳食暴露评估采用两组数据进行评估，毒素浓度采用检出的最大值，第一组采用广西北部湾沿海居民每日P99 (去除1%的高值数据，第99%分位的贝肉食用量)贝肉消费量与居民平均体质量数据，第二组采用欧盟食品安全委员会评估毒素急性参考剂量指定的数据 (贝肉400 g，人体质量60 kg)。慢性膳食暴露评估采用毒素检出值的平均值，第一组贝肉消费量为日均消费量，第二组为每日P99贝肉消费量。
1.7 数据处理
描述性统计相关图形通过Origin 2021软件生成，采用IBM SPSS 26.0软件对毒素在贝类中的含量和季节性变化进行分析，显著性水平设置为0.05 (P<0.05)，所有实验均设置3个平行样 (n=3)。
2. 结果
2.1 脂溶性毒素检出率及含量
所采集的228份贝类样品中，203份来自钦州、北海、防城港，其余25份来自湛江、威海、广州；牡蛎样品均来自广西北部湾。189份样品检测到脂溶性贝类毒素，73份样品只检出1种毒素 (GYM)，116份样品检出2种及以上脂溶性贝类毒素。在检测的9种毒素中，检出了GYM、OA、DTX-2、Homo-YTX共4种毒素，其余5种均未检出。GYM尚无推荐参考值，OA、DTX-2、Homo-YTX检出的最高含量均低于欧盟规定的限量值 (OA、DTX-2的质量分数≤160 μg·kg−1，Homo-YTX的质量分数≤1 000 μg·kg−1) [9,24]。检测结果见表2，GYM全年检出率最高，在牡蛎、贻贝、蛤蜊中为100%，在栉江珧和扇贝中为60%。
表 2 贝中脂溶性贝类毒素检出率及含量Table 2. Detection rates and contents of lipophilic shellfish toxins in shellfish samples脂溶性贝类毒素
Lipophilic shellfish
toxin检出值范围
Detection range/
(μg·kg−1)平均检出值
Mean/
(μg·kg−1)检出率
Detection
rate/%环亚胺毒素
GYM0.12~105.54 33.1 83.02 螺环内酯毒素
SPX1ND ND ND 大田软海绵酸
OA0.34~31.39 7.97 51.16 鳍藻毒素1
DTX-1ND ND ND 鳍藻毒素2
DTX-20.29~38.19 7.65 40.91 原多甲藻酸1
AZA1ND ND ND 原多甲藻酸3
AZA3ND ND ND 虾夷扇贝毒素
YTXND ND ND Homo-虾夷扇贝毒素
Homo-YTX3.83~159.66 47.97 8.60 注：ND表示未检出。 Note: ND. Not detected. 2.2 脂溶性毒素的物种分布特征
如图1所示，检出的4种贝类毒素在6种贝类的分布中呈现明显的物种差异，GYM在贝类中的分布较为普遍，所有的牡蛎、蛤蜊、贻贝样品均有检出，75%的扇贝有检出。牡蛎样品中的质量分数相差较大。OA在6种贝类中的分布相似，检出率为46.15%~62.5%，其在牡蛎、贻贝、扇贝、平蛤蜊、栉江珧和蛏子检出的均值差值较小，分别为12.14、12.94、13.06、12.70、7.34和10.26 μg·kg−1。DTX-2在牡蛎和贻贝中的质量分数与其他贝类相比差异明显，在贻贝样品中检出的最高质量分数 (38.19 μg·kg−1) 是最低值 (0.39 μg·kg−1) 的近100倍，差异较大。Homo-YTX仅在扇贝和贻贝样品中检出。
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图 1 贝类样品中脂溶性贝类毒素质量分数Figure 1. Mass fractions of lipophilic shellfish toxins in different shellfish samples2.3 脂溶性毒素季节变化特征
贝类样品中的脂溶性贝类毒素含量呈现出明显的季节性变化 (图2)。秋冬季GYM的检出值普遍较高，而春夏季较低。春夏季，蛏子和栉江珧样品中GYM的检出值较低 (1.22~1.29 μg·kg−1)。秋季，牡蛎样品中GYM检出值最高 (70.22 μg·kg−1)，扇贝和贻贝样品也达到最大值。冬季，平蛤蜊、牡蛎、扇贝和贻贝样品中GYM的检出值与其他季节相比有显著性差异 (P<0.05)。
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图 2 不同季节脂溶性贝类毒素质量分数注：同一图中标有不同字母表示有显著性差异 (P<0.05)。Figure 2. Mass fractions of lipophilic shellfish toxins in shellfish in four seasonsNote: Different letters within the same figure indicate significant differences (P<0.05).春冬季样品中OA检出率及检出值较夏秋季的高。牡蛎、贻贝、扇贝、平蛤蜊、蛏子样品中OA检出值在冬季达到最高，分别为22.47、20.53、15.98、16.74、15.23 μg·kg−1。春冬季样品中，牡蛎中OA的检出率分别为83.33%和87.5%，栉江珧检出率均为50%。贻贝冬季样品中OA检出率为50%。冬季贝类样品中OA检出值与夏季样品有显著性差异 (P<0.05)。
秋冬季样品与春夏季样品中DTX-2检出值有显著性差异 (P<0.05)。春夏季样品中，除贻贝外，DTX-2的检出率均在20%以下。贻贝春季样品检出率为66.67%，检出均值为1.43 μg·kg−1。Homo-YTX仅在扇贝和贻贝样品中检出，夏秋季贻贝样品中Homo-YTX的检出率为66%，检出均值分别为15.98、50.92 μg·kg−1。扇贝只在秋季样品检出Homo-YTX，检出最高值为159.66 μg·kg−1。
2.4 广西北部湾沿海居民膳食中贝类摄入量
分别于2021年8月和10月对广西北部湾沿海钦州、北海、防城港3市共450户家庭，合计 1 204位常住成年居民的膳食开展问卷调查，年龄介于18~60岁，其中男性占比52%，女性占比48%。
调查结果显示，所调查居民的平均体质量为54.5 kg，海产品日均消费量为122 g，其中贝类消费占比为36.9% (图3)，所食贝类种类及食用量如图4所示。广西北部湾沿海居民所食贝类品种主要为牡蛎、扇贝、贻贝、蛏子、栉江珧和平蛤蜊，牡蛎肉消费量为15.3 g·d−1，位列该地区居民所食贝类的首位。居民日均贝肉消费量为45 g，居民日贝肉P99 (将居民每日贝肉消费量从低到高排序，第99分位的消费量即为P99值) 的消费量为205 g。
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图 3 广西北部湾沿海居民海产品摄入种类分布Figure 3. Distribution of seafood species intook by residents in Beibu Gulf in Gangxi Province![]()
图 4 广西北部湾沿海居民贝肉日均消费量Figure 4. Mean daily shellfish meat consumption of residents in Beibu Gulf in Guangxi Province2.5 居民脂溶性贝类毒素暴露风险评估
在国标GB 2733—2015中，采用小鼠生物测试法限定了水产品中麻痹性毒素 (Paralytic shellfish poisoning, PSP)、腹泻性毒素 (Diarrhetic shellfish poisoning, DSP) 的限量值 (PSP≤4 MU·g−1, DSP≤0.05 MU·g−1)，并于2016年颁布了腹泻性贝类毒素的检测方法 (GB 5009.212—2016)，但目前对贝类中的毒素浓度尚无具体的参考值。在食品安全评估时往往参考欧洲食品安全委员会对脂溶性贝类毒素的监管限量和急性暴露参考值。部分参考值如表3所示。
表 3 脂溶性贝类毒素的毒性等效因子与急性参考值Table 3. Toxic equivalent factors and ARfD of some shellfish toxins急性暴露风险评估结果如表4所示，第一组评估数据以本地居民膳食调查得到的贝肉消费量和人体质量估算，OA组毒素ESI值为0.26 μg·(kg·d)−1，小于欧盟规定的ARfD值 [0.3 μg·(kg·d)−1)]。第二组ESI值以欧盟提供的贝肉消费量和人体质量数据 (400 g, 60 kg) 估算，OA组毒素ESI值为0.34 μg·(kg·d)−1，超过欧盟规定的ARfD值，这些评估结果表明虽然贝肉中OA含量较低，但由于该地区居民贝类食用量大，一定程度上存在OA组贝类毒素的膳食暴露风险。YTXs的两组ESI值 [0.60、1.06 μg·(kg·d)−1]远低于欧盟规定的ARfD值 [25 μg·(kg·d)−1]，说明目前该地区居民YTXs毒素暴露风险较低。
表 4 广西北部湾沿海居民脂溶性贝类毒素急性暴露评估Table 4. Acute dietary exposure to some shellfish toxins of residents in Beibu Gulf in Guangxi Province毒素
Toxin贝肉日P99消费量
P99 daily shellfish
consumption/g毒素检出的最大值
Maximum toxin detection
value/(μg·kg−1)每日摄入量
ESI/[μg·(kg·d)−1]急性参考剂量
ARfD/[μg·(kg·d)−1]第一组
First group第二组
Second group大田软海绵酸
OA205 31.39 0.26 0.34 0.3 38.19 虾夷扇贝毒素
YTX159.66 0.60 1.06 25 慢性暴露风险分别以贝肉的日均消耗量和P99消费量计算，毒素含量采用平均值，结果如表5所示。慢性接触剂量为急性接触剂量的3%~4%，评估值可为慢性暴露极限值提供参考。
表 5 广西北部湾沿海居民脂溶性贝类毒素慢性暴露评估Table 5. Chronic dietary exposure to some shellfish toxins of residents in Beibu Gulf in Guangxi Province毒素
Toxin贝肉日均消费
Daily shellfish
consumption/g毒素检出的均值
Mean toxin detection
value/(μg·kg−1)贝肉日P99消费量
P99 daily shellfish
consumption/g每日摄入量
ESI/[μg·(kg·d)−1]第一组
First group第二组
Second group大田软海绵酸
OA45 7.97 205 6.58×10−3 0.03 鳍藻毒素2
DTX-27.65 3.79×10−3 0.017 Homo-虾夷扇贝毒素
Homo-YTX47.97 0.04 0.18 3. 讨论
脂溶性毒素污染存在明显的物种差异。本研究结果显示，牡蛎、贻贝和扇贝比其他贝类更易沾染毒素，且毒素水平较高。不同物种对毒素的蓄积有明显差异。GYM在所有贝类中均有检出，检出率最高。根据对广西北部湾沿海海域为期1年的毒素监测，发现GYM类毒素的全年检出率为46.6%，且在牡蛎中的检出率最高 (92%)[13]。中国南海、东海和渤海的贝类样本中均检测出GYM[16,26-29]，说明贝类中GYM污染在我国已十分普遍。OA和DTX-2易在牡蛎和贻贝中蓄积，Homo-YTX仅在扇贝和贻贝样品中检出。不同贝类蓄积毒素的差异与其规格、解毒率和生物转化率密切相关[30-32]，不同贝类摄食时的最大过滤速率不同也是可能原因之一[8,33]。
季节变化对贝类脂溶性毒素含量影响显著。秋冬季贝类样品中GYM含量普遍较高，春夏季较低。牡蛎、扇贝和贻贝中GYM含量最高的均为秋季样品。春冬季样品OA检出率及检出值较夏秋季样品高，最高含量出现在冬季样品中。冬季样品中DTX-2检出率和检出值均较其他季节高。仅在夏秋季贻贝样品和秋季扇贝中可检出Homo-YTX。不同季节水温、光照等环境因素的变化会影响贝类中脂质代谢相关酶的活性从而影响其对毒素的代谢速率[33-36]。有研究发现，钦州湾地区香港牡蛎(C. hongkongensis) 中脂溶性贝类毒素在冬季检出含量最高，海水中毒素在夏季检出含量最高，说明牡蛎中的毒素含量较海水有延迟[11]。
广西北部湾沿海市售贝类脂溶性毒素含量低于欧盟标准，但当地居民存在OA毒素暴露风险。膳食调查结果显示，广西北部湾沿海居民膳食中贝肉的日均消费量高于其他地区，牡蛎为消费量最大的贝类。贝肉日均消费量是深圳市居民 (4.5 g) [17]的10倍，这与该地区特殊的地理位置及丰富的贝类资源有关。以本地居民贝肉消费量和人体质量数据估算的OA组毒素ESI值，小于欧盟规定的ARfD值，但是以欧盟提供的贝肉消费量和人体质量数据估算，OA组毒素ESI值超过欧盟规定的ARfD值。这些评估结果说明，虽然贝肉中OA含量较低，但由于该地区居民贝类消费量大，一定程度上存在OA组贝类毒素膳食暴露风险。无论以本地膳食调查数据还是以欧盟提供的参考数据估算YTXs的ESI值，均远低于欧盟规定的ARfD值，说明目前该地区居民YTXs毒素暴露风险较低。本研究检测到广泛存在的GYM毒素，最初于新西兰采集的牡蛎 (Tiostrea chilensis) 中发现，由于缺乏GYM相关毒理研究数据[2,10]，目前国内外尚未对其检出限量作出规定，故无法对其暴露风险进行分析。
急性膳食风险评估适用于短时间内的高消耗量情况。研究表明，长期接触环亚胺类毒素会对人脑造成不利影响，如记忆衰退等[10,37-38]。故长期食用含有低水平脂溶性贝类毒素的贝肉带来的慢性健康风险是一个不可忽视的问题。本研究提供的广西北部湾沿海城市居民脂溶性贝类毒素慢性暴露水平，为今后慢性暴露极限值的建立提供了有益的探索。
牡蛎和贻贝中脂溶性毒素检出率及检出值较高，说明这两种贝类更易沾染并蓄积毒素，因此对牡蛎和贻贝的食用安全性风险评估更为迫切。脂溶性贝类毒素有多种结构类似物或代谢物，本研究未对所有毒素进行检测，贝类毒素含量和食用风险可能被低估，因此应进一步开展对脂溶性贝类毒素衍生物的研究。此外，本研究分析的样品为去壳后的全肉，没有对不同组织进行分离，有研究发现贻贝消化腺中的毒素含量是其他组织中的5~10倍，扇贝消化腺中的毒素含量也远高于肌肉[39]。因此为降低毒素暴露风险，不同组织对毒素的蓄积情况也需进一步研究。同时，建议消费者尽可能不食用贝类消化腺。
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图 2 梭鲈ho1基因PCR扩增产物电泳图
Figure 2. Electrophoresis of PCR products of ho1 in S. lucioperca
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图 3 梭鲈ho1基因cDNA全长序列及推导的氨基酸序列
Figure 3. Nucleotide and predicted protein sequences of ho1 of S. lucioperca
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图 4 梭鲈与其他物种HO1氨基酸同源性比对
Figure 4. Multiple alignment of HO1 amino acid sequences between S. lucioperca and other species
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图 5 基于不同物种HO1氨基酸序列构建的系统发育进化树 (NJ法)
Figure 5. Phylogenetic tree based on HO1 amino acid sequences of different species (Neighbor-Joining method)
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图 6 梭鲈ho1在各组织的相对表达量
注：图中数值为“平均值±标准差”(N=3)，不同字母表示组间差异极显著(P<0.01)，后图同此。
Figure 6. Relative expression of ho1 in different tissues of S. lucioperca
Note: The values are "$ { {\overline X } \pm {\minifont \rm{SD}}}$" (N=3). Different letters indicate extremely significant differences among the tissues (P<0.01). The same below.
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图 7 急性低氧胁迫与常氧恢复下梭鲈ho1在组织中表达变化
Figure 7. Expression of ho1 in S. lucioperca under acute hypoxia stress and normoxia recovery
表 1 引物序列
Table 1 Primers used in this study
基因
Gene目的
Purpose引物
Primer引物序列 (5'—3')
Primer sequence (5'–3')退火温度
Annealing temperature/℃ho1 ORF扩增 ho1-F1 GGAGCCAGAGAAGAAGACTCAG 59.8 ho1-R1 TGCAGCTCGTTTTCAGTGAC 60.2 ho1 RACE扩增 5'GSP ACACCGGGGAAGGCGAAGAATGAC 72.0 5'nGSP CACTGGGGTGGTTGGAGTTCCTGTC 70.9 3'GSP GAGGGCAGGTCCTGGGTCGAATC 71.2 3'nGSP ATGGGGCTAAAGGGCAGCGAAGGTC 73.2 ho1 RT-PCR ho1-F1 CTGTGCTCGCTGTATGAGGT 59.1 ho1-R1 CCAGTCCTGGCCATAGAAGT 59.2 gapdh RT-PCR gapdh1-F ATGTTCGTCATGGGCGTCAA 60.0 gapdh1-R CAGGCCCTCAATGATGACGA 60.0 
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[1] PO L K, YUAN W S, WOEI L J, et al. Hypoxia causes transgenerational impairment of ovarian development and hatching success in fish[J]. Environ Sci Technol, 2019, 53(7): 3917-3928. doi: 10.1021/acs.est.8b07250
[2] MAGNONI L J, EDING E, LEGUEN I, et al. Hypoxia, but not an electrolyte-imbalanced diet, reduces feed intake, growth and oxygen consumption in rainbow trout (Oncorhynchus mykiss)[J]. Sci Rep, 2018, 8(1): 4965. doi: 10.1038/s41598-018-23352-z
[3] NADINE S, JAN M, ALEXANDER R, et al. Effects of chronic hypoxia on the immune status of pikeperch (Sander lucioperca Linnaeus, 1758)[J]. Biology, 2021, 10(7): 649. doi: 10.3390/biology10070649
[4] XIAO W H. The hypoxia signaling pathway and hypoxic adaptation in fishes[J]. Sci China Life Sci, 2015, 58(2): 148-155. doi: 10.1007/s11427-015-4801-z
[5] GOZZELINO R, JENEY V, SOARES M P. Mechanisms of cell protection by heme oxygenase-1[J]. Annu Rev Pharmacol, 2010, 50(1): 323-354. doi: 10.1146/annurev.pharmtox.010909.105600
[6] 陶文庭, 王琳琳, 侯少丰, 等. 斑马鱼HO1基因的表达特征及功能研究[J]. 水生生物学报, 2014, 38(2): 209-215. doi: 10.7541/2014.31 [7] PREVOT A N, PIERRE S, GAILLARD S, et al. cDNA sequencing and expression analysis of Dicentrarchus labrax heme oxygenase-1[J]. Cell Mol Biol, 2008, 54: 1046-1054.
[8] XIE J, HE X, FANG H, et al. Identification of heme oxygenase-1 from golden pompano (Trachinotus ovatus) and response of Nrf2/HO-1 signaling pathway to copper-induced oxidative stress[J]. Chemosphere, 2020, 253: 126654. doi: 10.1016/j.chemosphere.2020.126654
[9] GUAN W Z, GUO D D, SUN Y W, et al. Characterization of duplicated heme oxygenase-1 genes and their responses to hypoxic stress in blunt snout bream (Megalobrama amblycephala)[J]. Fish Physiol Biochem, 2017, 43(2): 641-651. doi: 10.1007/s10695-016-0318-z
[10] RASHID I, BAISVAR V S, SINGH M, et al. Isolation and characterization of hypoxia inducible heme oxygenase 1 (HMOX1) gene in Labeo rohita[J]. Genomics, 2020, 112(3): 2327-2333. doi: 10.1016/j.ygeno.2020.01.004
[11] WANG D, ZHONG X P, QIAO Z X, et al. Inductive transcription and protective role of fish heme oxygenase-1 under hypoxic stress[J]. J Exp Biol, 2008, 211(16): 2700-2706. doi: 10.1242/jeb.019141
[12] JIN X, HAN Q, WANG H, et al. The effect of bimel on gill remodeling of goldfish (Carassius auratus) aquaculture[J]. Aquaculture, 2018, 500: 469-476.
[13] 李艳丽, 徐功玉, 肖金文, 等. 血红素加氧酶1在斑马鱼低氧应激中的保护作用研究[J]. 水生生物学报, 2017, 41(1): 43-49. doi: 10.7541/2017.6 [14] 韩迎雪, 林婉玲, 杨少玲, 等. 5种鲈形目淡水鱼肌肉脂肪酸及磷脂组成的研究[J]. 南方水产科学, 2019, 15(1): 85-92. doi: 10.12131/20180184 [15] SAISA M, SALMINEN M, KOLJONEN M L, et al. Coastal and freshwater pikeperch (Sander lucioperca) populations differ genetically in the baltic sea basin[J]. Hereditas, 2010, 147(5): 205-214. doi: 10.1111/j.1601-5223.2010.02184.x
[16] POLICAR T, MIROSLAV B, KRISTAN J, et al. Comparison of production efficiency and quality of differently cultured pikeperch (Sander lucioperca L.) juveniles as a valuable product for ongrowing culture[J]. Aquaculture, 2016, 24(6): 1607-1626.
[17] BAEKELANDT S, REDIVO B, MANDIKI S N M, et al. Multifactorial analyses revealed optimal aquaculture modalities improving husbandry fitness without clear effect on stress and immune status of pikeperch Sander lucioperca[J]. Gen Comp Endocrinol, 2018, 258: 194-204. doi: 10.1016/j.ygcen.2017.08.010
[18] LIVAK K J, SCHMITTGEN T D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2−ΔΔCT Method[J]. Methods, 2001, 25(4): 402-408. doi: 10.1006/meth.2001.1262
[19] MAHIN D, MAINES, PETER E M, et al. 30 some years of heme oxygenase: from a "molecular wrecking ball" to a "mesmerizing" trigger of cellular events[J]. Biochem Biophys Res Commun, 2005, 338(1): 568-577. doi: 10.1016/j.bbrc.2005.08.121
[20] LIN Q, SEBASTIAN W, YANG G, et al. Heme oxygenase-1 protein localizes to the nucleus and activates transcription factors important in oxidative stress[J]. J Biol Chem, 2007, 282(28): 20621-20633. doi: 10.1074/jbc.M607954200
[21] ZHANG X L, SUN Y W, CHEN J, et al. Gene duplication, conservation and divergence of heme oxygenase 2 genes in blunt snout bream (Megalobrama amblycephala) and their responses to hypoxia[J]. Gene, 2017, 610: 133-139. doi: 10.1016/j.gene.2017.02.017
[22] BAUER I, WANNER G A, RENSING H, et al. Expression pattern of heme oxygenase isoenzymes 1 and 2 in normal and stress-exposed rat liver[J]. Hepatology, 1998, 27(3): 829-838. doi: 10.1002/hep.510270327
[23] RYTER S W, ALAM J, CHOI A M K. Heme oxygenase-1/carbon monoxide: from basic science to the rapeutic applications[J]. Physiol Rev, 2006, 86(2): 583-650. doi: 10.1152/physrev.00011.2005
[24] LU Z J, ZHAN F B, YANG M X, et al. The immune function of heme oxygenase-1 from grass carp (Ctenopharyngodon idellus) in response to bacterial infection[J]. Fish Shellfish Immunol, 2021, 112: 168-178. doi: 10.1016/j.fsi.2020.08.050
[25] TZANEVA V, PERRY S F. Heme oxygenase-1 (HO-1) mediated respiratory responsesto hypoxia in the goldfish, Carassius auratus[J]. Resp Physiol Neurobi, 2014, 199: 1-8. doi: 10.1016/j.resp.2014.04.006
[26] LI C J, WANG T F, WANG G C, et al. Physicochemical changes in liver and Hsc70 expression in pikeperch Sander lucioperca under heat stress[J]. Ecotoxicol Environ Saf, 2019, 181: 130-137. doi: 10.1016/j.ecoenv.2019.05.083
[27] 陈付菊, 赵宇田, 付生云, 等. 溶解氧水平对青海湖裸鲤体肾组织结构及抗氧化酶活性的影响[J]. 水生生物学报, 2022, 46(5): 679-686. [28] 张美东, 凌晨, 沙航, 等. 低氧-复氧胁迫对鲢抗氧化酶活性及Cu/Zn-SOD和Mn-SOD基因表达的影响[J]. 水生生物学报, 2022, 46(4): 498-506. [29] MAR B B, FOLCO G, ALESSANDRO R, et al. Concurrent environmental stressors and jellyfish stings impair caged European sea bass (Dicentrarchus labrax) physiological performances[J]. Sci Rep, 2016, 6: 27929. doi: 10.1038/srep27929
[30] 陈世喜, 王鹏飞, 区又君, 等. 急性和慢性低氧胁迫对卵形鲳鲹鳃器官的影响[J]. 南方水产科学, 2017, 13(1): 124-130. doi: 10.3969/j.issn.2095-0780.2017.01.016 [31] 沈杰. 血红素氧合酶-1促AMPK/mTORC1的磷酸化上调自噬是铅暴露肾损伤减轻的重要机制[D]. 上海: 中国人民解放军海军军医大学, 2021: 60. [32] 彭钊. HO-1调控细胞自噬在DON致肝毒性中的作用及机制研究[D]. 武汉: 华中科技大学, 2020: 131. [33] MENG Z T, WANG L L, LIAO X X, et al. The protective effect of Heme oxygenase-1 on liver injury caused by DON-induced oxidative stress and cytotoxicity[J]. Toxins, 2021, 13(10): 732. doi: 10.3390/toxins13100732
[34] RUI L Y. Brain regulation of energy balance and body weight[J]. Rev Endocr Metab Dis, 2013, 14(4): 387-407. doi: 10.1007/s11154-013-9261-9
[35] 陈世喜, 王鹏飞, 区又君, 等. 急性和慢性低氧胁迫对卵形鲳鲹幼鱼肝组织损伤和抗氧化的影响[J]. 动物学杂志, 2016, 51(6): 1049-1058. [36] 郭志雄. 低氧环境对军曹鱼幼鱼生化指标、相关基因表达的影响及其转录组学分析[D]. 湛江: 广东海洋大学, 2020: 97. [37] 王慧娟. 低氧对团头鲂生理生化指标及低氧应答基因表达的影响[D]. 武汉: 华中农业大学, 2015: 62. -
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