Molecular cloning and expression analysis of BMP10 gene from pearl oyster (Pinctada fucata)
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摘要:
骨形态发生蛋白(bone morphogenetic proteins，BMPs)具有成骨活性，在胚胎发育、组织发生、生殖调控等方面也有重要作用，但在贝类中研究还很少。研究克隆了合浦珠母贝(Pinctada fucata)BMP10基因，命名为PfBMP10。该基因cDNA长1 752 bp，包含开放阅读框(ORF)1 344 bp，编码447个氨基酸。编码蛋白包含一个N端信号肽、一个前结构域和成熟蛋白区。成熟区包含转化生长因子β(transforming growth factor beta，TGF-β)结构域，其中含7个半胱氨酸残基。不同发育时期表达分析显示PfBMP10高表达于担轮期和变态期，提示其可能参与幼体担轮期、变态期的发育调控。组织表达分析显示其在鳃和外套膜高表达，贝壳缺刻实验显示缺刻处理24 h后其在鳃和外套膜中的表达量均显著上升，表明PfBMP10可能与贝壳形成相关。研究结果可为BMP家族基因功能及贝壳形成机理研究提供参考。
Abstract:Bone morphogenetic proteins (BMPs) have functions of inducing bone formation as well as regulating embryo development, histogeny and reproduction. However, there are only a few researches on BMPs in molluscs. The BMP10 gene was cloned from pearl oyster (Pinctada fucata) and thus named as PfBMP10. The full length cDNA of PfBMP10 is 1 752 bp, including an open reading frame (ORF) of 1 344 bp which encodes 447 amino acids. The protein sequence includes an N-terminal signal peptide, a pro-domain and a mature protein region. The mature protein contains transforming growth factor-β (TGF-β) domain which has seven cysteine residues. PfBMP10 expressed higher at the trochophore stage and metamorphosis during the larval development as indicated by qPCR, suggesting that it may involve in larval developmental regulation of trochophore stage and metamorphosis. Compared with other tissues, PfBMP10 showed high relative expression level in the gill and mantle, and rose in 24 h after shell notching, indicating that it probably involves in shell formation. The study provides references for functional study of BMP family genes and mechanism study of shell formation.
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Keywords:
- Pinctada fucata /
- BMP10 /
- shell formation /
- shell notching experiment
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大型海藻广泛分布于海岸线潮间带及潮间带以下的透光层，它们在不到海洋面积百分之一的情况下却提供着百分之十的初级生产力[1]。海藻自身具有食用、医用、工业和环境等方面的应用价值，而且还具有净化沿岸水质，吸收利用水体的氮(N)、磷(P)营养盐等功能，增殖海藻是延缓水体富营养化行之有效的措施之一[2-3]，同时还具有为海洋生物提供栖息场所[4]等生态功能。秦传新等[5]研究了孔石莼(Ulva pretusa)和角叉菜(Pelvetia siliquosa)对硝酸氮(NO3--N)和P的吸收及组成，证实2种大型海藻对高浓度营养盐有较好的吸收作用；杨宇峰和费修绠[6]、YU和YANG[7]认为龙须菜(Gracilaria lemaneigormis)等大型海藻大规模增养殖是降低富营养化海区水质的有效手段；对海藻场内水流、水温[8]、溶解氧(DO)、pH[9]的分布变化具有缓冲作用。但是高密度的增养殖会产生大量海藻脱落物，其在重力的作用下沉积在海底，腐烂后发生分解。
由于大型海藻场海藻种类普遍单一化，而且其叶片会减缓水流的冲刷，势必会造成外侧的海藻脱落，较缓的水流和不断积累的海藻会通过机械沉降作用下沉入海底后形成泥沙底质，腐烂后的海藻会释放出N、P营养盐，不断吸收水体DO，造成二次污染[10]。2008年4月以来在黄海海域出现了浒苔(Enteromorpha proligera)、孔石莼爆发式增殖情况[11]。因此研究大型海藻脱落物对于海洋水质的影响有着重要的意义。目前国内外主要研究工作集中在大型海藻对沿岸海水净化效果与其最适生长环境方面[12-14]，海藻脱落后对海藻场影响的报道较少，因此文章筛选了在广东海域广泛增殖的江蓠(G.confervoides)作为实验对象，通过人工模拟的方法，在实验室中模拟藻类植物沉积、腐烂过程，探讨不同质量海藻脱落物在不同季节对上覆水理化性质的影响，为确定大型海藻的增殖密度以及科学管理等提供参考依据。
1. 材料与方法
1.1 实验材料
实验在中国水产科学研究院南海水产研究所深圳试验基地进行，实验用底泥沉积物采自深圳大亚湾(114.66°E，22.76°N)。在天气情况相近的低潮时，在采样点选取3 m×3 m沉积物相对均匀底泥面，用高度30 cm、内径5 cm的有机玻璃管采集沉积物柱状样4个，供实验室培养用。在运输途中将采集好的底泥放入泡沫箱中，加入冰袋冰冻保存，运回实验室冷冻备用；实验用上覆水采自大亚湾(114.66°E，22.76°N)，所采集的海水不做处理，实验期间海水盐度为29~30；实验海藻为广东沿海常见大型海藻江蓠，采自广东汕头南澳海域(116.94°E，23.41°N)。
1.2 实验装置
实验装置为高30 cm，内径5 cm的透明有机玻璃管。管盖有一个可控速的搅拌器插口。搅拌器扇距沉积物—水界面深度约5 cm，搅拌速度为60~80 r·min-1，以保证培养管内水体均匀混合且不会搅动沉积物。上面是可滤过海藻的出水口，用于收集上覆水(图 1)。
1.3 实验方法
大亚湾南澳海域年平均流速为0.24 m·s-1，将位于培养管管口搅拌器转速设置为模拟天然海域流速。模拟天然海藻的脱落物状态，添加天然海藻藻体，分为无海藻区(对照组)、3 g·m-2(低丰度组)、5 g·m-2(中丰度组)和10 g·m-2(高丰度组)。实验在光照培养箱中进行，保持24 h光照，并依照大亚湾常年季节特点，春秋季20 ℃、夏季28 ℃、冬季15 ℃平均水温设置光照培养箱温度。每个季节温度设置1个对照组，3个处理组。实验前将江蓠置于烘箱中80 ℃烘干，干湿质量比例为0.304:1，对照组中不加入烘干海藻，处理组中分别在低丰度组加入0.91 g，中丰度组加入1.52 g，高丰度组加入3.04 g烘干后江蓠，进入培养管进行实验，每组设置3个重复。共培养72 h，定时采集上覆水，采集之后加入等量海水补充。采集后的上覆水在真空抽滤机抽滤冷冻保存。
1.4 分析方法
用YSI参数测量仪测量水中溶氧并记录，分别用靛酚蓝法测定铵态氮(NH4+-N)、重氮-偶氮光度法测定亚硝态氮(NO2--N)、锌-镉还原法测定NO3--N、抗坏血酸还原钼蓝法测定活性磷(PO43--P)，联合消化法测定上覆水中总氮(TN)、总磷(TP)，参照《海洋监测规范》(GB12763.4—2007)。
1.5 统计分析
实验数据采用Origin 8.0绘图，并应用SPSS 17.0进行数据分析和方差分析，使用LSD多重比较，P＜0.05为差异显著。
2. 结果
2.1 水温对DO的影响
不同温度环境对DO质量浓度的影响见图 2。不同温度下各组ρ(DO)差异显著，高温环境(28 ℃)ρ(DO)下降超过低温(15 ℃)环境。15 ℃环境各组中ρ(DO)在第36小时达到底值，中丰度组与高丰度组差异不显著(P＞0.05)，对照组与低丰度组差异显著(P＜0.05)。20 ℃环境各组水体ρ(DO)在第24小时达到底值，而高丰度组ρ(DO)随时间变化逐渐下降至最低0.35 mg·L-1，对照组与低丰度组差异不显著(P＞0.05)，中丰度组与高丰度组差异不显著(P＞0.05)。28 ℃环境除对照组ρ(DO)随时间改变不明显外，其余各组均在8 h后ρ(DO)急剧下降，低丰度组在第12小时降至最低(0.21 mg·L-1)，低丰度组、中丰度组和高丰度组ρ(DO)随时间变化均无显著差异(P＞0.05)。
2.2 水温对上覆水的影响
2.2.1 对N元素的影响
1) NH4+-N。不同温度环境对NH4+-N质量浓度的影响见图 3。不同温度条件下水体ρ(NH4+-N)显著不同，3个温度下水体ρ(NH4+-N)呈现出先上升后下降趋势，最终下降到与初始值持平或更小。各组中加入江蓠的质量对水体中ρ(NH4+-N)有显著影响(P＜0.05)。低温条件(15 ℃)下水体ρ(NH4+-N)持续上升，并且出现峰值时间晚于高温条件(20 ℃和28 ℃)。15 ℃下对照组与低丰度组无显著差异(P＞0.05)，中丰度组与高丰度组无显著差异(P＞0.05)，水体ρ(NH4+-N)在12~24 h达到峰值；20 ℃下对照组与另外3组体质量均呈显著影响(P＜0.05)；28 ℃下对照组中ρ(NH4+-N)与另外3组差异显著(P＜0.05)。
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图 3 不同温度下铵态氮质量浓度变化Figure 3. Variation of NH4+-N concentration at different temperatures2) NO2--N、NO3--N。不同温度环境对NO2--N、NO3--N质量浓度的影响见图 4和图 5。NO2--N、NO3--N表现出较高一致性。水体温度对ρ(NO2--N)、ρ(NO3--N)有显著影响，且低温(15 ℃)ρ(NO2--N)、ρ(NO3--N)出现峰值时间晚于高温(28 ℃)，处在峰值时，ρ(NO2--N)、ρ(NO3--N)和添加江蓠的质量呈正相关，高丰度组＞中丰度组＞低丰度组＞对照组。15 ℃下NO2--N对照组与低丰度组无显著差异(P＞0.05)，中丰度组与高丰度组无显著差异(P＞0.05)(图 4)；20 ℃下对照组与低丰度组、中丰度组和高丰度组呈较高一致性(P＞0.05)；28 ℃下低丰度组与另外3组差异显著(P＜0.05)，对照组与另外3组差异显著(P＜0.05)，但中丰度组与高丰度组差异不显著(P＞0.05)。
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图 4 不同温度下亚硝态氮质量浓度变化Figure 4. Variation of NO2--N concentration at different temperatures![]()
图 5 不同温度下硝态氮质量浓度变化Figure 5. Variation of NO3--N concentration at different temperatures15 ℃下，ρ(NO3--N)高丰度组与其余3组差异显著(P＜0.05)，12~36 h出现峰值(图 5)；20 ℃下低丰度组与另外3组差异显著(P＜0.05)，8~12 h浓度出现峰值；28 ℃下低丰度组与另外3组差异显著(P＜0.05)，8~12 h浓度出现峰值。
3) TN。不同温度环境对TN质量浓度的影响见图 6。TN释放早于无机氮，低温(15 ℃)时ρ(TN)在4~8 h达到峰值，此后开始逐渐下降，对照组与低丰度组无显著差异(P＞0.05)，中丰度组与高丰度组无显著差异(P＞0.05)；20 ℃时在2~4 h达到峰值，对照组与低丰度组无显著性差异(P＞0.05)，中丰度组与高丰度组无显著差异(P＞0.05)；28 ℃时对照组在第72小时ρ(TN)达到峰值，低丰度组、中丰度组和高丰度组在2~4 h达到峰值，其中对照组与其余3组差异显著(P＜0.05)。
2.2.2 对P元素的影响
1) PO43--P。不同水温条件时水体PO43--P质量浓度变化见图 7。15 ℃、20 ℃和28 ℃下ρ(PO43--P)的变化趋势均为2~4 h出现峰值，显著早于N元素的释放。对照组中峰值出现较晚，后逐渐降低，在第8小时小浮动浓度升高，后逐渐下降至略高于起始值，3个温度环境下均与实验组差异显著(P＜0.05)。低温下(15 ℃)，中丰度组ρ(PO43--P)为10.61 mg·L-1，显著高于高温条件(28 ℃)下水体浓度，而且加入的江蓠质量与上覆水浓度呈正相关关系。
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图 7 不同温度下活性磷质量浓度变化Figure 7. Variation of PO43--P concentration at different temperatures2) TP。不同水温条件时水体TP质量浓度变化见图 8。3个温度下的ρ(TP)在2~4 h达到峰值，显著高于TN达到峰值时间。对照组峰值出现稍晚于实验组，之后水体营养盐浓度快速下降，至第48小时浓度略有升高，最终至实验结束时浓度略高于起始值。ρ(TP)与加入的江蓠体质量呈正比。水温控制在15 ℃时对照组与各实验组呈显著差异(P＜0.05)；实验温度20 ℃时对照组晚于实验组出现峰值，之后水体营养盐浓度迅速下降，至第72小时浓度略高于第0小时。4组实验呈显著差异(P＜0.05)，且对照组与低丰度组无显著差异，低丰度组、中丰度组无显著差异，中丰度组、高丰度组无显著差异；水温控制在28 ℃时对照组在第24小时出现峰值，晚于各实验组，对照组与实验组呈显著差异(P＜0.05)。
3. 讨论
大型海藻脱落死亡后，失去生物活性，经过机械沉降作用沉至海底，在微生物的作用下腐烂分解。水生植物的分解较为复杂，包括水生植物的水解、有机成分的酶解、矿质成分的分解、可溶性有机质的溶解、生物的降解和各类有机成分的酶解、微小颗粒的逸散等[15]，腐烂后的藻类会对水体产生多方面的影响。沉积物中的有机质发生矿化后耗氧，厌氧代谢的中间产物NO2--N、NO3--N逐渐积累，协同矿化后产生的NH4+-N向水层扩散，P元素不断的积累，导致水体富营养化的发生，进而导致溶解氧的过度消耗，因此大型海藻脱落后对底质的影响得到了越来越多的重视。
3.1 海藻脱落物影响海藻增殖区及周边海域水质
自然状态下水中DO与大气中氧气存在着动态平衡，而江蓠腐烂导致平衡被打破，DO下降。孙连鹏等[16]指出，厌氧环境使污泥中的N、P等营养物质得到了较大程度释放。此实验表明，当ρ(DO)达到最低值，此时的ρ(NO2--N)、ρ(NO3--N)同时达到峰值，并且峰值时间等同于ρ(NH4+-N)达到峰值时间。周劲风等[17]指出，NH4+-N经过硝化和亚硝化等的矿化作用转变为不能直接被海藻吸收的NO2--N和NO3--N，此过程消耗氧气，NO2--N属于中间产物极不稳定，反硝化细菌活跃将他们转化为氮(N2)等气体。而NH4+-N持续上升，是因为底泥中的有机氮分解需要浮游动植物的参与，NH4+-N同时是沉积物需氧量的重要贡献者[18]，当水体DO降低，矿化速率减缓，沉积物中的氮以NH4+-N形式溶出[19]。综上所述江蓠腐烂后最直接产物NH4+-N有3支可能的出路：1)进入到水界面直接被藻类吸收；2)发生硝化转变为NO3--N，之后取决于氧气的参与可能发生反硝化，生成N2不会被大多数水生植物所利用；3)进入沉积物铵态氮库中。
在DO降低时，此时的TN、TP也处在较低水平。林旭丹等[20]指出，DO影响着水体环境中不同微生物的呼吸作用，当DO浓度高时，好氧微生物如亚硝化细菌和硝化细菌活跃，浓度低时，厌氧微生物如反硝化细菌活跃。实验显示当DO充足时，江蓠腐烂释放出的有机氮迅速转化为无机氮，ρ(TN)在2~4 h达到峰值，之后快速下降，最终至实验结束时略高于起始值，浓度与加入的江蓠质量呈正相关关系，印证了实验结论。
3.2 不同季节海藻脱落物对水质影响有所不同
通过实验模拟各个季度上覆水营养盐改变，在冬季时ρ(NH4+-N)显著低于夏季，而P元素浓度在冬季显著高于夏季。张亚克等[21]认为夏季蓝绿藻种群占优，与水体NH4+-N变化显著相关，而在冬季时水体硅藻种群增加，与水体P元素增加具有一定相关性。冬季时随着水体悬浮颗粒沉淀，N、P元素浓度较高[22]，气温较低限制了藻类的生长，而到次年春季时气温回升，水体中N、P资源丰富，在自然光照下，为机会主义藻类爆发做了准备，爆发式增长的藻类进一步吸收水体中DO，导致局部水域环境恶化。
海藻丰度对无机氮的影响也表现出差异。冬季(15 ℃)和春秋季(20 ℃)时，ρ(NO2--N)、ρ(NO3--N)最大值均随江蓠丰度的增加而增大，夏季(28 ℃)则相反。高温时，主要限制为DO。随江蓠丰度的增加，DO较长时间保持在极低值。故28 ℃时ρ(NO2--N)、ρ(NO3--N)最大值随江蓠丰度的增加而减小。15 ℃和20 ℃时DO下降较慢，所以变化相反。赵志梅[23]指出溶解氧和温度主要是通过改变硝化-反硝化细菌的活性从而影响硝酸盐的通量，论证了实验结论。
TN与PO43--P均在2~4 h营养盐浓度达到峰值，冬季P元素浓度普遍高于夏季。相关研究证实，P元素的释放早于N元素释放[24-28]，因为P元素存在于植物体内的生物活性物质内，这些物质更容易分解。植物体内的ATP、核酸等可直接水解为磷酸，无需经过复杂的矿化作用[29]，所需时间较短。而PO43--P为藻类的限制因子，夏季时大型海藻场脱落后的藻类会在短时间内释放出PO43--P，可造成甲藻、蓝藻快速生长，而蓝藻通过改变水体pH，而引发底泥沉积物中大量的磷释放，反过来又会促使藻类爆发式生长，竞争水体DO，导致局部水域富营养化加重，从而造成反馈式破坏。而在冬季时气温较低，限制富营养化的爆发，脱落后的藻类逐渐腐烂，营养盐沉积入底泥，在次年春季底泥中营养盐再次扩散入上覆水中又将会刺激藻类的爆发式增长。
3.3 合理设置海藻增殖密度，是良好水质和底质环境指标的保障
综上所述，大型海藻场的沉积物是许多溶解性物质和颗粒性物质的来源，上覆水与沉积物间的营养盐交换活动，直接影响着海藻场的营造。虽然大型海藻场的营造是好的，但是如果海藻密度过高致使海藻脱落，在重力的作用下下沉到海底，会使上覆水TP、TN增加，沉水植物体内的N、P元素70%以上会在较短时间内被释放进入水体，参与水体营养的再生和循环[30]，沉积物中的无机物释放至上覆水后会造成水体富营养化，可能招致某些机会主义海藻爆发。如2008年6月~7月，胶州湾浒苔的爆发，导致海藻场不仅没有达到增殖的目的，反而破坏了海藻场海域水质[31]。因此合理地控制海藻密度，并且根据不同海藻季节变化和生活习性，交替进行吊养或放养江蓠、龙须菜、条斑紫菜(P.yezoensis)等经济价值高环境价值高的品种，吸收水体营养盐，既可以满足经济利益，又具有环保价值[6]。
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图 1 PfBMP10基因的cDNA序列和编码的氨基酸序列
左侧正常和加粗数字分别标明PfBMP10基因cDNA序列和氨基酸残基位置; cDNA序列中加粗部分分别为起始和终止密码子，氨基酸序列中带细下划线的是信号肽序列，带粗下划线的是前结构域；灰色部分为成熟区，方框标记7个半胱氨酸残基。
Figure 1. cDNA and amino acid sequences of PfBMP10 gene
The bold and normal numbers on the left indicate the positions of PfBMP10 gene cDNA sequence and amino acid residues, respectively. The bold letters of cDNA sequence are initiation codon and termination codon. The putative signal peptide and pro-domain are indicated with fine and heavy underline, respectively. The mutation protein which includes seven boxed cysteine residues are shaded in gray.
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图 2 不同物种的BMP10蛋白成熟区的多序列比对
“*”标记了完全一致的氨基酸残基，灰色标记了7个保守的半胱氨酸残基。
Figure 2. Multiple comparisons of mature BMP10 from different species
The identical amino acid residues are marked with the (*), and the seven conserved cysteine are shaded in gray.
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图 3 基于不同物种BMP10蛋白的进化树
Figure 3. Phylogenetic tree based on BMP10 proteins of different species
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图 4 PfBMP10在合浦珠母贝不同发育时期的相对表达量
不同字母表示差异显著(P＜0.05)，后图同此。
Figure 4. Relative expression level of PfBMP10 in different tissues of P.fucata
T. trochophore; D. D-veliger larvae; U. umbo veliger larvae; E. eyebot larvae; M. metamorphosis. The significant difference is indicated by different letters (n=3, P < 0.05). The same case in the following figures.
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图 5 PfBMP10在合浦珠母贝不同组织中的相对表达量
Figure 5. The relative expression level of PfBMP10 in different tissues of P.fucata
I. intestine; Hep. hepatopancreas; Hem. hemocyte; A. adductor muscle; Go. gonad; P. pearl sac; M. mantle; Gi. gill.
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图 6 缺刻处理后的合浦珠母贝
a和b分别为缺刻处理后第0和第48小时拍照所得；箭头指示位于切口部位的新生半透明薄层。
Figure 6. P. fucata after notching
The a and b are pictures of P. fucata after induction of 0 hour and 48 hours, respectively. The arrow points to regenerated semitransparent thin layer in the notched region of the shell.
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图 7 贝壳缺刻处理后不同时间鳃和外套膜中PfBMP10的相对表达量
A和B分别为鳃和外套膜实验结果，不同小写字母代表不同处理时间下基因表达量差异显著(n=3，P＜0.05)，*表示与对照组相比差异显著(n=3，P＜0.05)。
Figure 7. Relative expression level of PfBMP10 at different time after shell notching
A and B are experiment results of gill and mantle. Different lower-case letters indicate significant difference of gene expression level among different treatment groups (n=3, P < 0.05). * indicate significant difference compared with control (n=3, P < 0.05).
表 1 实验所用引物序列
Table 1 Sequences of primers used in the study
引物名称
primer name引物序列(5′→3′)
primer sequence用途
usageS1 TAAGGAGGAGTTGAGGAA 序列验证 A1 AGGCTGGACTGTAGGATC 序列验证 S2 GTTAGGTCTTTATCGCTTAG 中间片段扩增 A2 ACAACCATTCCCTCATA 中间片段扩增 S3 GATTTTGGAGATTCGTAT 序列验证 A3 CTGTTGTCCTTGCCTTTT 序列验证 5′GSP-out ATAGTCAGGTGCCTCTTT 5′RACE 5′GSP-in TTACTAAGCGATAAAGACC 5′RACE qRT-S ATGACCACAAGACCCACTA 荧光定量 qRT-A CTTCTCCTCTATGATTCCA 荧光定量 18S TGTCTGCCCTATCAACTTTC 内参引物 18A TGTGGTAGCCGTTTCTCA 内参引物 
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