Study on tributyrin enhancing anti periodic high temperature stress ability of gill tissue in Litopenaeus vannamei
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摘要:
在水产养殖中，周期性高温 (Periodic high temperature, PHT) 对虾类的生物学功能会产生显著影响。鳃作为虾类的呼吸和代谢器官，在维持体内渗透平衡方面具有关键作用，但其功能易受高温等环境变化的干扰。为了探究有效的对虾PHT应对策略，研究了三丁酸甘油酯 (Tributyrin, TB) 对PHT [(34±1) ℃, 7 d] 胁迫下凡纳滨对虾 (Litopenaeus vannamei) 鳃组织形态和生理功能的影响。结果表明，PHT胁迫导致了显著的鳃组织损伤，诱导了氧化应激反应，进而造成内质网应激、细胞凋亡以及渗透调节功能障碍。不同饲喂策略下 (胁迫前饲喂三丁酸甘油酯7 d；每天饲喂三丁酸甘油酯；胁迫后饲喂三丁酸甘油酯7 d)，鳃组织损伤程度均显著减轻，同时氧化应激水平降低。此外，三丁酸甘油酯还正向调节了PHT诱导的氧化应激、内质网应激、细胞凋亡以及渗透调节基因的相对表达水平。尤其是每天饲喂三丁酸甘油酯能够有效保持鳃组织形态完整和生理功能稳定。
Abstract:Periodic high temperature (PHT) has a significant effect on biological function of shrimps in aquaculture. Gill, as the respiratory and metabolic organ of shrimp, plays a key role in maintaining the osmotic balance in fish body. However, its function is easily disturbed by environmental changes such as high temperature. In order to investigate effective strategies against PHT in shrimp, we investigated the effects of tributyrin (TB) on the morphology and physiological function of gill tissue of Litopenaeus vannamei under PHT [(34±1) ℃, 7 d] stress. The results show that PHT stress caused significant gill tissue damage and induced oxidative stress, which in turn caused endoplasmic reticulum stress, apoptosis and osmotic regulation dysfunction. With different feeding strategies (Feeding tributyrin for 7 d before stress, feeding tributyrin every day including 7 stressed days, and feeding tributyrin for 7 d after stress), the degree of gill tissue damage decreased significantly, so did the level of oxidative stress. In addition, tributyrin positively regulated the relative expression levels of oxidative stress, endoplasmic reticulum stress, apoptosis and osmoregulation genes which were induced by PHT. In particular, daily feeding tributyrin was effective in maintaining the morphological integrity of gill tissues and stable physiological functions.
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Keywords:
- Litopenaeus vannamei /
- Tributyrin /
- Periodic high temperature /
- Gill /
- Histologic changes /
- Physiological function
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凡纳滨对虾 (Litopenaeus vannamei) 又称南美白对虾，是我国及世界范围内最重要的对虾经济品种之一。我国高密度集约化的养殖方式导致对虾易受环境因子影响。温度作为重要的环境因子，可以直接影响对虾新陈代谢、耗氧、生长和存活[1]。研究表明，凡纳滨对虾适宜的生长温度为23~30 ℃[2]，适宜的生存温度为18~32 ℃[3]。水温高于适宜生存温度会导致对虾的氧化应激损伤，进一步破坏组织结构完整性，影响对虾的渗透调节、免疫防御等功能[4-6]；此外，高温会增强环境中其他因子对对虾的毒性，如氨氮和藻类毒性[7-8]。近年来，全球变暖引起极端高温频繁发生。亚热带气候地区夏季水温常达到34 oC以上，远超凡纳滨对虾适宜生长温度[9]。区域性长期或短期高温通过诱导病害引发养殖对虾大规模死亡，制约我国对虾养殖业的可持续健康发展，因此，了解高温对对虾的影响机制对提高其抗高温能力的研究具有重要意义。
鳃是对虾重要的呼吸和代谢器官，负责气体交换和维持离子平衡。高温应激造成的组织损伤会影响鳃组织气体交换和渗透调节功能，进而导致机体缺氧，离子交换紊乱[5]。当环境温度升高时，鳃组织首先降低能量消耗，随着应激持续，能量需求也逐渐升高。鳃组织中ATP相关酶的活性增加，同时耗氧量增加[10-12]；此外，高温还会影响抗氧化基因的表达水平，进一步诱导鳃组织产生氧化应激反应[7]。在持续高温条件下保持鳃组织的生理功能，对对虾健康非常重要，但目前关于提高对虾机体对高温胁迫的拮抗能力及改善机体和组织生理功能的方法研究较少。
三丁酸甘油酯 (Tributyrin, TB) 是一种典型的短链脂肪酸衍生物，其稳定的物理性质和良好的口服耐受性为饲料加工提供了适宜条件[13]。研究表明，饲料中添加三丁酸甘油酯可以增强机体对环境胁迫的抵抗能力，例如缓解荷斯坦奶牛热应激所致的肝肾损伤进而提高生产性能[14]，增强凡纳滨对虾的缺氧耐受性[15]；此外，三丁酸甘油酯具有提高免疫能力、增强缺氧耐受性和提高抗病能力的功能[16-18]。然而，三丁酸甘油酯能否提高对虾鳃组织对高温的抵抗力尚不清楚。
因此，本研究探究了投喂三丁酸甘油酯是否可以提高凡纳滨对虾鳃组织应对周期性高温 (Periodic high temperature, PHT) 胁迫的能力，以及不同三丁酸甘油酯投喂策略是否会产生不同的效果等问题，进一步探讨降低凡纳滨对虾鳃PHT胁迫的最佳饲喂策略。
1. 材料与方法
1.1 实验材料
实验用凡纳滨对虾取自中国水产科学研究院南海水产研究所深圳试验基地，平均体质量为 (6.3±0.2) g。实验前于15个200 L玻璃纤维桶中暂养7 d，每桶40尾。养殖水温 (30±1) ℃、盐度30‰，pH 7.8~8.0，24 h连续曝气。每天换水50%，并按对虾体质量5%投喂对虾配合饲料 (广东越群生物科技股份有限公司)。
1.2 饲料配制
将健康对虾随机分为5组，每组3个平行，每个平行池40尾对虾。配制2种饲料 (0 g·kg−1 三丁酸甘油酯基础饲料和2.0 g·kg−1三丁酸甘油酯饲料)。三丁酸甘油酯购自广东省油脂科学与应用工程研究中心，其添加量参照文献[19-20]。日粮制备方法参照Duan等[21]的研究。实验饲料的配方和组成见表1。实验饲料使用前均在 −20 ℃保存。实验日粮中的水分、粗蛋白质、粗脂肪和灰分采用分析化学家官方协会 (1995) 的标准方法测定。
表 1 实验饲料配方Table 1. Experimental feed formulation成分 (干物质)
Ingredient (Dry mass)三丁酸甘油酯添加水平
Addition amount of tributyrin/
(g∙kg−1)0 2.0 鱼粉 White fish meal 250 250 豆粕 Soybean meal 180 180 花生麸 Peanut bran 164 164 面粉 Wheat flour 230 222 啤酒酵母 Beer yeast 50 50 磷虾粉 Krill meal 50 50 大豆卵磷脂 Soybean lecithin 10 10 鱼油 Fish oil 10 10 豆油 Soybean oil 10 10 氯化胆碱 Choline chloride (50%) 5 5 磷酸二氢钙 Ca(H2PO4)2 10 10 维 C-磷酸酯 VC-phosphate ester 1 1 维生素预混料 Vitamin premix① 10 10 矿物质预混料 Mineral premix② 10 10 海藻酸钠 Sodium alginate 10 10 三丁酸甘油酯 Tributyrin 0 2 总计 Total 1 000 1 000 营养成分 Nutritional composition③ 粗蛋白 Crude protein 398.7 399.1 粗脂肪 Lipid 72.6 72.9 灰分 Ash 120.3 120.7 水分 Moisture 105.2 105.7 注：三丁酸甘油酯添加量参照 Su等[19]和 Wang等[20]的研究。 ① 维生素预混料 (g∙kg−1)：醋酸维甲酸酯 2.5；胆钙化醇 6.25；all-rac-生育酚乙酸酯 75；甲萘醌 2.5；硫胺素 0.25；核黄素 1；D-泛酸钙 5；吡哆醇 HCl 0.75；氰钴胺 2.5；烟酸 2.5；叶酸 0.25；生物素 2.5；肌醇 379；纤维素 500。② 矿物质预混料 (g∙kg−1)：氯化钾90；碘化钾 0.04；氯化钠 40；五水合硫酸铜3；七水硫酸锌4；七水硫酸钴0.02；七水硫酸亚铁20；一水硫酸锰3；七水硫酸镁124；二水合磷酸氢钙500；碳酸钙 215。③ 测量值 (g∙kg−1)。 Note: The addition amount of tributyrin is based on the research of Su, et al[19] and Wang, et al[20]. ① Vitamin premix (g∙kg−1): Retinoate acetate 2.5; Cholecalciferol 6.25; All rac tocopherol acetate 75; Methyl naphthoquinone 2.5; Thiamine 0.25; Riboflavin 1; D-calcium pantothenate 5; Pyridoxine HCl 0.75; Cyanocobalamine 2.5; Niacin 2.5; Folic acid 0.25; Biotin 2.5; Inositol 379; Cellulose 500. ② Minerals (g∙kg−1) premix: KCl 90; KI 0.04; NaCl 40; CuSO4-5H2O 3; ZnSO4-7H2O 4; CoSO4-7H2O 0.02; FeSO4-7H2O 20; MnSO4-H2O 3; MgSO4-7H2O 124; CaHPO4-2H2O 500; CaCO3 215. ③ Measured value (g∙kg−1). 1.3 实验设计
5个实验组分别为阴性对照组 (N组)、阳性对照组 (P组)、D1、D2和D3组 (图1)。N组水温在第0—第21天维持室温 (30±1) ℃，P、D1、D2和D3组水温在第1—第7天和第15—第21天维持室温，在第8—第14天利用加热棒实现PHT胁迫 (34±1) ℃。每天早上7:30开始，水温以1 oC·h−1的速率从 (30±1) oC升至 (34±1) ℃，并维持至16:30，随后自然下降至 (30±1) ℃。N和P组对虾饲喂0 g·kg−1三丁酸甘油酯饲料21 d，D1、D2和D3组分别在PHT胁迫前 (第1—第7天)、整个实验期间 (第1—第21天) 和PHT胁迫后 (第15—第21天) 饲喂2.0 g·kg−1三丁酸甘油酯饲料。
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图 1 本研究实验设计示意图注：N. 阴性对照组；P. PHT胁迫阳性对照组；D1. 三丁酸甘油酯胁迫前投喂组；D2. 三丁酸甘油酯每天投喂组；D3. 三丁酸甘油酯胁迫后投喂组。Figure 1. Sketch map of experimental design of this studyNote: N. Negative control group; P. PHT stress positive control group; D1. Feeding tributyrin before PHT stress group; D2. Feeding tributyrin every day group; D3. Feeding tributyrin after PHT stress group.1.4 样品采集
实验采样于第22天进行。每个平行取3尾对虾的鳃组织，4% (φ)多聚甲醛中保存，进行组织病理学检查。每个平行取10尾对虾的鳃组织，−80 ℃保存，测定生化指标。每个平行取5尾对虾的鳃组织，保存于RNA保护液 (苏州NCM Biotech) 中用于基因表达水平分析。
1.5 鳃组织结构形态分析
鳃组织固定24 h后，转移至70% (φ)乙醇溶液中过夜。然后用不同体积分数的乙醇溶液 (80%、90%和100%) 对组织进行梯度脱水，经二甲苯透明后用石蜡包埋。使用切片机制作4 μm的切片，然后用苏木精和伊红 (HE) 染料进行染色，在光学显微镜下观察鳃组织结构形态变化，并拍照记录。
1.6 生化指标测定
将冷冻保存的鳃组织样品冰上解冻后，使用预冷PBS漂洗去除组织液，滤纸拭干后称质量。使用组织匀浆机低温研磨，每组3个重复按照m (组织)∶m (PBS)=1∶9制备组织匀浆，4 ℃、3 000 r·min−1离心10 min，取上清液于−80 ℃保存，用于生化指标测定。
超氧化物歧化酶 (SOD)、总抗氧化能力 (T-AOC)、过氧化物酶 (POD)、脂质过氧化物(LPO)、超氧阴离子 (·O2 −)、丙二醛 (MDA) 和总蛋白含量 (TP) 均采用南京建成生物工程研究所同一批次生产的试剂盒进行测定，具体操作按照相应的说明书进行。
1.7 基因表达分析
利用Trizol试剂提取各组对虾鳃组织RNA，使用DNase I去除其中的基因组DNA，然后分别使用核酸定量仪和1.0% (w) 琼脂糖凝胶电泳检测RNA的质量和浓度。使用Servicebio®RT First Strand cDNA Synthesis Kit将RNA反转录为cDNA，保存于 −20 ℃备用。
根据NCBI数据库中的凡纳滨对虾活性氧调节剂1 (ROMO1)、过氧化氢酶 (CAT)、SOD、谷胱甘肽过氧化物酶 (GPX)、硫氧还蛋白 (TRX)、半胱氨酸蛋白酶3 (CASP3)、Na+-K+转运ATP酶亚基α (NKAα)、Na+-K+ 转运ATP酶亚基β (NKAβ)、环磷酸腺苷依赖性转录因子ATF6α (ATF6)、苏氨酸蛋白激酶内切核糖核酸酶 (IRE1)、水通道蛋白 (AQP)、水通道蛋白TIP4 (TIP4)、真核起始因子2 (EIF2α)、细胞色素氧化酶 (CYTC)、P53蛋白 (P53) 基因的cDNA序列，以β-actin为内参基因，使用Primer premier 5.0软件分别设计正反特异性引物 (表2)。
表 2 本研究所用引物序列Table 2. Primer sequences used in this study基因名称
Gene name正向引物(5'—3')
Forward primer (5'–3')反向引物(5'—3')
Reverse primer (5'–3')β-actin AGCTCATTGTAGAAGGTGTGATGCC TCCTGACCCTGAAGTACCCCATTG ROMO1 GCACCGTGGAGTAGGAGAACAAC TTGCCATGCCGACTGAGAAACC CAT TGATCGCTACAACAGTGCTGATGAG ATGTTCTCCACCAAACGCTGACG SOD GACACGACCATTAGCCTGTACGAC GTTGCCAGTAGCGAGTGAACCTTC GPX CGGCGAGATGGTGTCGTTCAAG GAGTTGGTTCATCTGGTGGAAGTCC TRX TCATCAATCAGCCGCATACCATCG CACCTTCTAAGTCCTTGGGAGATAACG ATF6 AGCAACACATCACGGACATCATCAG GTGGGAAACTGGGCTTTGTTAGGG IRE1 CCAGCACGACATCCAGTTCTTCC CCTCCGCAGCAAACACCTTCTC EIF2α ATCACCCATCTCCTCACCACAGAC AGCCTTCCATCTACCCTCCACTG CYTC TCGACGTGTACCTGACCAACCC TTCGCCTGGCTTCCTCTTCCTC CASP3 ATTATAGAGTGCCTGCGTTGCTACC TGCGATATCATGCCTAGATGCTTGG P53 CGCCGCCAAGGAAGTGAAGG TGGGAGGCGATGGTGGTGTC TIP4 GTCTCTCTGAACCCTTGCCAAACTC GTTGCCTATGATTACCTGCGTCCTC AQP GCAGCCATCTTGAAGGGAGTGAC ACGAGGACGAAGGTGATGAGGAG NKAα TGAAATCGTGTTTGCCCGTACCTC ACCATCACCAGTTACAGCCACAATG NKAβ GAACCCAGCCGACGAAGAATACG CAGCAACAATAGGTGGCAGGTAGC 利用实时荧光定量PCR对各组上述几种基因的表达量进行检测，每个样品3个重复，相关操作使用SYBR荧光定量PCR试剂盒 (AG) 进行。PCR反应体系为15 μL，包括SYBR Green Pro Taq HS Premix (2 ×) 7.5 μL，10 μmol·L−1正反向引物各0.6 μL，cDNA 1.0 μL，无RNase水5.3 μL。PCR反应程序为：95 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，40个循环。各组每个基因的相对表达量以N组为基准采用2−ΔΔCT法计算。
1.8 数据分析
所有数据均以“平均值±标准差 ($\overline { x}\pm s $)”表示 (n=3)，并使用SPSS 26.0软件对各组数据进行单因素方差分析，采用最小显著差数 (Least significant difference, LSD) 法检验组内及组间的显著性差异，显著性水平α为0.05。
2. 结果
2.1 组织形态变化
N组的对虾鳃组织结构完整，鳃丝排列整齐 (图2)，相较之，P组鳃丝排列紊乱，出现血管变形或溶解的现象。与P组相比，三丁酸甘油酯添加组 (D1、D2、D3组) 鳃组织损伤较少，其中D2组鳃组织结构完整且排列整齐，D1和D3组有少量上皮细胞脱落和血细胞增加。
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图 2 三丁酸甘油酯对周期性高温胁迫下凡纳滨对虾鳃组织学形态的影响 (200×)注：a. 阴性对照组 (N)；b. PHT胁迫阳性对照组 (P)；c. 胁迫前投喂组 (D1)；d. 每天投喂组(D2)；e. 胁迫后投喂组 (D3)。Figure 2. Effects of dietary tributyrin on histological morphology of L. vannamei under periodic high-temperatures stress (200×)Note: a. Negative control group (N); b. PHT stress positive control group (P); c. Feeding before PHT stress group (D1); d. Feeding every day group (D2); e. Feeding after PHT stress group (D3).2.2 氧化应激相关生理指标变化
对虾抗氧化应激能力受PHT显著影响。与N组相比，P组的 ·O2 − 活性和LPO质量摩尔浓度显著升高 (P<0.05)，MDA含量、T-AOC、SOD活性呈上升趋势，但差异不显著 (P>0.05)，SOD活性显著降低 (P<0.05) (图3)。三丁酸甘油酯对氧化应激能力有调节作用。与P组相比，三丁酸甘油酯添加组的T-AOC、·O2 − 活性和LPO、MDA含量均呈下降趋势，SOD活性呈上升趋势，其中D2组的LPO质量摩尔浓度和D3组的SOD活性差异显著 (P<0.05)；D1和D2组的SOD活性呈下降趋势，D3组的则呈上升趋势，但差异不显著 (P>0.05)。
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图 3 三丁酸甘油酯对周期性高温胁迫下凡纳滨对虾鳃组织氧化应激指标的影响注：数据上标不同字母表示组间差异显著 (P<0.05)。Figure 3. Effects of dietary tributyrin on antioxidant capacity of L. vannamei under periodic high-temperature stressNote: Different letters on each bar represent significant differences (P<0.05).2.3 氧化应激基因表达水平变化
氧化应激基因表达水平与抗氧化酶活性变化有类似趋势。与N组相比，P组的ROMO1、CAT、SOD、GPX、TRX基因相对表达水平均显著升高 (P<0.05) (图4-a)。与P组相比，三丁酸甘油酯添加组的ROMO1、CAT、SOD、GPX、TRX基因相对表达水平均呈下降趋势，其中CAT和SOD基因在各三丁酸甘油酯添加组均差异显著，GPX和TRX基因在D2组差异显著 (P<0.05)。
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图 4 三丁酸甘油酯对周期性高温胁迫下凡纳滨对虾鳃组织氧化应激、内质网应激、细胞凋亡和渗透调节基因表达水平的影响注：数据上标不同字母表示组间差异显著 (P<0.05)。Figure 4. Effects of dietary tributyrin on oxidative stress, endoplasmic reticulum stress, apoptosis and osmoregulation gene expression levels in gill tissues of L. vannamei under periodic high-temperature stressNote: Different letters on each bar represent significant differences (P<0.05).2.4 鳃组织内质网应激相关基因表达水平变化
本研究进一步分析了内质网应激基因相对表达水平的变化 (图4-b)。PHT显著诱导内质网应激基因表达。与N组相比，P组的ATF6α、IRE1和EIF2α基因的相对表达水平均显著升高(P<0.05)。表明三丁酸甘油酯有稳定内质网应激基因表达水平的作用。与P组相比，三丁酸甘油酯添加组IRE1基因的相对表达水平显著降低 (P<0.05)，EIF2α基因的则有降低的趋势，但仅在D2组差异显著 (P<0.05)。ATF6基因相对表达水平在D2和D3组有降低的趋势，在D1组有升高的趋势，但差异均不显著 (P>0.05)。
2.5 细胞凋亡基因表达水平变化
细胞凋亡基因同样受PHT和三丁酸甘油酯的影响。与对照组相比，P组CYTC、CASP3和P53基因的相对表达水平均显著升高 (P<0.05) (图4-c)。与P组相比，三丁酸甘油酯添加组CYTC和CASP3基因的相对表达水平均有降低的趋势，其中D2组CYTC和CASP3基因、D3组CASP3基因均差异显著 (P<0.05)。P53基因的相对表达水平在D1和D2组有降低的趋势，在D3组有升高的趋势，但差异均不显著 (P>0.05)。
2.6 渗透调节基因表达水平变化
PHT影响鳃组织离子转运平衡。与N组相比，P组渗透调节相关基因如NKAα、TIP4和AQP基因的相对表达水平均显著上升，NKAβ基因的相对表达水平显著降低 (P<0.05) (图4-d)。三丁酸甘油酯对渗透调节稳态有一定的调节效果。与P组相比，三丁酸甘油酯添加组NKAα和TIP4基因的相对表达水平均呈降低趋势，其中D2组NKAα和TIP4基因、D1组TIP4基因差异显著 (P<0.05)。NKAβ和AQP基因的相对表达水平在D2组显著降低 (P<0.05)，但在D3组显著升高 (P<0.05)。在D1组，NKAβ基因的相对表达水平显著升高 (P<0.05)，AQP基因则呈下降趋势但差异不显著 (P>0.05)。
3. 讨论
气候变化导致的高温是水生生物最主要的应激源之一，对其生理和生化特征产生广泛影响[22-24]。具体而言，鳃作为关键的呼吸和代谢器官，受到热应激的影响，引起鳃损伤、呼吸功能下降，甚至导致神经系统缺氧和生物死亡[25-26]。这是由于热应激引起的氧化应激，导致氧自由基和活性氧物 (Reactive oxygen species, ROS) 的过度积累，进而引起了脂质、蛋白质和DNA损伤[27-28]。本研究中，PHT胁迫影响了凡纳滨对虾鳃组织结构和氧化应激平衡，造成鳃血管变形，鳃丝结构紊乱，以及抗氧化指标如 ·O2 −、LPO和POD的显著变化。这验证了PHT胁迫对凡纳滨对虾鳃组织的不利影响。
笔者早期研究发现，饲料中添加丁酸梭菌(Clostridium butyricum)可以改善高温应激下日本对虾 (Marsupenaeus japonicus)的生长性能[29]。丁酸梭菌是一种有益菌，通过产生丁酸为肠道黏膜提供能量，促进肠上皮组织细胞的再生与修复[30]。本研究发现三丁酸甘油酯对改善鳃组织形态和减少上皮细胞溶解具有积极作用。这是因为三丁酸甘油酯是丁酸的衍生物，口服后可以到达各组织黏膜并发挥修复作用[1]。三丁酸甘油酯在其他研究中也被发现具有修复作用，尤其在缓解小鼠 (Mus musculus) 肺水肿和减少炎症介质方面表现显著[31]。氧化还原系统在对虾应对环境应激过程中起着重要作用，包括抗氧化酶和非酶物质。其中ROMO1可诱导生物体产生ROS[32]。CAT、SOD、POD和GPX是常见的抗氧化酶[33-34]。TRX可以减少过氧化物蛋白[35]。本研究还发现，饲喂三丁酸甘油酯通过调节CAT、SOD、POD、GPX和TRX等基因的表达，减缓氧化应激过程。这表明三丁酸甘油酯能够缓解PHT胁迫对凡纳滨对虾组织形态和生理功能的不利影响。值得注意的是，并非所有氧化应激指标都对三丁酸甘油酯表现出相同的敏感性。T-AOC和MDA等指标似乎在PHT胁迫和三丁酸甘油酯饲喂条件下表现不敏感，仍需要更深入的研究。尽管三丁酸甘油酯在不同饲喂策略下均表现出一定的抗高温作用，但在实际养殖中，除了效果还需要考虑经济成本。对于最适合的饲喂策略，仍需要进一步研究。
为明确最佳的三丁酸甘油酯饲喂策略，本研究从内质网应激、细胞凋亡和渗透调节3个方面展开了分析。内质网在细胞外分泌物转运、脂质代谢和钙离子 (Ca2+) 储存中发挥重要作用，同时对氧化应激敏感[36-37]。当内质网应激反应无法维持细胞稳态时，细胞凋亡程序被启动，进而影响鳃组织的渗透调节功能。内质网应激、细胞凋亡和渗透调节相关基因表达水平能够反映对虾受PHT胁迫影响的程度。
暴露于PHT胁迫和ROS会促进Ca2+ 的释放，影响内质网蛋白质折叠进程[38]。未折叠蛋白质反应 (Unfolded protein response, UPR) 在一定程度上可以减轻内质网的负担和损伤，有助于重建内质网平衡。UPR的启动依赖于内质网膜上的3个信号启动器：IRE1、EIF2α和ATF6[39]。它们通过影响c-Jun氨基末端激酶 (JNK)、x-框结合蛋白 (XBP)、激活转录因子4 (ATF4) 和半胱氨酸蛋白酶 (CASP) 等下游基因的表达水平，进一步消除折叠错误的蛋白质或启动细胞凋亡[40]。PHT胁迫能显著诱导ATF6、IRE1和EIF2α基因表达上调，表明PHT胁迫通过内质网应激途径影响鳃组织的生理功能，可能与ROS的大量产生有关。关于大西洋鲑 (Salmo salar) 的研究同样得到了类似结果[41]。此外，三丁酸甘油酯的投喂在一定程度上修复了鳃组织的损伤并防止过量ROS的积累，尤其每天投喂三丁酸甘油酯对于IRE1和EIF2α基因表达水平有显著下调作用。胁迫前和胁迫后投喂三丁酸甘油酯仅显著下调IRE1基因的相对表达水平。
线粒体过氧化损伤可导致细胞凋亡，而细胞凋亡是由多种细胞因子调控的[42]。P53是一种广泛的环境应激传感器，可激活CASP3，通过促进CYTC释放诱导细胞凋亡[43]。研究表明，热应激显著诱导紫贻贝 (Mytilus galloprovincialis) 鳃组织CASP3基因表达和大菱鲆 (Scophthalmus maximus L.) 体内P53、CASP3基因表达[44-45]。本研究中，PHT胁迫显著诱导细胞凋亡基因的相对表达水平上调。每天投喂三丁酸甘油酯对CYTC和CASP3基因有显著下调作用，所有细胞凋亡指标恢复至与对照组相同的水平。而PHT胁迫后饲喂三丁酸甘油酯7 d可抑制CYTC和CASP3基因的上调趋势。这与三丁酸甘油酯在肉鸡和仔猪上的实验结果一致[20,46]。另外，当三丁酸甘油酯用于癌症治疗时，会发挥促进凋亡的作用以阻止癌症进一步发展[47]。因此，三丁酸甘油酯的实际作用似乎是维持细胞凋亡反应的稳定，而不是单纯的促进或抑制凋亡。
渗透调节是应对环境离子浓度变化的关键适应性生理过程[48]。凡纳滨对虾主要依靠鳃组织的运输通道和离子泵来完成这一过程[49]。AQP和TIP可促进水、甘油和氨等小分子物质的运输[50-51]。Na+-K+-ATP酶在维持盐度和离子平衡方面发挥着关键作用，其α亚基含有Na+、K+和ATP的结合位点，β亚基参与调控K+ 激活的Na+-K+-ATP酶转运活性[17]。本研究中，PHT胁迫后TIP4和AQP基因表达均上调，表明鳃组织小分子转运功能可能被激活。鉴于NKAα基因表达上调而NKAβ基因表达下调，推测凡纳滨对虾可能通过提高Na+-K+-ATP酶结合位点活性抵抗PHT胁迫的影响。每天饲喂三丁酸甘油酯对所有渗透调节基因的相对表达水平均有显著下调作用，且维持NKAα、NKAβ和TIP4基因表达在N组水平。胁迫前和胁迫后饲喂三丁酸甘油酯也分别调控TIP4和NKAβ基因表达在N组水平。因此，每天投喂三丁酸甘油酯对维持渗透调节平衡的效果最好，在PHT应激之前或之后添加三丁酸甘油酯也有一定效果。
4. 结论
综上所述，PHT应激可诱导凡纳滨对虾鳃组织病理损伤、氧化还原平衡失调和内质网应激、细胞凋亡启动和渗透调节紊乱。在饲料中添加2.0 g·kg−1三丁酸甘油酯可缓解PHT胁迫造成的不良影响。值得注意的是，不同饲喂策略有不同效果。每天饲喂三丁酸甘油酯能够显著改善凡纳滨对虾鳃组织结构，并维持氧化还原、细胞凋亡和渗透调节稳态。PHT应激前或后饲喂三丁酸甘油酯也有一定抗PHT胁迫效果，但每天投喂的效果似乎更显著。
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图 1 本研究实验设计示意图
注：N. 阴性对照组；P. PHT胁迫阳性对照组；D1. 三丁酸甘油酯胁迫前投喂组；D2. 三丁酸甘油酯每天投喂组；D3. 三丁酸甘油酯胁迫后投喂组。
Figure 1. Sketch map of experimental design of this study
Note: N. Negative control group; P. PHT stress positive control group; D1. Feeding tributyrin before PHT stress group; D2. Feeding tributyrin every day group; D3. Feeding tributyrin after PHT stress group.
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图 2 三丁酸甘油酯对周期性高温胁迫下凡纳滨对虾鳃组织学形态的影响 (200×)
注：a. 阴性对照组 (N)；b. PHT胁迫阳性对照组 (P)；c. 胁迫前投喂组 (D1)；d. 每天投喂组(D2)；e. 胁迫后投喂组 (D3)。
Figure 2. Effects of dietary tributyrin on histological morphology of L. vannamei under periodic high-temperatures stress (200×)
Note: a. Negative control group (N); b. PHT stress positive control group (P); c. Feeding before PHT stress group (D1); d. Feeding every day group (D2); e. Feeding after PHT stress group (D3).
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图 3 三丁酸甘油酯对周期性高温胁迫下凡纳滨对虾鳃组织氧化应激指标的影响
注：数据上标不同字母表示组间差异显著 (P<0.05)。
Figure 3. Effects of dietary tributyrin on antioxidant capacity of L. vannamei under periodic high-temperature stress
Note: Different letters on each bar represent significant differences (P<0.05).
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图 4 三丁酸甘油酯对周期性高温胁迫下凡纳滨对虾鳃组织氧化应激、内质网应激、细胞凋亡和渗透调节基因表达水平的影响
注：数据上标不同字母表示组间差异显著 (P<0.05)。
Figure 4. Effects of dietary tributyrin on oxidative stress, endoplasmic reticulum stress, apoptosis and osmoregulation gene expression levels in gill tissues of L. vannamei under periodic high-temperature stress
Note: Different letters on each bar represent significant differences (P<0.05).
表 1 实验饲料配方
Table 1 Experimental feed formulation
成分 (干物质)
Ingredient (Dry mass)三丁酸甘油酯添加水平
Addition amount of tributyrin/
(g∙kg−1)0 2.0 鱼粉 White fish meal 250 250 豆粕 Soybean meal 180 180 花生麸 Peanut bran 164 164 面粉 Wheat flour 230 222 啤酒酵母 Beer yeast 50 50 磷虾粉 Krill meal 50 50 大豆卵磷脂 Soybean lecithin 10 10 鱼油 Fish oil 10 10 豆油 Soybean oil 10 10 氯化胆碱 Choline chloride (50%) 5 5 磷酸二氢钙 Ca(H2PO4)2 10 10 维 C-磷酸酯 VC-phosphate ester 1 1 维生素预混料 Vitamin premix① 10 10 矿物质预混料 Mineral premix② 10 10 海藻酸钠 Sodium alginate 10 10 三丁酸甘油酯 Tributyrin 0 2 总计 Total 1 000 1 000 营养成分 Nutritional composition③ 粗蛋白 Crude protein 398.7 399.1 粗脂肪 Lipid 72.6 72.9 灰分 Ash 120.3 120.7 水分 Moisture 105.2 105.7 注：三丁酸甘油酯添加量参照 Su等[19]和 Wang等[20]的研究。 ① 维生素预混料 (g∙kg−1)：醋酸维甲酸酯 2.5；胆钙化醇 6.25；all-rac-生育酚乙酸酯 75；甲萘醌 2.5；硫胺素 0.25；核黄素 1；D-泛酸钙 5；吡哆醇 HCl 0.75；氰钴胺 2.5；烟酸 2.5；叶酸 0.25；生物素 2.5；肌醇 379；纤维素 500。② 矿物质预混料 (g∙kg−1)：氯化钾90；碘化钾 0.04；氯化钠 40；五水合硫酸铜3；七水硫酸锌4；七水硫酸钴0.02；七水硫酸亚铁20；一水硫酸锰3；七水硫酸镁124；二水合磷酸氢钙500；碳酸钙 215。③ 测量值 (g∙kg−1)。 Note: The addition amount of tributyrin is based on the research of Su, et al[19] and Wang, et al[20]. ① Vitamin premix (g∙kg−1): Retinoate acetate 2.5; Cholecalciferol 6.25; All rac tocopherol acetate 75; Methyl naphthoquinone 2.5; Thiamine 0.25; Riboflavin 1; D-calcium pantothenate 5; Pyridoxine HCl 0.75; Cyanocobalamine 2.5; Niacin 2.5; Folic acid 0.25; Biotin 2.5; Inositol 379; Cellulose 500. ② Minerals (g∙kg−1) premix: KCl 90; KI 0.04; NaCl 40; CuSO4-5H2O 3; ZnSO4-7H2O 4; CoSO4-7H2O 0.02; FeSO4-7H2O 20; MnSO4-H2O 3; MgSO4-7H2O 124; CaHPO4-2H2O 500; CaCO3 215. ③ Measured value (g∙kg−1). 
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表 2 本研究所用引物序列
Table 2 Primer sequences used in this study
基因名称
Gene name正向引物(5'—3')
Forward primer (5'–3')反向引物(5'—3')
Reverse primer (5'–3')β-actin AGCTCATTGTAGAAGGTGTGATGCC TCCTGACCCTGAAGTACCCCATTG ROMO1 GCACCGTGGAGTAGGAGAACAAC TTGCCATGCCGACTGAGAAACC CAT TGATCGCTACAACAGTGCTGATGAG ATGTTCTCCACCAAACGCTGACG SOD GACACGACCATTAGCCTGTACGAC GTTGCCAGTAGCGAGTGAACCTTC GPX CGGCGAGATGGTGTCGTTCAAG GAGTTGGTTCATCTGGTGGAAGTCC TRX TCATCAATCAGCCGCATACCATCG CACCTTCTAAGTCCTTGGGAGATAACG ATF6 AGCAACACATCACGGACATCATCAG GTGGGAAACTGGGCTTTGTTAGGG IRE1 CCAGCACGACATCCAGTTCTTCC CCTCCGCAGCAAACACCTTCTC EIF2α ATCACCCATCTCCTCACCACAGAC AGCCTTCCATCTACCCTCCACTG CYTC TCGACGTGTACCTGACCAACCC TTCGCCTGGCTTCCTCTTCCTC CASP3 ATTATAGAGTGCCTGCGTTGCTACC TGCGATATCATGCCTAGATGCTTGG P53 CGCCGCCAAGGAAGTGAAGG TGGGAGGCGATGGTGGTGTC TIP4 GTCTCTCTGAACCCTTGCCAAACTC GTTGCCTATGATTACCTGCGTCCTC AQP GCAGCCATCTTGAAGGGAGTGAC ACGAGGACGAAGGTGATGAGGAG NKAα TGAAATCGTGTTTGCCCGTACCTC ACCATCACCAGTTACAGCCACAATG NKAβ GAACCCAGCCGACGAAGAATACG CAGCAACAATAGGTGGCAGGTAGC
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