超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)和过氧化物酶(POD)被FRIDOVICH等国内外学者^[1-4]统称为保护酶系统。细胞内自由基的产生与消除是因为SOD、CAT及POD 3种酶协调一致，处于一种动态平衡状态，使自由基维持在一个低水平，从而防止自由基毒害，一旦这种平衡受到破坏，就可能产生伤害作用。所以研究保护酶活性在药物胁迫下发生的变化可以作为灵敏指示动物受药物胁迫的生化指标，尝试以这些抗氧化防御系统成分的变化作为氧化胁迫的生化指标的研究，正在成为毒理学研究的新热点，而国内这一领域的研究较少^[5-7]。

三唑磷是一种有机磷农药，曾经作为有机氯的替代产品在我国农林业生产、水产养殖业中作为杀虫剂广泛使用。它在浙江沿岸，主要用于池塘的清理，杀灭大型甲壳类，其杀灭作用强，但残留时间较长，有时候在虾蟹饲养过程中也用三唑磷控制桡足类的大量繁殖。1996年以来，由于三唑磷污染造成死虾、死鱼、死贝的事故时有发生^[8]，其对海洋生物资源、水产养殖品种和生态环境的影响颇令人担忧，已引起有关专家的重视。本文通过研究日本体内不同组织保护酶系统在三唑磷长期胁迫下发生的变化，以期为水环境污染程度的评估以及农药的正确使用提供基础资料。

1.   材料与方法

1.1   实验材料

本实验所用的日本购自宁波市大世界农贸市场，为同一批个体，规格整齐(6.5 ~7.0 cm)×(4.5 ~5.0 cm)。毒性实验在75 cm×40 cm×15 cm塑料箱中进行，内盛海水6 L。试验海水为鄞州区育苗场经沉淀、过滤自然海水。三唑磷是浙江仙居农药厂生产的浓度为20%的三唑磷乳油。

1.2   实验设计和方法

1.2.1   毒性实验

首先采用常规急性毒性实验的方法以确定三唑磷对日本的安全浓度。蟹(平均体重139.8 g)买来后立即置水族箱中暂养，暂养期间用充气泵充气，每日换水1次，并淘汰掉活力不强、四肢不全的个体，暂养3 d后开始药浴。根据预备实验设置5个浓度组(原液浓度)，分别为0.25、0.5、1.0、2.0、4.0 mg · L^-1，另外设1个对照组，并各设1个平行组。每个塑料箱中随机放入20个日本，实验期间不投饵，连续充气，水温10℃，盐度22.4左右。每12 h换同浓度药液1次，分别记录24、48、72、96 h死亡和存活数，并及时取出死亡个体，以直线内插法求出24、48、72、96 h半致死浓度，并按照96 h LC₅₀×0.1计算出安全浓度。

1.2.2   药物积累试验

根据急性毒性实验的结果，把三唑磷对日本的安全浓度(0.27 mg · L^-1)设置为试验浓度。实验设1个药浴组和1个对照组，并各设1个平行组，实验期间管理同急性毒性试验，以实验组中不出现死亡为准，16 d后终止试验。

1.2.3   样品处理

从毒性实验开始的当日起，每2 d取样1次，每组取4只个体(2雌2雄)，活体解剖，分别取出肌肉，鳃、肝胰脏，心脏、性腺等组织器官，用生理盐水洗过后放进-70℃冰箱备用。测量前取出组织称重，按0.1 g组织加入0.5 mL磷酸盐缓冲液(pH=7.0)的比例，放入玻璃匀浆器在冰浴条件下研磨，然后置冰冻离心机内以14 000 r · min^-1的速度离心25 min，然后取其上清液进行酶活性测定。另取暂养后的健康蟹10只用来分析日本体内保护酶系统，样品处理方法同上。

1.2.4   酶活性测定

SOD活性测定采用FRIDVICH^[1]建立略有改进的氮蓝四唑光化学反应法，一个SOD活力单位定义为能引起反应初速度(指不加酶时)半抑制时的酶用量；CAT活性采用紫外吸收法测定，以1 min内吸光度减少0.1的酶量为一个酶活单位；POD活性参照蒋继宏等^[9]方法，略有改进，以每分钟光密度变化值来表示酶活性的大小。每个样品做5个平行，取其平均值。

1.2.5   数据处理

以“酶活单位”表示酶活性的大小，为了更清楚表示药物作用下酶活性的变化，去除饥饿等其它因素对酶活力的影响，用酶比活力(酶活单位相对值，即把处理组酶活单位同对照组酶活单位进行比较)表示酶活性变化。数据处理采用SPSS统计软件。

2.   实验结果

2.1   急性毒性试验结果

急性毒性试验结果见表 1。

表  1  三唑磷对日本半致死浓度和安全浓度

Table  1.  LC₅₀ and safe concentration of triazopnios on C.japonica  mg · L^-1

影响 effect	浓度 concentration		影响 effect	浓度 concentration
24 h半致死浓度 LC50(24 h)	8.76		96 h半致死浓度 LC50(96 h)	2.70
48 h半致死浓度 LC50(48 h)	5.94		安全浓度safe concentration	0.27
72 h半致死浓度 LC50(72 h)	3.94

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2.2   三唑磷对日本体内SOD活性的影响

试验期间对照组日本体内SOD酶活性见表 2，三唑磷作用下酶的变化见图 1。从图 1可知，在三唑磷胁迫下，鳃中SOD活性在第8天表现出明显的刺激作用，峰值达457.4%，其余时间比较平稳；肝胰脏中SOD曲线变化比较大，实验前10 d表现出刺激作用，从第12天开始出现抑制效应；心脏曲线自始至终都维持在对照组水平；肌肉中SOD活性变化曲线类似于心脏，但在第2天表现出轻微的刺激作用；性腺中的曲线在第2天表现出强烈的刺激效应(502.2%)，其后便趋向平稳，维持在对照组水平。

表  2  SOD酶活性变化

Table  2.  SOD activities of C.japonica  U · (g · mL)^-1

5种组织five tissues	时间/d time
	0	2	4	6	8	10	12	14	16
鳃(对照/试验) gill(control/test)	73.89/ 75.41	68.95/ 48.56	91/ 74.82	58.79/ 56.24	49.75/ 122.32	116.56/ 137.63	107.43/ 144.36	118.07/ 141.36	120.3/ 86.74
肝胰脏(对照/试验) hepatopancreas (control/test)	30.29/ 29.29	27.16/ 35.74	27.34/ 35.12	24.9/ 49.55	251.16/ 62.54	24.83/ 60.33	154.61/ 80.64	114.78/ 39.66	135.8/ 28.25
心脏(对照/试验) heart(control/test)	160.58/ 160.84	160.92/ 151.55	186.35/ 253.83	166.67/ 147.13	26.75/ 214.49	269.3/ 263.17	300.14/ 243.82	227.86/ 282.62	229.68/ 247.11
肌肉(对照/试验) muscle(control/test)	82.22/ 86.22	77.6/ 74.04	79.68/ 72.07	84.08/ 91.32	111.24/ 139.78	136.07/ 145.64	170.88/ 155.23	124.4/ 143.09	109.87/ 94.27
性腺(对照/试验) sex gland(control/test)	42.58/ 46.58	42.92/ 165.13	174.48/ 298.35	251.84/ 377.14	339.58/ 324.32	409.68/ 572.06	613.9/ 431.03	238/ 414.79	224.6/ 288.15

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图  1  三唑磷对日本 SOD比活力的影响

Figure  1.  Effects of triozopnios on SOD relative activities of C.japonica

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2.3   三唑磷对日本体内CAT活性的影响

试验期间对照组日本体内CAT酶活性见表 3，三唑磷作用下酶的变化见图 2。在三唑磷作用下，鳃中CAT变化曲线在实验前10 d基本稳定，第10~12天表现明显的抑制效应，从第14天开始又表现刺激作用，至实验结束时和对照组基本持平(111.8%)；肝胰脏对药物比较敏感，曲线上下波动比较大，交替出现刺激和抑制作用，但实验后半程的曲线相对前半程波动较小；心脏中CAT活性变化曲线和SOD曲线相似，无较大变化；肌肉中曲线在实验前8 d变化明显，第2天出现1个显著的应激反应，CAT活性为对照组的483.8%，从第10天开始逐渐平稳，第16天又开始表现轻微的刺激作用；性腺中曲线呈紊乱态势，但实验后期(第10天~第16天)相对于前期波动较小，相对稳定，且前期的刺激作用明显(428%)。

表  3  CAT酶活性变化

Table  3.  CAT activities of C.japonica  U · (g · mL)^-1

5种组织five tissues	时间/d time
	0	2	4	6	8	10	12	14	16
鳃(对照/试验) gill(control/test)	14.71/ 16.71	12.87/ 19.02	11.22/ 11.12	6.63/ 7.63	5.88/ 8.71	6.78/ 7.39	8.16/ 2.21	9.52/ 15.6	11.78/ 13.17
肝胰脏(对照/试验) hepatopancreas (control/test)	66.64/ 66.67	66.74/ 16.69	23.05/ 3.32	23.05/ 49.19	126.63/ 120.24	156.29/ 74.33	69.57/ 121.81	64.67/ 98.21	96.75/ 63.52
心脏(对照/试验) heart(control/test)	38.64/ 36.63	50. 62/ 53.99	30.98/ 18.10	20.65/ 17.62	42.41/ 31.26	30/ 26.49	23.11/ 26.55	28.34/ 34.81	32.28/ 43.06
肌肉(对照/试验) muscle(control/test)	10.11/ 11.00	9.06/ 29.32	19.93/ 9.45	15.99/ 6.40	11.12/ 17.99	13.05/ 9.44	11.2/ 11.45	9.93/ 11.80	10.13/ 19.88
性腺(对照/试验) sex gland(control/test)	73.92/ 93.82	17.96/ 54.97	14.8/ 63.37	14.14/ 53.47	12.46/ 19.33	54.32/ 46.67	46.92/ 32.94	18.5/ 14.36	18.96/ 39.84

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图  2  三唑磷对日本 CAT比活力的影响

Figure  2.  Effects of triozopnios on CAT relative activities of C.japonica

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3.   讨论

3.1   5种组织中保护酶系统分析

本实验中检测了日本肌肉、鳃、肝胰脏、心脏和性腺等5种组织器官，但是只检测到SOD和CAT的活性，无论是在对照组和药浴组都未检测到POD的活性。经t检验，SOD和CAT活性分布具有较大的组织特异性(P < 0.01)，这和孔祥会等^[13]的研究结果相同。其中心脏中SOD活性远高于其它4种组织；鳃和肌肉的SOD活性相当，约为心脏中的1/2；其次为性腺，约为心脏的1/4；肝胰脏中的SOD活性为最低，其值仅为心脏的1/5；CAT活性按由高到低的顺序依次排列为：性腺>肝胰脏>心脏>鳃>肌肉。性腺中CAT活性最高，分别是肝胰脏的1.5倍，心脏的2.5倍，鳃的6倍，肌肉的9倍。

关于甲壳动物POD的研究并不多见，仅见有关鱼和昆虫的报道^{[2-4, 10-14]}。本实验未在日本体内检测到POD的活性，原因可能有三：(1)日本是一种比较低等的动物，其体内确实不存在POD，这种可能性最大；(2)日本体内除了这5种组织以外的其它组织细胞中存在POD；(3)POD可能以酶原形式存在于日本体内，但本实验中任何一种药物的浓度都未达到足以激活此酶原的水平，所以未能测出。

3.2   5种组织对三唑磷敏感性分析

从实验结果可以看到，5种组织中对三唑磷最为敏感的组织是肝胰脏、性腺和鳃(F^*>F_0.05，P < 0.05)，肌肉和心脏比较稳定，这和白洁等^[15]、唐学玺和张培玉^[16]、贾秀英和陈志伟^[17]的研究结果相似。组织对毒物的敏感性不同和各组织结构以及所执行的功能有关。鳃是日本重要的呼吸器官，也是最先接触到药物的组织；肝胰脏是日本营养消化吸收的场所，也是重要的解毒器官；性腺是动物的生殖器官，承担着卵子、精子的营养和发育功能，对营养的需求非常高，所以对药毒物十分敏感。所以，鳃、肝胰脏和性腺是生物受外界因素胁迫的重要靶器官。心脏主要承担着血液的运输功能，肌肉主要参与生物体的运动，两者不参与吸收代谢，所以不是毒物主要攻击的靶器官，其组织细胞保护酶系统相对较稳定。

此外，同一组织中SOD和CAT活性在三唑磷胁迫下的变化趋势也不尽相同，这说明机体的保护酶系统是一个相互制约、协同作用的有机整体，它们可以达到一种动态的平衡以抵御外界的损害。

3.3   药浴时间对保护酶活性的影响及其机制

药浴时间的长短对酶活性的影响不同，组织细胞酶活性的大小是药物作用和保护酶系统自身防御共同的结果。肝胰脏、性腺中SOD和肌肉中CAT在实验前2 d和对照组相比均有不同程度的升高，然后逐渐降低，到实验结束时大部分酶活性已经基本和对照组的相当，但有的仍在波动中(图 1、图 2)。STEBBING^[18]认为毒物在低浓度下出现的这种增益现象是其在无毒情况下的刺激效应，把这一现象称为“毒物兴奋效应”。许多研究证明“毒物兴奋效应”具有普遍性，本实验也证明了这一点。

动物细胞在低浓度毒物的胁迫下产生大量的自由基，保护酶SOD、CAT活性也在自由基的诱导下随之升高，以清除过量的自由基，因此便出现了酶活性在处理2 d后逐渐升高并超出对照组水平的现象。但自由基反应速度非常快，有些未得到及时清除的自由基就对细胞产生了伤害，细胞结构也受到一定程度的损伤。此外，当毒物长时间作用于机体后，大量的活性氧中间体超过了机体清除活性氧的能力，结果大量的活性氧中间体作用于酶蛋白质分子的关键性氨基酸残基，使酶活性受到抑制，即把CAT上的-SH巯基氧化成SO₂，从而改变CAT的结构，抑制其活性。因此，酶活性又会逐渐回落。国内外大量研究证明^{[7, 16-17, 19-20]}，低度污染胁迫下的生物机体SOD、CAT的活性显著上升，但随着毒物浓度的升高，或者暴露时间的延长其活性又被显著抑制。

随着实验时间的延长，受毒物胁迫低的细胞在生物体内各种酶机制的相互作用下还可以渐渐恢复到对照组的水平，如性腺中CAT和SOD以及肌肉中CAT，这说明机体本身对外界的轻微胁迫具有一定的防御能力，生物体可以通过调节抗氧化酶的水平来增强其清除活性氧的能力，以减轻污染物的伤害。但是，肝胰脏中SOD和CAT的活性都表现出了不同程度的紊乱，说明这些组织的细胞已经受到了较深的毒害，不能恢复到对照组的水平，同时也说明机体对抗外界环境污染胁迫的能力是有限的，一旦污染物超过某一限度，便会导致细胞代谢失调和细胞结构的破坏^[21]。

4.   结语

日本体内的保护酶系统由SOD和CAT组成，组织间分布具有显著特异性，没有检测到POD的活性；三唑磷对日本鳃、肝胰脏和性腺保护酶的影响比较大，肌肉和心脏中的保护酶较为稳定。

毒理学研究者一致认为，污染物对生物体的作用归根结底是在分子水平上进行的，是污染物分子和生物大分子的相互作用引起的。保护酶的变化是污染物在生物体内代谢过程中与生物大分子相互作用的一种表现，要想对毒害机制做进一步的研究必须利用生物化学或分子生物学的方法。