Cloning and subcellular localization of HYD gene from Nocardia seriolae
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摘要: 鲪鱼诺卡氏菌(Nocardia seriolae)是鱼类诺卡氏菌病的主要病原。鲪鱼诺卡氏菌水解酶(hydrolase，HYD)可能是鲪鱼诺卡氏菌的毒力因子。研究结果表明鲪鱼诺卡氏菌HYD的肽段不是分泌蛋白。亚细胞定位研究发现HYD-GFP融合蛋白均匀地分布在胖头鲤(FHM)细胞的细胞质中。亚细胞定位和过表达研究都显示HYD蛋白在FHM细胞中表达后，细胞核出现固缩浓染、凋亡小体等细胞凋亡特征，但Caspase-3活性检测表明HYD并未显著增加细胞凋亡水平。研究为进一步了解鲪鱼诺卡氏菌的致病机理奠定了基础。
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关键词:
- 鲪鱼诺卡氏菌 /
- 水解酶 /
- 亚细胞定位 /
- Caspase-3活性检测
Abstract: Nocardia seriolae is the main pathogen of fish nocardiosis. N.seriolae hydrolase (HYD) may be the virulence factor of N.seriolae. In this study, the results show that the N.seriolae HYD is not a secreted protein. Subcellular localization studies reveal that HYD-GFP fusion proteins uniformly distributed in whole FHM cell. Typical apoptotic features, such as nuclear pyrosis and apoptotic bodies, were found when HYD protein expressed in FHM cells according to subcellular localization and overexpression studies, while the quantitative assay of Caspase-3 activity shows that HYD did not increase the level of apoptosis significantly. The study lays foundation for further study on the pathogenic mechanism of N.seriolae.-
Keywords:
- Nocardia seriolae /
- HYD /
- subcellular localization /
- Caspase-3 assay
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生物胺作为神经递质在动物的生理过程起到重要的作用，大多数海洋无脊椎动物的附着变态都与神经系统密切相关，在浮游幼虫充分发育至附着变态时，神经递质甚至被认为开启了附着变态的发生。COON等[1-2]发现肾上腺素、左旋多巴、多巴胺和章鱼胺能够诱导牡蛎的附着变态。张涛等[3]也在海湾扇贝(Argopecten irradias)中发现了类似现象，且发现其幼虫体内多巴胺含量在附着变态期间显著上升。柯才焕等[4-5]也发现肾上腺素对翡翠贻贝(Perna viridis)的附着变态有显著诱导作用。相对于肾上腺素、左旋多巴和多巴胺，目前对软体动物章鱼胺及其受体的研究还比较少见。
章鱼胺(Octopamine，OA)广泛存在于无脊椎动物中，是神经系统中存在的多种微量生物胺之一，是脊椎动物的去甲肾上腺素同类物，在无脊椎动物中可作为神经递质或神经调节物，通过与章鱼胺受体(Octopamine receptor, OAR)相结合传递神经信号[6-7]。至今，已有4名诺贝尔奖获得者从事关于章鱼胺的研究，分别涉及章鱼胺受体识别、线虫体内章鱼胺功能以及脊椎动物体内痕量生物胺探寻等领域。章鱼胺和去甲肾上腺素均属于酪氨酸衍生物，它们在贝类生物中作为神经信号分子被利用，脊椎动物则充分利用了去甲肾上腺素及其衍生物肾上腺素，却很少利用章鱼胺[8]。章鱼胺通过受体实施各种各样的功能，很多种受体的分子功能与特征不仅在果蝇(Drosophila)中已经弄清，在昆虫中也进行了研究[9]。在果蝇中，章鱼胺涉及到攻击性行为[10-11]、睡眠[12]和生殖过程[13-16]；在昆虫中，章鱼胺及其受体则具有控制运动与栖息的功能[17]。目前，章鱼胺受体已经从软体动物腹足类的椎实螺属(Lymnaea)[18-19]和海兔螺属(Aplysia)[20]中被鉴定出来，且发现其在生命活动中能够行使控制行为发生、参与新陈代谢以及信号转导等多种生理功能[21-23]。BLAIS等[24]报道了大西洋浪蛤(Spisula solidissima)的一种章鱼胺受体，认为该受体是组成型表达，但并未对其功能作进一步研究。王敏等[25]在海洋贝类中检测到丰富的章鱼胺，其含量是海洋鱼类等其他生物的几十倍之多。PRYCE等[26]通过免疫印迹分析技术、HPLC分析技术，在美洲牡蛎(Crassostrea virginica)的鳃、外套膜、心脏、血淋巴以及神经系统中检测到了OA和OAR的存在，并证实了其在美洲牡蛎的心脏活动中行使重要功能。
合浦珠母贝(Pinctada fucata)又称马氏珠母贝，隶属于软体动物门中的双壳纲，是生产海水珍珠的主要贝类。合浦珠母贝在它们复杂的生命活动中，需要经历一个自由游动的早期变态发育过程[27]，按照时间顺序分为受精卵-担轮期-D型期-壳顶期[28]。在变态发育的过程中，其幼虫在形态、生理、结构和功能方面都会发生显著变化[29]，推测该过程可能受到OAR基因的调控作用。贝壳是贝类重要的组成部分，贝的生长发育和珍珠的形成都与贝壳密不可分，而贝壳的形成又受到基因的调控，关于贝壳的理化特性和形成机理一直是研究的热点[30-31]。鉴于OAR基因的多功能性，该实验进行了合浦珠母贝OAR基因的克隆，通过实时荧光定量PCR技术分析其在不同发育时期和不同组织中的表达情况，并通过贝壳缺刻实验探究其在贝壳形成及修复中的调控作用。对合浦珠母贝OAR基因的研究将有助于了解贝类生长发育和贝壳形成的分子机制，为贝类育种研究提供理论基础。
1. 材料与方法
1.1 实验材料
实验所用合浦珠母贝取自海南陵水养殖基地，壳长为60~80 mm，解剖后分别取合浦珠母贝外套膜、闭壳肌、肝胰腺、鳃、珍珠囊和肠6个组织。另取性成熟贝进行解剖取精卵、体外受精，随后取5个发育时期样品，包括担轮期(受精后约8 h)、D型期(受精后24 h)、壳顶期(受精后4~7 d)、眼点期(受精后9~15 d)和变态期幼虫(受精后11~20 d)。样品放入RNA保护液(TaKaRa，大连)中，－80 ℃保存备用。
1.2 实验方法
1.2.1 总RNA提取与cDNA合成
用上述所取得外套膜组织样品，按照Trizol(Invitrogen，USA)传统方法提取外套膜组织的总RNA，在DEPC水中溶解，用1%的琼脂糖凝胶电泳检测其完整性，核酸微量定量仪ND-2000检测A260/A280比值和浓度。按照cDNA合成试剂盒进行反转录，产物在-20 ℃冰箱保存备用。
1.2.2 转录组序列的分析及基因克隆
根据合浦珠母贝转录组序列中的OAR基因片段，设计3′引物(OAR-3′-S1:ACAAGGCGACGCAGGTTAGT和OAR-3′-S2：ACTATCTATCAGTGACGGGTAC)。根据SMART-RACE试剂盒(Clontech，广州)，通过巢式PCR扩增OAR基因cDNA全长。然后通过NCBI中ORF finder预测开放阅读框(ORF)序列，并设计引物(ORF-S：ATGTCAGTGATTAATTTATC和ORF-A：TGCAGGACGTTTTTGTTTGG)扩增验证。用1.5%的琼脂糖凝胶进行电泳，对目的片段胶回收。将目的片段与pMD18-T载体经连接、转化等步骤(参照傅明骏等[32]的方法)，挑选阳性克隆，送英潍捷基(上海)有限公司测序。
1.2.3 生物信息学分析
利用NCBI数据库中的Blast (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)、OFR Finder(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/gorf/orfig.cgi)、VecScreen (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/VecScreen/VecScreen.html)等软件对测序结果进行分析，验证该目的基因并将其拼接得到该基因的全长cDNA序列；使用ProtParam (http://web.expasy.org/protparam/)预测编码蛋白的理化性质；使用NetPhos 2.0 Server (http://www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/)预测磷酸化位点；使用SMART(http://smart.embl-heidelberg.de/)预测其蛋白结构域；用SignalP 4.1(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)预测信号肽序列；使用PSORT Ⅱ Prediction (http://psort.hgc.jp/form2.html)进行细胞定位的预测；利用MatGAT 2.02(http://ww3.bergen.edu/faculty/jsmalley/matgat.html)进行序列相似性和一致性分析；利用DNAMAN软件进行同源序列比对。用NetNGlyc 1.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetNGlyc/)预测OAR的糖基化位点。利用Mega 6.0软件，用临位相接法(neighbor-joining)构建系统进化树。
1.2.4 目的基因在不同组织和不同发育时期的表达
提取合浦珠母贝不同组织(鳃、肝胰腺、外套膜、闭壳肌、珍珠囊、肠道)和不同发育时期(担轮期、D型期、壳顶期、眼点期、变态期)总RNA，按照荧光定量反转录试剂盒(TaKaRa，大连)的说明合成cDNA。根据OAR的cDNA序列设计特异性引物为qOAR-S和qOAR-A(qOAR-S：GGAACCATCAACCGAATC和qOAR-A：CCGTCAA-TACTACGCAAG)，内参基因18S的引物为q18S-S和q18S-A(q18S-S：TGTCTGCCCTATCAACTTT和q18S-A：TGTGGTAGCCGTTTCTCA)。按照TaKaRa SYBR PremixExtaqTMKit(Perfect Real Time)试剂盒进行PCR反应。每个组织或时期样品取3个重复，每个样品进行3次重复，用蒸馏水作为阴性对照。实验结果采用相对荧光定量法(△CT法即2-ΔΔCt)[33]分析OAR基因在合浦珠母贝各个组织及不同发育时期的相对表达量。
1.2.5 缺刻实验
选取28只壳长为(6±0.5)cm的健康成贝装入一个贝笼，再将所有贝暂养于水泥池中，定期饲喂并每天换水，保持水质稳定。3 d后随机挑选24只进行缺刻处理，方法参照MOUNT等[34]，在足的对面用手术剪将贝壳剪出深度约1 cm的V形缺口，确保损伤珍珠层而不破坏外套膜。处理后将贝放回原贝笼，继续饲养。另4只贝不做处理，作为对照组。分别在处理0 h、6 h、12 h、24 h、36 h、48 h后各取4只处理贝。观察处理贝切口变化，解剖后取外套膜组织，提取总RNA，反转录并进行实时荧光定量PCR反应，方法同1.2.4。
2. 结果
2.1 OAR的cDNA序列特征
使用基因特异性引物进行RACE扩增，经过拼接之后获得目的基因cDNA序列全长(图 1)，命名为pfOAR。pfOAR cDNA全长为1 890 bp，开放阅读框(ORF)序列长度为1 659 bp，5′UTR为113 bp，3′UTR为118 bp。预测OAR基因编码552个氨基酸，理论分子量为63.167 kD，理论等电点为9.19。SMART结构域预测显示，PfOAR具有7个跨膜结构域(74~96 aa、109~131 aa、146~168 aa、189~211 aa、243~265 aa、476~498 aa和508~530 aa)。SignalP 4.1软件分析表明，PfOAR不存在信号肽序列。PSORT Ⅱ Prediction细胞定位显示，PfOAR位于细胞膜上，属于跨膜蛋白。NetPhos 2.0 Server分析显示PfOAR具有42个磷酸化位点，其中丝氨酸位点28个，苏氨酸位点8个，酪氨酸位点6个。NetNGlyc 1.0显示PfOAR编码蛋白有6个糖基化位点。
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图 1 OAR基因cDNA全长序列及氨基酸序列左侧正常和加粗数字分别标明OAR基因cDNA序列和氨基酸残基位置；cDNA序列中方框内分别为起始和终止密码子；阴影部分为跨膜结构域(TM)。Figure 1. Nucleotide and deduced amino acid sequences of OARThe bold and normal numbers on the left indicate the positions of the OAR gene cDNA sequence and the amino acid residues, respectively; the boxed letters of cDNA sequence are initiation codon and termination codon; the transmembrane domains (TM) are highlighted.通过DNAMAN软件将合浦珠母贝OAR蛋白序列与太平洋牡蛎(C.gigas)、静水椎实螺(Lymnaea stagnalis)等物种的OAR蛋白序列进行比对，结果显示PfOAR与其他软体动物的OAR蛋白序列具有较高的一致性，7个跨膜结构域高度保守(图 2)。选取哺乳类、爬行类等脊椎动物的肾上腺素受体(AR)蛋白序列与合浦珠母贝等无脊椎动物物的OAR蛋白序列构建系统进化树。结果显示，PfOAR与太平洋牡蛎OAR蛋白聚为一支，然后与海蜗牛(Aplysia californica)、静水椎实螺的OAR蛋白聚为一支(图 3)。
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图 2 pfOAR与其他物种OAR氨基酸序列的多重比对“* ”表示同源性；“.”或者“：”表示相似性；黑色划线部分为跨膜结构域(TM)。Figure 2. Mutiple alignment of pfOAR with other known OAR amino acids sequencesIdentical and similar sites are shown with sparks (*) and dots (. or :), respectively. The black lines indicate transmembrane domains (TM).![]()
图 3 基于OAR氨基酸序列构建的NJ系统树Figure 3. Neighbour-Joining phylogenetic tree base on amino acid sequence of OAR2.2 OAR基因在不同组织中的表达
荧光定量PCR检测结果显示，pfOAR在合浦珠母贝6个被检测的组织中均有表达，表达水平存在显著的组织差异性。pfOAR在外套膜中表达水平最高，显著高于其他组织(P < 0.05)，其他5个被检测组织中pfOAR表达水平差异不显著(图 4)。
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图 4 OAR基因在合浦珠母贝不同组织中的表达水平M.外套膜；P.珍珠囊；I.肠；H.肝胰腺；G.鳃；A.闭壳肌; 不同字母表示差异显著(P < 0.05), 后图同此。Figure 4. Relative expression of pfOAR in different tissues of P.fucataM. mantle; P. pearl sac; I. intestine; H. hepatopancreas; G. gill; A. adductor muscle. The significant difference is indicated by different letters (P < 0.05).The same case in the following figures.2.3 OAR基因在不同发育时期中的表达
利用qRT-PCR技术对合浦珠母贝5个不同发育时期(担轮期、D型期、壳顶期、眼点期、变态期)的pfOAR mRNA表达量进行检测，结果显示，pfOAR mRNA在变态期的表达量显著高于其他4个发育时期(P < 0.05)(图 5)。
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图 5 基因在合浦珠母贝不同发育时期中的表达水平T.担轮期；D. D型期；U.壳顶期；E.眼点期；M.变态期Figure 5. Relative expression of pfOAR at different developmental stages of P.fucataT. trochophore; D. D-veliger larvae; U. umbo veliger larvae; E. eyebot larvae; M. metamorphosis2.4 OAR基因缺刻实验分析
利用qRT-PCR技术，在进行缺刻实验后对pfOAR mRNA在合浦珠母贝外套膜组织中的表达情况进行检测，结果显示，pfOAR mRNA在贝壳缺刻后0~24 h表达量缓慢上升，但差异不显著，缺刻36 h后表达量显著升高(P < 0.05)，随后表达量下降(图 6)。
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图 6 贝壳损伤处理后不同时间外套膜组织pfOAR基因的表达水平Figure 6. Relative expression level of pfOAR at different time after shell notching3. 讨论
章鱼胺受体广泛存在于无脊椎动物中，主要为G蛋白偶联受体家族成员[17]，具有调节神经肌源性节奏收缩、调节cAMP水平、参与磷酸化途径等重要作用[7]。该研究利用RACE技术克隆得到合浦珠母贝OAR基因的cDNA全长序列。生物信息学分析结果显示，PfOAR蛋白具有7个跨膜结构域，属于典型的G蛋白偶联受体，这与BLAIS等[24]的研究结果相符。多序列比对结果显示，PfOAR与太平洋牡蛎、静水椎实螺等其他软体动物的OAR蛋白序列具有较高的相似性，特别是在跨膜结构域部分具有高度的保守性，研究表明，跨膜区的保守有利于维持受体结构的稳定，为受体发挥功能提供保障[35]。系统进化树显示，PfOAR与太平洋牡蛎的OAR聚为一支，表明它们之间具有较高的同源性，哺乳类、爬行类、鱼类、节肢类等各自聚为一支，这与它们的生物学分类相符。
qRT-PCR表达分析结果显示，pfOAR mRNA在6个组织(外套膜、珍珠囊、肠、肝胰腺、鳃、闭壳肌)中均有表达，这与大西洋浪蛤[24]、美洲牡蛎[36]和紫贻贝(Mytilus galloprovincialis)[37]中的研究结果相似。但是这些研究并没有指出组织表达的差异性，该研究结果显示，pfOAR在不同组织中的表达量存在显著差异，在外套膜中的表达量显著高于其他组织。外套膜是参与生物矿化形成贝壳的重要组织，推测pfOAR可能在生物矿化过程中起到一定的调控作用。为了证实推测，该研究进一步做了合浦珠母贝贝壳的缺刻实验。qRT-PCR表达分析结果显示，破壳后pfOAR的表达量在0~24 h缓慢上调，在第36小时显著升高达到最大值，随后表达量下降。有研究报道，OAR基因的亚型oct1在受到刺激时，细胞内钙离子的浓度会明显增加，钙离子是参与贝壳形成的重要离子，这在一定程度上证明了该基因可能具有矿化功能[18-19]。该研究结果表明pfOAR可能参与了贝壳修复的调控过程。
章鱼胺及其受体与海洋贝类幼虫的附着变态密切相关。COON等[2]发现章鱼胺能够诱导牡蛎的附着变态，张涛等[3]在海湾扇贝中也发现了类似现象。该实验中pfOAR基因在合浦珠母贝不同发育时期(担轮期、D型期、壳顶期、眼点期、变态期)中的表达结果显示，pfOAR mRNA在变态期(即幼虫附着的时期)的表达量显著高于其他时期，这与上述研究结果相一致，表明pfOAR在合浦珠母贝的变态发育时期可能起重要作用。在变态发育过程中，也涉及到贝壳的发育[28, 38]，包括胚壳Ⅰ(D型期早期)和胚壳Ⅱ(D型期后期和壳顶期)的形成，胚壳Ⅱ已经开始出现珍珠层和棱柱层的分层[39]，因此变态发育过程也涉及到生物矿化的发生。此外，合浦珠母贝在变态发育过程中除了壳的发生以外，形态也发生了很大的变化，包括面盘完全退化、唇瓣形成、足由原来位于身体中后部转向前部，鳃丝明显向贝壳腹缘延伸等，因此，pfOAR在合浦珠母贝变态期的高表达表明该基因除了可能参与生物矿化、诱导附着外，也可能参与变态期相关器官的发生。
该研究通过pfOAR在合浦珠母贝各组织以及不同发育时期的相对表达情况以及缺刻实验，对其功能做了初步研究，表明pfOAR参与了贝壳生物矿化和附着变态等过程，但其具体调控通路有待进一步研究。
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图 1 這鱼诺卡氏菌HYD基因PCR扩增电泳结果
M. 标准物质2 000；1. 引物为pEGFP-F/pEGFP-R的高保真PCR产物；2. 引物为的高保真pcDNA-F/pcDNA-R PCR产物
Figure 1. Agarose gel electrophoesis of PCR product of HYD gene from N.seriolae
M. DL 2 000 Marker; 1. PCR product of high-fidelity pEGFP-F/pEGFP-R; 2. PCR product of high-fidelity pcDNA-F/pcDNA-R
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图 2 這鱼诺卡氏菌HYD基因的核苷酸序列及其推定的氨基酸序列
划线部分表示NlpC/P60结构域序列
Figure 2. Full-length nucleotide and putative amino acid sequences of HYD gene from N.seriolea
The underlined section represents the sequence of NlpC/P60 domain.
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图 3 不同物种HYD氨基酸序列多重比对分析
阴影区表示同源性氨基酸，其中黑色区表示氨基酸同源性为100%，灰色区表示氨基酸的同源性在80%以上；各物种的GenBank注册号为：凹形诺卡氏菌(WP_040806841.1)，杀鲑诺卡氏菌(WP_062988666.1)，星形诺卡氏菌(SFN62459.1)，束红球菌(WP_032403931.1)，天蓝色链霉球菌(NP_628950.1)，结核分支杆菌(NP_216706.1)，芽孢杆菌(YP_001086653.1)，脑膜炎奈瑟氏菌(NP_274993.1)，铜绿假单胞菌(NP_249889.1)
Figure 3. Multiple alignment of deduced amino acid sequences of HYD gene among different species
The shadowed regions indicate residues sharing homology: black regions indicate 100% homology, and gray regions indicate homology above 80%; GenBank accession No.: N.concave (WP_040806841.1), N.salmonicida (WP_062988666.1), N.asteroids (SFN62459.1), Rhodococcus fascians (WP_032403931.1), Streptomyces coelicolor (NP_628950.1), Mycobacterium tuberculosis (NP_216706.1), Clostridioides difficile (YP_001086653.1), Neisseria meningitidis (NP_274993.1), Pseudomonas aeruginosa (NP_249889.1).
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图 4 基于HYD同源类似物氨基酸序列绘制的系统进化树
Figure 4. Phylogenetic tree of HYD based on homologous amino acids
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图 5 HYD蛋白在FHM细胞内的定位
将pEGFP-HYD和pEGFP-N1转染FHM细胞，转染后48 h，用MitoTracker Red CMXRos和DAPI染色，并于荧光显微镜下观察。绿色荧光显示了HYD-GFP融合蛋白或GFP，红色荧光显示了线粒体，蓝色荧光显示细胞核
Figure 5. Subcellular localization HYD in FHM cell
FHM cells were transiently transfected with pEGFP-HYD and pEGFP-N1. At 48 h post transfection, the cells were stained with MitoTracker Red CMXRos and DAPI, and then observed under fluorescence microscopy. Green fluorescence shows the localization of HYD-GFP fusion protein or GFP; red fluorescence shows the location of mitochondrion, and blue fluorescence shows the nucleus.
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图 6 转染后FHM细胞的细胞核观察
将pcDNA-HYD和pcDNA3.1-His A转染FHM细胞，在转染后48 h经DAPI染色；箭头表示凋亡小体(碎裂的细胞核)
Figure 6. Observation of nucleus in transfected FHM cells
FHM cells were transfected with pcDNA-HYD and pcDNA3.1-His A plasmid. The transfected cells were fixed at 48 h post transfection by DAPI staining. Arrows indicate the apoptotic bodies (fragmented nucleus).
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图 8 這鱼诺卡氏菌HYD基因RT-PCR扩增电泳结果
M. 标准物质2 000；1. 阴性对照；2. HYD基因RT-PCR产物
Figure 8. Agarose gel electrophoesis of RT-PCR product of HYD gene from N.seriolae
M. DL 2 000 Marker; 1. negative control; 2. RT-PCR product of HYD gene
表 1 本研究中所使用的引物
Table 1 Primers used for experiments
引物名称
primer name序列5′ – 3′
sequence限制性内切酶
restriction enzyme用途
usagepEGFP-F GGA AGATCTGTCGACGCCGCCATGA BglII 构建GFP融合表达质粒 pEGFP-R CGG GGTACCGGATCAGATGCGGACGG KpnI pcDNA-F G GAATTCATGAGCCGCCTGGGCGACCCG EcoRI 构建真核过表达质粒 pcDNA-R CCG CTCGAGGATGCGGACGGCGCCCGCGA XhoI 
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