Preliminary study on the neuro-fuzzy optimization model in the polyculture system of Gracilaria tenuistipitata v. and Penaeus monodom
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摘要:
根据2003年4月~2004年9月在广东省海丰县联安镇江蓠-对虾鱼塭混养试验所得调查数据, 采用神经-模糊系统作为非线性逼近工具, 建立了虾藻混合养殖过程中各生物和水环境因子之间非线性关系的神经-模糊系统模型。以鱼塭水环境中可溶性无机氮DIN≤0·2mg·L-1作为富营养化限制标准, 模型模拟出了对虾不同养殖阶段混养江蓠所需的最低理论生长速率。其结果较好地反映了混养系统中江蓠的实际生长速率对水环境中DIN所产生的影响。
Abstract:Based on the survey data in polyculture pond system of Gracilaria tenuistipitata v. and Penaeus monodom in Lian′an town Haifeng county Guangdong province, China from April 2002 to September 2003, a neuro-fuzzy system model was developed to describe the non-linear relationships among the biological and physicochemical factors in pond in different growth phase of Penaeus monodom. The model simulated the theoretic lowest growth rate of Gracilaria tenuistipitata v. in different growth phase of Penaeus monodom within the eutrophication restrict criteria of dissolved nitrogen in water DIN≤0.2 mg·L-1. The simulated results well reflected the effect of actual growth rate of Gracilaria tenuistipitata v. on the DIN in polyculture pond system.
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Keywords:
- Gracilaria tenuistipitata v. /
- Penaeus monodom /
- polyculture /
- neuro-fuzzy system
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凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)，又称南美白对虾，自然分布在东太平洋美洲沿岸，1987年引进中国。由于凡纳滨对虾肉质鲜美、盐度适应范围广，适合人工高密度养殖，为世界三大高产虾之一[1]。20世纪90年代中期，凡纳滨对虾以其抗病力强、生长迅速等优点成为中国重要的海水养殖品种。近几年来，随着凡纳滨对虾在中国养殖规模的迅速扩大，从业者盲目发展，特别是在虾苗的生产中，对亲虾的来源不加选择，造成群体遗传性状的变异，一些优良性状丢失、品质下降、生长缓慢。为了恢复和优化种质，有效解决人工养殖过程中出现的病害流行、个体小型化、产量和质量下降等问题，中国先后进行了多次原始种的引种。在这种情况下，有必要对引进品种的种质资源及引种后的人工繁殖、选择育种对群体遗传多样性水平的影响进行了解，为今后合理开发、保护和利用凡纳滨对虾的种质资源以及遗传改良奠定基础。
AFLP(amplified fragment length polymorphism)技术[2]作为一种新型的分子标记，具有信息量大、灵敏度高和多态性丰富等优点。AFLP技术可以在对研究对象基因组序列了解甚少的情况下，利用少量引物检测到大量的有效位点进行分析[3]。在对虾类中，目前应用AFLP标记技术已经构建了日本对虾(Marsupenaeus japonicus)和斑节对虾(Penaeus monodon)的连锁图谱[4-5]、中国对虾(Fenneropenaeus chinensis)抗病选育群体的遗传变异分析[3]。此研究利用AFLP标记技术对凡纳滨对虾6个养殖群体的遗传变异水平进行探讨，旨在从分子水平上分析中国凡纳滨对虾种质资源的现状，为下一步开展凡纳滨对虾遗传育种研究工作提供理论依据。
1. 材料与方法
1.1 试验材料
2007年4月，取自美国夏威夷引进的凡纳滨对虾亲虾30尾，并在广东省雷州半岛选取东方、海星、旭明、乾塘和广益虾苗场的凡纳滨对虾育种群体各30尾，于95%的乙醇中固定和保存。基因组DNA提取方法参考《分子克隆实验指南》[6]。来自东方、海星和旭明虾苗场的凡纳滨对虾在当地普遍表现出较好的养殖性状，来自乾塘虾苗场的群体的生产性状代表当地正常水平，一个生长速度性状严重退化，即将被淘汰的群体样品来源于广益虾苗场的虾苗。
1.2 AFLP反应
试验方法参照VOS等[2]的方法。选用EcoRⅠ和MseⅠ限制性内切酶，内切酶和连接酶均购自New England Biolab公司。引物及接头由上海生物工程有限公司合成。选择性扩增使用了8种EcoRⅠ引物和8种MseⅠ引物共64个引物组合，根据预试验结果，从中筛选重复性好、多态性较高的6对引物组合进行正式扩增反应。扩增产物在6%变性聚丙烯酰胺凝胶上进行100 W恒功率电泳。染色程序参考《分子克隆实验指南》[6]银染方法。在显色终止、漂洗之后进行拍照、记录、分析。
1.3 数据统计与分析
首先按电泳图谱中扩增条带的有无，每个DNA片断视为一个分子标记，在同一位点，当AFLP谱带存在时赋值为“1”，不存在时赋值为“0”，将整个分子标记图谱转化成“0”和“1”的数字矩阵。利用POPGENE 1.31软件[7]，计算以下遗传参数。
Nei(1973)平均基因多样性指数：
H=1 -∑Pi2，Pi2为单个位点上等位基因的频率；
Nei(1972)群体间遗传相似性系数：
I=∑ (XiYi) /﹛∑ (Xi)2∑ (Yi) 2﹜1/2
其中Xi、Yi分别为X和Y群体第i个位点的等位基因频率；
群体间Nei(1972)遗传距离：DA=1－lnI
加上偏差较正后Nei(1978)：
I=(2n－1)∑ (XiYi)/﹛∑ [2n(Xi)2－1]∑ [2n(Yi)2－1]﹜1/2
其中Xi、Yi分别为X和Y群体第i个位点的等位基因频率；
群体内shannon多样性指数：H0=－∑ (XilnXi)/N
其中Xi为位点i在某一群体中出现的频率，ln为自然对数，N为所测座位数；
采用ARLEQUIN 2.000软件[8]，计算以下遗传参数以及进行分子方差分析(AMOVA)；
群体遗传分化指数：Fst=σ2P/P (1-P)，P为某等位基因在整个群体中的平均频率；σ2为该等位基因在分群体之间的方差。
用MEGA 3.0软件[9]基于Kimura 2-parameter模型进行群体间、群体内遗传距离以及所有个体间的平均遗传距离的计算，并进行聚类分析，各分支结点上的数字均为1 000次重复检验(bootstrap test)得到的该结点的支持率。
2. 结果
2.1 AFLP扩增结果
采用6对AFLP引物组合对6个凡纳滨对虾育种群体共180尾个体进行比较分析，共统计了410个DNA条带，结果见表 1。各引物组合之间的扩增效果之间存在一定差异，扩增片段大小在0.1~1.2 kb之间。6对引物组合共扩增出287条多态性条带，多态比例69.90%。平均每对引物组合扩增出68.33条带，其中47.83条带呈现出多态性。
表 1 6对AFLP引物组合的检测结果Table 1. Amplification results of six AFLP primer combination sets物组合
primer pair总带数
total bands单态性条带数
monomorphic bands多态性条带数
polymorphic bands多态带百分数/%
percent of polymorphic bandsE-AGC/M-CTG 73 18 55 75.34 E-ACT/M-CAG 60 17 43 71.67 E-ACT/M-CTT 64 23 41 64.06 E-ACT/M-CTG 80 23 57 71.25 E-AGC/M-CAG 67 28 39 58.21 E-AGG/M-CTG 66 14 52 78.79 合计 total 410 123 287 平均 average 68.33 20.50 47.83 69.90 2.2 6个群体的遗传多样性
通过6对AFLP引物扩增图谱分析，得到凡纳滨对虾6个育种群体的遗传多样性指数见表 2。多态位点百分数处于68.39%~71.20%之间，不同群体间大小顺序为广益>进口>东方>旭明>乾塘>海星。平均基因多样性指数处于0.2020~0.2495之间，不同群体间大小顺序为进口>乾塘>东方>海星>旭明>广益，Shannon多样性指数大小排序与平均基因多样性指数相同。
表 2 凡纳滨对虾6个群体的遗传多样性Table 2. Genetic diversity of the six L.vannamei stocks群体
stock多态位点/%
percent of
polymorphic bands平均基因多样性
average gene
diversity Shannon多样性指数
Shannon diversity index群体内Fst指数
Fst index within
populations广益 Guangyi 71.20 0.2020 0.3551 0.18283 乾塘 Qiantang 69.29 0.2446 0.4126 0.17955 进口 Jinkou 70.88 0.2495 0.4193 0.17822 东方 Dongfang 70.27 0.2341 0.3991 0.17961 海星 Haixing 68.39 0.2286 0.3944 0.17904 旭明 Xuming 69.37 0.2024 0.3627 0.17956 2.3 6个群体间遗传相似性和遗传距离
根据Nei计算所得群体间遗传相似性系数和遗传距离见表 3。偏差校正后，不同群体间的遗传相似性系数为0.8479~0.9622，遗传距离为0.0385~0.1651。
表 3 Nei遗传相似性系数(左上角)及及遗传距离(右下角)(1978)Table 3. Nei′s genetic identity (above diagonal) and genetic distance (below diagonal) of the six L.vannamei stocks广益 乾塘 进口 东方 海星 旭明 广益 Guangyi － 0.9622 0.8813 0.8479 0.9060 0.8803 乾塘 Qiantang 0.0385 － 0.9376 0.9067 0.9366 0.8955 进口 Jinkou 0.1263 0.0644 － 0.9540 0.9250 0.8995 东方 Dongfang 0.1651 0.0979 0.0470 － 0.9492 0.9026 海星 Haixing 0.0988 0.0655 0.0780 0.0521 － 0.9362 旭明 Xuming 0.1275 0.1103 0.1059 0.1025 0.0659 － 2.4 6个群体间的遗传分化
配对比较Fst值见表 4，其中每个Fst值对应的P < 0.01，在表中不再单独列出。WRIGHT[10]认为，Fst在0~0.05之间表示群体间遗传分化微弱；0.05~0.15之间表示群体遗传分化中等；0.15~0.25之间表示群体遗传分化较大；当Fst大于0.25时，表示遗传分化极大。此研究的6群体间Fst值最小为0.07693，最大0.29164，表明6群体间遗传分化已逾越遗传分化中等的底线，而广益群体与进口群体间已有极大的遗传分化。
表 4 凡纳滨对虾6个群体间配对比较的Fst值Table 4. Pairwise comparison of Fst values of the six L.vannamei stocks广益 乾塘 进口 东方 海星 旭明 广益 Guangyi － 乾塘 Qiantang 0.07693 － 进口 Jinkou 0.23437 0.12941 － 东方 Dongfang 0.29164 0.19629 0.08660 － 海星 Haixing 0.19875 0.14053 0.14988 0.11037 － 旭明 Xuming 0.24058 0.22358 0.21940 0.21068 0.13431 － 分子方差分析(AMOVA)结果表明，群体间方差占总方差的17.98%，而群体内方差占总方差的82.02%(表 5)，说明选育群体的遗传变异大部份来源于群体内个体间的遗传差异。
表 5 6个凡纳滨对虾群体的AMOVA结果Table 5. AMOVA result of the six L.vannamei stocks变异来源
source of variation自由度
df方差总和
sum of squares变异组分
variance components所占比例/%
percentage of variation群体间 among stocks 5 2 096.844 12.13394 Va 17.98 群体内 within stocks 174 9 631.000 55.35057 Vb 82.02 总和 total 179 11 727.844 67.48452 2.5 聚类分析
用MEGA 3.0软件对6个凡纳滨对虾群体进行聚类分析，得到UPGMA聚类树(图 1)，更为直观清晰地表明了6个群体之间的遗传关系。东方群体首先与进口群体聚为一支，再依次与海星、旭明聚为一大支，而广益与乾塘群体聚为另一支，这2支经过一段遗传距离最终聚在一起。
3. 讨论
中国的凡纳滨对虾养殖规模与产量已达到了前所未有的水平，但中国国内对于这一优良养殖虾类的遗传育种研究还亟待深入。对水生经济动物养殖群体与野生群体的研究表明，如果未经科学合理的选种育种，养殖群体经过累代的人为干预后，遗传变异水平会显著降低，或者养殖群体种质严重混杂出现良莠不齐，造成群体养殖性状的衰退[11-12]。凡纳滨对虾在中国没有天然的野生群体分布，各个育种(苗)场保种的亲虾是从国外不同地区、不同时间、不同批次引进的不同数量的凡纳滨对虾群体。因此，中国南方目前养殖的凡纳滨对虾根据虾苗来源可以分为进口苗和本地苗2种。进口苗是引进成熟种虾所繁殖的苗种，本地苗是进口苗在现有的养殖环境中留种再繁殖的后代。进口苗与本地苗在中国南方现有的养殖环境和养殖模式中，所表现出的生长性状与抗病能力有着明显的区别。进口苗具有较好的生长性状，生长速度快，养成规格均匀，养殖110 d可达60 ind · kg-1以内，但抗病能力较差。本地苗中的不同群体则分化严重，有部分群体生长与抗病能力都比较好，生长性状表现接近进口苗，而部分群体生长性状表现较差，生长速度缓慢，养成规格大小分化显著。所以，选择具有一定代表性的凡纳滨对虾群体进行遗传分析，是下一步种质改良和管理的重要科学技术基础。
采用AFLP技术对凡纳滨对虾遗传多样性进行研究的文献在此研究之前鲜有报道。PATRICIA和PEDRO[13]对一个封闭的凡纳滨对虾育种群体连续5代的遗传多样性采用RAPD方法进行监测，多态位点在第5~9代中分别为76.56%，71.88%，67.19%，68.75%和54.69%。李锋等[14]对2批次引进的凡纳滨对虾亲本采用RAPD方法进行比较，发现2批亲本的遗传多样性存在较大差异，其多态位点数分别为61.54%和50.52%。在AFLP分析中，多态条带百分比既与研究的样本来源及其数量有关，也与各个引物的扩增效率有关。岳志芹等[3]对中国对虾选育系4个群体各12个样本共48个样本，采用7对AFLP引物共扩增出350条带，多态位点比例为57.7%。此研究在正式扩增之前先做了大量的引物筛选，从64对引物组合中筛选出6对多态性高、稳定性好的引物组合，共对180尾凡纳滨对虾个体进行扩增，不同引物组合的多态带百分数在58.21%~78.79%之间(表 1)，平均多带条百分数为69.90%，笔者认为这个结果相当理想，可以有效地用于6个凡纳滨对虾群体的遗传多样性分析。
PATRICIA和PEDRO[13]对一个封闭的凡纳滨对虾育种群体连续5代的遗传多样性采用随机扩增DNA多态性(Random Amplified Polymorphic DNA, RAPD)方法进行监测，Nei遗传多样性h分别为0.267，0.259，0.242，0.253和0.216。张海琪等[15]对进口的凡纳滨对虾F1代和浙江本地品系2个群体各20尾样本进行比较分析，发现采用同工酶方法2群体间遗传相似系数为0.9968，Nei遗传距离为0.0032；同时采用RAPD方法得到2群体间的遗传相似度为0.9815，遗传距离为0.0185，在11条引物扩增得到的110条DNA谱带中，多态位点比例在浙江本地群体和引进群体中分别为50.19%和47.27%。在此研究中，进口群体的多态位点占70.88%，本地群体的多态位点在68.39%~71.20%之间；进口群体与本地群体间的遗传相似性系数在0.8813~0.9504之间，遗传距离在0.0470~0.1263之间，与PATRICIA和PEDRO[13]、李锋等[14]和张海琪等[15]的研究结果相似。
在此研究的6个凡纳滨对虾群体中，笔者通过采用多态位点百分数、平均基因多样性、Shannon多样性指数等指标来综合考察各个群体的遗传多样性水平。就多态位点而言，不同群体间大小顺序为广益>进口>东方>旭明>乾塘>海星，平均基因多样性指数在不同群体间大小顺序为进口>乾塘>东方>海星>旭明>广益，Shannon多样性指数大小排序与平均基因多样性指数相同，群体内Fst指数排序为广益>东方>旭明>乾塘>海星>进口。可以看到，虽然6个凡纳滨对虾群体的遗传多样性水平采用4种指标的排序并不完全严格一致，但是却表现出相近的变化趋势。比如，就平均基因多样性和Shannon多样性指数2个指标而言，进口群体在6个群体中为最大，就多态位点百分数而言仅次于广益群体，位居第二，而其群体内Fst指数则最小，这些排序说明进口群体在6个群体中具有较高的遗传多样性水平，本地群体的遗传多样性水平则有所降低。
在鱼类的育种过程中，选择育种过程造成群体内遗传多样性下降，管理不善则容易出现近交衰退而造成群体内遗传多样性的迅速降低[16]。目前世界上对凡纳滨对虾进行选育，并形成选育品系的只有美国夏威夷海洋研究所[17]。中国引入的凡纳滨对虾群体在引种初期一般均表现出优良生长速度，但随着养殖规模的扩大，与当地环境的融合，引入品系在各方面发生变化，一些特征因缺乏及时有效的选育而渐渐消失。出现这种现象的原因，笔者认为是由于生产单位通过个体选择的方法筛选留种、留种亲虾的筛选多数来自于某一池塘或某一群体，连续几代的重复筛选与使用，这些亲虾或其后代发生近亲交配的几率很高，从而使养殖种群越来越单一，一些处于杂合状态下的基因位点变为纯合。王鸿霞等[18]采用微卫星标记对10个亲代个体在繁殖中对子代的遗传贡献率进行检测，发现其中只有8个个体对子代群体的基因库有贡献，不同个体之间贡献率存在差别，最高为54.28%，最低为8.57%，另外2个个体对子代基因库没有贡献。因此，此研究中本地苗群体相对进口苗群体普遍表现出遗传多样性水平较低的现象是可以理解的。
在6个凡纳滨对虾群体的遗传多样性结果中值得注意的另一个问题是，就基因多样性指数和Shannon多样性指数而言，乾塘群体相对于东方、海星和旭明群体表现出较高的遗传多样性水平，广益群体相对于东方、海星和旭明群体表现出较低的遗传多样性水平。笔者认为，这种现象的出现可能是种质资源学中种质混杂和种质退化的反映。市场上引进种虾的来源、品系和种群背景混乱，如果没有科学的管理、分析与指导，各品系或种群不加控制地随意混合交配，使相对封闭的育种群体的遗传多样性出现增大现象，即出现种质混杂。混杂和退化是2个不同的概念。由于亲虾来源困难，在养殖育苗生产过程中，生产者为了降低成本，从养殖的凡纳滨对虾中挑取部分作为亲虾培育、进行育苗生产，从而导致养殖群体的遗传多样性水平下降，部分优良养殖性状丧失，表现为生长缓慢、抗病力低，即出现种质退化。此试验结果说明不同群体的遗传多样性存在明显的差异，这些基于遗传的差异是不同群体生长性状差异的原因之一。因此可以说，在育种实践过程中遗传多样性水平的高低变化是一把双刃剑，需要及时检测与科学管理，才能保证育种群体在改良养殖性状的同时尽可能地保持较高的遗传多样性水平。
目前，美国夏威夷海洋研究所从全世界不同地区收集及培育的凡纳滨对虾按生长、抗病力和对环境适应等的差异，划分并保存有500多个品系。中国大陆引进的凡纳滨对虾来自于美国夏威夷和中国台湾省2个地区，引进渠道主要在民间进行，不同的引进者曾先后在不同时间引进不同来源、品系和数量的种虾[17]。引种之后，各个育种(苗)场之间因为利益竞争关系而很少出现相互之间的育种群体交流。在此研究中，6个凡纳滨对虾群体间Fst值最小为0.07693，最大0.29164，表明6群体间遗传分化已逾越遗传分化中等的底线，而广益群体与进口群体间已有较大的遗传分化。在颉晓勇等[16]对于新吉富罗非鱼的遗传育种研究中，基础群体F0与选育群体第9代F9之间Fst值为0.07587，即经过连续9代的选择育种，第9代选育群体与基础群体间遗传分化已经逾越中等分化的底线(0.05)。因此，此研究中的6个凡纳滨对虾群体在传代的过程中已经各自形成了遗传上相对独立的体系。目前，中国有些凡纳滨对虾群体已经较好地完成了进口良种的本地化过程，若以它们作为育种材料，必将能提高中国凡纳滨对虾的养殖性能，而且成本比从美国进口凡纳滨对虾要低得多。因此，在下一步的凡纳滨对虾育种中，除了继续补充原产地材料外，最经济的方法是利用中国已有的凡纳滨对虾资源。
姚雪梅等[19]在中国海南省对SPF(无特定病原)凡纳滨对虾进口苗的子一代(F1)和子二代(F2)养殖性状进行比较发现，F1代适应力与成活率随着养殖时间逐渐提高，但养殖90 d时成活率只有17.7%，而F2代成活率高达67.2%，证明进口群体虽然具有生长速度快的优势，但还需要一个本地化的过程才能在中国的养殖环境中表现出优良的生产性状。ARGUE等[20]发现凡纳滨对虾的生长与适应力呈现出负相关，通过对引进种的选择和驯化出现新的表型性状，最为明显的是适应力提高与生长速度变慢。特别值得注意的是，姚雪梅等[21]在中国海南以SPF凡纳滨对虾引进群体建立自交系F1和F2，与海南经过若干代养殖后选育的凡纳滨对虾群体进行杂交试验，对比发现凡纳滨对虾杂交代具有生长和存活双重优良性状，杂交优势显著，与自交系相比，杂交使生长速度和存活率2个表型性状都得到了改良。此研究中6个群体之间已形成了遗传上相对独立的体系，根据聚类分析的结果，选择亲缘关系较远的群体进行杂交，也是一条值得考虑的种质利用途径。
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图 1 模型对应测试数据集的DIN模拟结果与实测值的比较
Figure 1. Comparison of DIN from model calculated and field survey
表 1 构建模型的数据集
Table 1 Data for model construction
时间time鱼塭
pond温度/℃
temperature盐度
salinity透明度/m
transparencyDO
/mg·L-1对虾体长/cm
shrimp length江蓠月增长量/g·m-2
monthly increasing biomassDIN
/mg·L-1训练数据集 training data 2003-5 对照塭 26.1 19.5 0.8 6.3 4.8 0 0.310 2003-6 试验塭 28.2 18.7 0.8 6.5 8.3 180 0.322 2003-6 对照塭 28.5 18.4 0.7 6.3 7 0 0.312 2003-7 对照塭 27.5 16.8 0.8 6.2 12.6 0 0.246 2003-8 试验塭 28.3 12.4 0.8 6.7 15.4 350 0.175 2003-9 对照塭 28.8 15.2 0.7 6.3 14.4 0 0.244 2004-4 对照塭 24.7 20.9 0.7 6.5 1.7 0 0.248 2004-5 对照塭 25.9 19.1 0.7 6.6 5 0 0.264 2004-6 试验塭 27.8 18.4 0.7 6.4 8.2 540 0.101 2004-6 对照塭 28.2 18.2 0.7 6.3 7.1 0 0.259 2004-7 试验塭 27.4 15.6 0.6 6.5 14.6 570 0.103 2004-7 对照塭 27.2 15.7 0.7 6.3 12.4 0 0.269 2004-8 试验塭 28.2 11.7 0.6 6.6 15.3 570 0.086 2004-9 试验塭 29.0 15.1 0.6 6.6 16.5 600 0.099 2004-9 对照塭 28.7 14.8 0.6 6.8 14.3 0 0.267 测试数据集 checking data 2003-5 试验塭 26.5 19.2 0.7 6.4 5.2 230 0.295 2003-7 试验塭 27.6 16.5 0.8 6.2 14.2 640 0.194 2003-8 对照塭 28.6 11.7 0.8 6.1 13.2 0 0.252 2003-9 试验塭 28.9 15.4 0.8 7.1 16.3 350 0.182 2004-4 试验塭 25.3 21.2 0.8 6.6 1.7 610 0.092 2004-5 试验塭 26.1 18.5 0.7 6.2 5.2 600 0.099 2004-8 对照塭 28.5 11.9 0.8 5.8 13.3 0 0.237 
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表 2 模型模拟出的对虾不同养殖阶段江蓠最低理论月生长量与实际生长量的比较
Table 2 Comparison of the theory lowest monthly growth rates from model simulating and field survey of sea moss during different shrimp culture period
g · m-2 月份
month对虾体长/cm
shrimp length最低理论月生长量
theoretic lowest monthly growth rate2003年实际月增长量
autual monthly growth rate in 20032004年实际增长量
autual monthly growth rate in 20044 2.0 500 - 610 5 5.2 329 230 600 6 8.3 319 190 540 7 14.4 364 640 570 8 15.4 360 350 570 9 16.4 254 350 600
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