Molecular cloning and expression analysis of BMP7b from Pinctada fucata
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摘要: 为了解骨形态发生蛋白(BMP)在贝类生物矿化方面的作用，该研究发现并克隆了合浦珠母贝(Pinctada fucata) BMP7的同源基因BMP7b，并对其进行了组织表达分析。结果显示，该基因cDNA长2 464 bp，其中ORF长1 194 bp，编码397个氨基酸。BMP7b蛋白无跨膜结构，含有1个信号肽(1~26 aa)，1个TGF-β前肽结构域(25~240 aa)和1个TGF-β结构域(299~396 aa)。BMP7b在各组织和各胚胎发育时期中均有表达，在鳃和外套膜的表达量高，在肠和肝胰腺的表达量低；在担轮幼虫期的表达量远远高于其他时期。贝壳缺刻实验显示24 h后，BMP7b表达量显著上升。以上结果表明BMP7b可能在合浦珠母贝贝壳形成和修护过程中起重要作用。Abstract: In order to understand the role of BMP in biomineralization process in mollusca, a BMP7 homolog in Pinctada fucata named BMP7b was cloned in this study. The full length of BMP7b was 2 464 bp, including an open reading frame (ORF) of 1 194 bp which encoded 397 amino acids. The protein sequence included a signal peptide (1–26 aa), a pro-domain (25–240 aa) and a TGF-β domain (299–396 aa). No transmembrane domain was detected. BMP7b was expressed in all kinds of tissues and was higher expressed in gill and mantle, but lower in intestine and hepatopancreas. The BMP7b expression level at larva stage was much higher than that in other periods. In shell notch experiment, BMP7b showed increasing expression level after 24 h. These results indicate that BMP7b may play an important role in process of shell formation and repairment.
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Keywords:
- Pinctada fucata /
- BMP7b /
- temporal spatial expression /
- shell formation and repair
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骨形态发生蛋白(bone morphogenetic protein, BMP)是TGF-β (transforming growth factor beta)超基因家族功能蛋白中的一员，目前已分离出20多种[1]。BMP基因家族蛋白结构具有保守性，均含有TGF-β结构域，在结构上共同具有7个保守的半胱氨酸。BMP基因家族功能蛋白成员参与了生物体的许多功能，如参与皮肤、肌肉、卵巢的生长和发育[1]。BMP还能诱导硬骨和软骨的发生，即在生物矿化过程中起作用[2]。脊椎动物大部分骨骼方面的研究集中在BMP2、BMP4和BMP7上[2]。BMP2是唯一能单独诱导成骨的因子，抑制生肌细胞分化的同时促进骨骼细胞分化[3]。BMP4能诱导未分化的间质细胞分化增殖、形成软骨和新生骨[4]。BMP7是骨的稳态调节和脊椎发育中的关键因子[5]。在无脊椎动物中，如棘皮动物[6]、节肢动物[7]、贝类[8-12]等，有一些BMP家族成员也被克隆出来，且其功能与在脊椎动物中的类似。
合浦珠母贝(Pinctada fucata)是中国用于生产海水珍珠的主要贝种[13]。贝壳形成的分子机制一直都是研究的热点。贝壳的基质是一个坚固的有机矿质，由碳酸钙和有机基质(蛋白和多糖)组成。虽然壳基质蛋白在贝壳中的含量不足5%，但控制着碳酸钙晶体(方解石、文石)的形成、大小、形状以及贝壳的纹理[14]。合浦珠母贝的外套膜分泌壳基质蛋白，形成棱柱层和珍珠层2个矿化结构[15]。目前为止，有许多壳基质蛋白及其基因被分离出来[16-17]。由于贝壳和骨骼都是生物矿化的产物，因此在骨骼形成中起重要作用的BMPs逐渐引起研究者的兴趣。目前已有BMP2、BMP7和BMP10 3个基因在合浦珠母贝中分离出来，研究发现这3个基因可能参与了贝壳形成过程[8,11-12]。在斑马鱼(Danio rerio)中，BMP7基因存在另外一个同源基因BMP7b[18]。本研究发现合浦珠母贝也存在BMP7同源基因BMP7b。本研究对BMP7b的cDNA全长进行分析，并通过实时荧光定量PCR分析BMP7b在不同组织和不同胚胎发育时期的表达情况，最后通过贝壳缺刻实验探讨了BMP7b在外套膜中的表达情况。
1. 材料与方法
1.1 实验材料
实验用合浦珠母贝为1龄贝，壳高为(51±1.67) mm，取自中国水产科学研究院南海水产研究所海南陵水试验基地。取10个合浦珠母贝的外套膜、闭壳肌、鳃、性腺、珍珠囊、肠、血淋巴和肝胰腺。取性成熟贝进行解剖取精卵，体外受精，随后取担轮期(受精后约8 h)、D-型期(受精后24 h)、壳顶中期(受精后4~5 d)、壳顶后期(受精后6~7 d)和变态期(受精后11 d)样本，每个样品取3个重复。所有样品放入RNA保护液中，– 80 ℃保存。
1.2 实验方法
1.2.1 总RNA提取与cDNA合成
用Tirzol法提取以上样品的总RNA，1%琼脂糖凝胶电泳检测其完整性，用分光光度计检测RNA浓度。用M-MLV反转录试剂盒合成cDNA，– 20 ℃保存。
1.2.2 BMP7-like基因克隆
根据合浦珠母贝转录组数据，获得BMP7-like基因片段，用引物S1/A1、S2/A2、S3/A3，以反转录得到的cDNA为模板进行PCR扩增，对已有序列进行验证，对缺失序列进行补充。再依据所得序列设计5′和3′特异性引物(表1)，用5′/3′-Full RACE Kit (TaKaRa)进行RACE扩增。对扩增得到的片段进行克隆测序并拼接。实验所用引物序列见表1。
表 1 实验所用引物Table 1. Sequences of primers used in this study引物名称
primer序列 (5′ – 3′)
sequence用途
applicationS1 CGATGCGTACTATTGTGAT 目的片段扩增 A1 ATTCCGATACCCTATTTCC 目的片段扩增 S2 TGGCGTGATGCTTACTA 目的片段扩增 A2 TGGATACTTCGTTGGGT 目的片段扩增 S3 CAAATAGCAGGCGATAG 目的片段扩增 A3 TGGTCCGTAAGAGAAGA 目的片段扩增 5′GSP-out AACTTCAATACGCTGGTCCG 5′RACE 5′GSP-in CCGCTTCTCCAGCACTAATGTCG 5′RACE 3′GSP-out CTGGATTATCGCCCCTGAG 3′RACE 3′GSP-in AAGTTGTGCTGTGTCCCCT 3′RACE qRT-S TCAAACGCACGAACGAT qRT-PCR qRT-A TGAGGGGACACAGCACA qRT-PCR 18S TGTCTGCCCTATCAACTTTC qRT-PCR 18A TGTGGTAGCCGTTTCTCA qRT-PCR 1.2.3 序列分析
用ORF Finder (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html)查找开放阅读框(ORF)和预测编码蛋白序列；用TMHMM (http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/)预测蛋白的跨膜结构域；用SignalP (http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)预测蛋白信号肽结构；用Conserved Domains (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi)在线程序对蛋白结构域进行分析；用MEGA 6.0的neighbor-joining (NJ)法构建进化树，Bootstrap置信值为1 000。
1.2.4 时空表达模式分析
用SYBR real-time PCR Master Mix kit (TaKaRa)进行实时荧光定量PCR反应。引物qRT-S/A和18S用于qPCR反应(表1)。每个组织和发育时期样品取3个重复，每个样品进行3次重复。用相对荧光定量法2–ΔΔCt计算BMP7-like在合浦珠母贝各组织及不同发育时期的相对表达量。用Origin 8.0进行单因素方差分析(P≤0.05为差异显著)。
1.2.5 贝壳缺刻实验
选取壳长约(60±5) mm、健康、大小均匀的合浦珠母贝24只，随机分为6组，每组4只。暂养3 d后进行缺刻处理。方法同王德清等[19]的处理，具体为在足的对面用剪刀将贝壳剪出V形缺口，这样贝壳的珍珠层和棱柱层均有伤及，但在操作过程中不要损伤外套膜。处理后分别在第0、第6、第12、第24、第36和第48小时各取4只贝，解剖后取V形缺口处的外套膜组织，提取总RNA，反转录并进行实时荧光定量PCR反应，方法同文章之前所述。
2. 结果与分析
2.1 BMP7b的克隆与鉴定分析
基于转录组数据，通过PCR和RACE技术获得合浦珠母贝BMP7同源基因BMP7-like，命名为BMP7b (GenBank登录号KT962839.1)。其cDNA全长2 464 bp，其中ORF长1 194 bp，编码397个氨基酸，5′非编码区(UTR) 578 bp，3′UTR 692 bp。BMP7b蛋白无跨膜结构，信号肽预测显示Pf-BMP7b蛋白有1个N端信号肽(1~26 aa)，表明该蛋白是一种分泌蛋白。Pf-BMP7b含有1个TGF-β前肽结构域(25~240 aa)和1个TGF-β结构域(299~396 aa)。TGF-β结构域包含7个保守的半胱氨酸(图1)。
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图 1 合浦珠母贝BMP7b基因克隆及氨基酸序列分析TGF-β前肽结构域用下划线表示，灰色部分表示TGF-β结构域，方框表示保守的半胱氨酸残基Figure 1. Cloning and amino acid sequence analysis of P.fucata BMP7bThe pro-domain is underlined and TGF-β domain is marked in gray; the conserved cysteine residues are boxed and marked in gray.选取哺乳类、鱼类、鸟类和贝类的BMP7同源基因蛋白序列构建系统进化树。结果显示合浦珠母贝BMP7b与长牡蛎(Crassostrea gigas)的BMP7b聚为一支(图2)。
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图 2 基于不同物种BMP7同源蛋白的进化树Figure 2. Phylogenetic tree based on BMP7 homologous proteins of different species2.2 BMP7b基因在不同组织和不同发育时期的表达分析
合浦珠母贝BMP7b在各组织中均有表达，其中在鳃中表达量最高(P<0.05)，其次是外套膜，在肠和肝胰腺的表达量最低(图3)。BMP7b在5个不同发育时期都有表达，其中在担轮幼虫期表达量最高(P < 0.05)，在壳顶中期和后期表达量低(图4)。
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图 3 合浦珠母贝BMP7b在不同组织中的表达情况M. 外套膜；Go. 性腺；Gi. 鳃；Hep. 肝胰腺；Hem. 血淋巴；I. 肠；A. 闭壳肌；垂直线表示平均值±标准差(n=3)，不同字母表示差异显著(P<0.05)，后图同此Figure 3. Relative expression level of BMP7b in different tissues of P.fucataGo. gonad; M. mantle; Gi. gill; Hep. hepatopancreas; Hem. hemolymph; I. intestine; A. adductor muscle. Vertical bars are represented as $ \overline X \pm {\rm SD}$ (n=3). Different letters above bars indicate significant difference (P<0.05). The same case in the following figures.![]()
图 4 合浦珠母贝BMP7b在不同发育时期的表达情况T. 担轮幼虫；D. D型幼虫；Mu. 壳顶中期；Pu. 壳顶后期；Me. 变态期Figure 4. Relative expression level of BMP7b at different developmental stage of P.fucataT. trochophore; D. D-religer; Mu. middle umbo larvae; Pu. post umbo larvae; Me. metamorphosis2.3 BMP7b在缺刻处理后的表达分析
缺刻后第6和第12小时，BMP7b表达量略有下降，第24小时后表达量显著升高(P<0.05)，第48小时后表达量最高(图5)。
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图 5 BMP7b在贝壳缺刻处理后不同时间的相对表达量Figure 5. Relative expression level of BMP7b at different times after shell incision processing3. 讨论
2014年，Yan等[12]在合浦珠母贝中获得了1个BMP7基因(AGS32053.1)，与长牡蛎的BMP7氨基酸序列(EKC34211.1)有66%的同源性。基于本课题组合浦珠母贝的转录组数据，本研究分离出另一个BMP7的同源基因，为避免混淆，命名为BMP7b。BMP7b与长牡蛎另一个BMP7 (XP_011426448.1)的氨基酸序列有45%的同源性。斑马鱼中存在BMP7a和BMP7b 2个同源基因，两者的氨基酸序列有70%的同源性[18]。但合浦珠母贝的BMP7和BMP7b的氨基酸序列仅有22%的同源性。这说明进化过程中，BMP7基因在鱼类中的保守性强，在贝类中的保守性弱。同其他BMPs一样，BMP7b具有TGF-β前肽结构域和TGF-β结构域。经与人(Homo sapiens)、小鼠(Mus musculus)和斑马鱼等物种BMP7氨基酸序列比对发现此区域有7个保守的半胱氨酸。以上分析符合TGF-β超家族成员在氨基酸序列的共同特征[20]。BMP7b有信号肽，这说明BMP7b可能是分泌性蛋白。
已有BMP基因家族成员在贝类不同组织的表达情况研究。三角帆蚌(Hyriopsis cumingii) BMP7在鳃、性腺和外套膜中的表达量高[21]。栉孔扇贝(Chlamys farreri)和合浦珠母贝的BMP2在鳃和外套膜中表达量高[8,10]。原位杂交结果显示BMP2基因在合浦珠母贝外套膜外侧上皮和外褶的内侧上皮高表达[8]。合浦珠母贝BMP7在鳃和外套膜中的表达量远高于其他组织[12]。本研究结果表明BMP7b在合浦珠母贝各组织中均有表达，在鳃和外套膜的表达量均显著高于其他组织，说明BMP7b功能广泛。鳃是双壳贝类呼吸和滤食的主要器官。BMP7b在鳃中表达量高，揭示其可能参与了合浦珠母贝呼吸和滤食作用。外套膜能分泌基质蛋白，调控晶体在胞外生长，是形成贝壳的主要器官[14]。BMP7b在外套膜中的高表达，说明其可能参与了贝壳的形成。另外，缺刻实验第24小时，BMP7b在外套膜中的表达量显著增加，推测BMP7b参与了贝壳的损伤修复。合浦珠母贝BMP2和BMP10可能也参与了贝壳的损伤修复。缺刻第6小时，BMP2在外套膜的表达量上升[22]；第24小时BMP10在外套膜的表达量上升[11]。
双壳类动物具有相似的贝壳发生过程，贝壳的发生起始于胚胎发育早期。KIN等[23]将双壳类壳形成区的发育划分为5个阶段：1)壳生成细胞X的确定；2) X的后代细胞在背部表面的扩增；3)壳形成区内陷；4)壳形成区外翻并将胚胎包被；5)分泌壳基质和钙化。刺牡蛎(Saccostrea kegaki)在原肠胚形成时期，壳形成区内陷，随后外翻并不断扩大直至将整个胚胎包被，接着壳基质分泌并钙化，与此同时在背部形成铰合部而将贝壳分为2片，至此双壳类的Ⅰ期胚壳(prodissoconch I)完全形成。随着面盘的形成，Ⅱ期胚壳(prodissoconch Ⅱ)继续形成[24]。合浦珠母贝贝壳在担轮幼虫阶段开始形成Ⅰ期胚壳，随后在D形幼虫期形成Ⅱ期胚壳[25]。贝类的Dpp与哺乳动物BMP2/4同源[26]，Dpp调控了贝壳的发生过程[23]。在本研究中，BMP7b在合浦珠母贝5个时期都有表达，在担轮幼虫期表达量显著高于其他时期(P<0.05)，说明BMP7b可能在胚壳形成过程中起重要作用。
综上所述，本研究在合浦珠母贝中获得了BMP7b基因cDNA。分析显示BMP7b可能在合浦珠母贝贝壳形成和修护过程中起重要作用。
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图 1 合浦珠母贝BMP7b基因克隆及氨基酸序列分析
TGF-β前肽结构域用下划线表示，灰色部分表示TGF-β结构域，方框表示保守的半胱氨酸残基
Figure 1. Cloning and amino acid sequence analysis of P.fucata BMP7b
The pro-domain is underlined and TGF-β domain is marked in gray; the conserved cysteine residues are boxed and marked in gray.
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图 2 基于不同物种BMP7同源蛋白的进化树
Figure 2. Phylogenetic tree based on BMP7 homologous proteins of different species
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图 3 合浦珠母贝BMP7b在不同组织中的表达情况
M. 外套膜；Go. 性腺；Gi. 鳃；Hep. 肝胰腺；Hem. 血淋巴；I. 肠；A. 闭壳肌；垂直线表示平均值±标准差(n=3)，不同字母表示差异显著(P<0.05)，后图同此
Figure 3. Relative expression level of BMP7b in different tissues of P.fucata
Go. gonad; M. mantle; Gi. gill; Hep. hepatopancreas; Hem. hemolymph; I. intestine; A. adductor muscle. Vertical bars are represented as $ \overline X \pm {\rm SD}$ (n=3). Different letters above bars indicate significant difference (P<0.05). The same case in the following figures.
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图 4 合浦珠母贝BMP7b在不同发育时期的表达情况
T. 担轮幼虫；D. D型幼虫；Mu. 壳顶中期；Pu. 壳顶后期；Me. 变态期
Figure 4. Relative expression level of BMP7b at different developmental stage of P.fucata
T. trochophore; D. D-religer; Mu. middle umbo larvae; Pu. post umbo larvae; Me. metamorphosis
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图 5 BMP7b在贝壳缺刻处理后不同时间的相对表达量
Figure 5. Relative expression level of BMP7b at different times after shell incision processing
表 1 实验所用引物
Table 1 Sequences of primers used in this study
引物名称
primer序列 (5′ – 3′)
sequence用途
applicationS1 CGATGCGTACTATTGTGAT 目的片段扩增 A1 ATTCCGATACCCTATTTCC 目的片段扩增 S2 TGGCGTGATGCTTACTA 目的片段扩增 A2 TGGATACTTCGTTGGGT 目的片段扩增 S3 CAAATAGCAGGCGATAG 目的片段扩增 A3 TGGTCCGTAAGAGAAGA 目的片段扩增 5′GSP-out AACTTCAATACGCTGGTCCG 5′RACE 5′GSP-in CCGCTTCTCCAGCACTAATGTCG 5′RACE 3′GSP-out CTGGATTATCGCCCCTGAG 3′RACE 3′GSP-in AAGTTGTGCTGTGTCCCCT 3′RACE qRT-S TCAAACGCACGAACGAT qRT-PCR qRT-A TGAGGGGACACAGCACA qRT-PCR 18S TGTCTGCCCTATCAACTTTC qRT-PCR 18A TGTGGTAGCCGTTTCTCA qRT-PCR 
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