凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei Boone)自1987年引入我国，已成为我国重要的养殖品种。对虾种苗质量的优劣，直接影响对虾养殖的生长速度与成活率，且关系到整个对虾养殖过程的成功与失败；但在苗种培育方面，仍存在育苗滥用抗生素以及使用违禁药物保苗等问题，在一定程度影响了对虾健康养殖的发展^[1]。在育苗过程中使用药物容易导致幼体变态时间长、种苗大小参差不齐、抗病力差、养殖过程中生长慢等问题^[2]。减少或避免在水产养殖中使用抗菌药已经成为人们关注的焦点^[3]。

近年来，国内大量文献报道了益生菌在海淡水鱼、虾、贝类养殖方面的实验研究，通过向养殖水体中加入益生菌来调节和改善养殖生态环境，控制和减少养殖动物病害的发生，已取得了很大进展^[4]。同样，使用益生菌来营造育苗水体良好的微生态环境，控制潜在病原发作，是可能减少抗菌药使用的一种措施^[5]。

迄今有关益生菌在育苗中应用的报道多见于贝类和蟹类。例如DOUILLE和LANGDON^[6-7]将细菌CA2作为饲料添加剂投喂太平洋牡蛎(Crassostrea gigas)幼虫，能促进幼体的生长；王绪峨等^[8]在扇贝(Pectinidae)的人工育苗水体中施加适量的光合细菌，结果池水中的氨氮(NH₄⁺-N)显著降低, 水质得以净化。NOGAMI等^[9]探讨了有益细菌在三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)育苗中的作用；阎斌伦等^[10]在中华绒螯蟹(Eriocheir sinensis)工厂化育苗中添加微生物制剂(光合细菌、芽孢杆菌)，明显降低了水体中的NH₄⁺-N、亚硝酸氮(NO₂^--N)和化学需氧量(COD)含量，提高了幼体变态率。

在对虾育苗中使用益生菌的报道多集中于光合细菌(Photosynthetic bacteria)的应用，而关于使用芽孢杆菌(Bacillus sp.)的报道却极少。游锦华和陈怡飚^[11]的实验结果表明，光合细菌能提高斑节对虾(Penaeus monndon)、日本对虾(P.japonicus) 和新对虾(Metapenaeus)育苗成活率和加快幼体变态；井树桂和庞金钊^[12]实践证明光合细菌用于中国对虾(P.chinesis)育苗具有明显的防治疾病的作用；崔竞进等^[13]用几株光合细菌混合菌液作为中国对虾苗期水质净化剂及辅助饵料的生产性试验，取得了改善水质、提高变态率及成活率的良好效果。潘康成等^[14]把芽孢杆菌应用到南美白对虾(凡纳滨对虾)的虾苗(体长0.2~0.3 cm)标粗实验，提高了成活率。刘建勇^[2]在凡纳滨对虾育苗中使用复合微生物制剂“甘菌露”，结果表明，以芽孢杆菌为主的微生物制剂可显著提高育苗成活率，改善水质和缩短变态时间。还未见有关芽孢杆菌和光合细菌一起应用于对虾育苗的报道。

本实验在完全不使用抗菌药的情况下，对2种益生菌(芽孢杆菌和光合细菌)在凡纳滨对虾育苗中的作用进行了研究。目的在于探讨不使用抗菌药的健康种苗培育技术，推动对虾养殖走向健康养殖的可持续发展的道路。

1.   材料和方法

1.1   实验材料和实验条件

实验用对虾无节幼体来自三亚某虾苗厂，其亲本为进口亲虾子二代，实验用益生菌产品——芽孢杆菌(利生健)和光合细菌，均为南海水产研究所生产。利生健是以枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)为主的复合微生物制剂，其枯草芽孢杆菌含量为1×10⁹ ind · g^-1；光合细菌浓度为1×10⁹ ind ·mL^-1。

实验用水为天然海水经砂滤后，用EDTA-钠盐和氟乐灵等预处理后备用。实验在0.5 m³水体的室内水泥池(112 cm×80 cm×60 cm)中进行，每个池放置2个气泡石用小气泵充气，池子上方用遮阳网调节光照强度，用GS-333型自动控温仪控制实验水温在30~31℃之间。盐度保持30~35。

1.2   实验方法和数据处理

采用随机分组法将育苗池分为5组，即实验组Ⅰ、实验组Ⅱ、实验组Ⅲ、实验组Ⅳ和对照组。每一组均设有2个重复。实验组每隔7 d按表 1施用微生物，芽孢杆菌(利生健)使用前先用过滤海水活化4~5 h；对照组未作任何处理。

表  1  益生菌使用量

Table  1.  The dosage of probiotics in different treatment mg · L^-1

益生菌probiotics	实验组Ⅰgroup 1	实验组Ⅱgroup 2	实验组Ⅲgroup 3	实验组Ⅳgroup 4	对照组control
芽孢杆菌(利生健)Bacillus sp.(‘lishengjian’)	1	5	1	0	0
光合细菌photosynthetic bacteria	0	0	10	10	0

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对照组和实验组在育苗过程中均不使用抗菌药，实验采用封闭式育苗方式，全程不换水。无节幼体入池前用HCHO(甲醛)和PVP-I(聚维酮碘)进行脱毒处理。幼体开口后根据不同发育阶段投喂适宜饵料，饵料品种有骨条藻、藻粉、BP(虾苗配合饵料，台湾滋丰公司产品)、虾片、车元(虾苗配合饵料，台湾博尚公司产品)、人工饵(虾苗配合饵料，台湾博尚公司产品)和卤虫等。投料管理与常规育苗相同。整个实验从无节幼体到仔虾P₁₄共24 d。

实验在每个发育阶段均进行取样计数，幼体入池当天(无节幼体期)、第7天(糠虾幼体M₁期)、第11天(仔虾P₁期)、第14天(仔虾P₄期)、第17天(仔虾P₇期)、第20天(仔虾P₁₀期)和第24天(仔虾P₁₄期)进行水质检测。pH测定采用标准pH电极法；COD测定采用碱性高锰酸钾法；NO₂^--N测定采用重氮-偶氮比色法；NH₄⁺-N测定采用纳氏试剂光度法；硫化氢(H₂S)测定采用Na₂S₂O₃标定法。

采用Excel软件和SPSS13.0软件对实验数据进行统计学分析，先对数据作单因素方差分析(ANOVA)，组间若有显著差异，再作Duncan′s多重比较，P＜0.05表示差异显著。

2.   实验结果

2.1   益生菌对育苗水体水质的影响

2.1.1   益生菌对育苗水体中pH的影响

实验期间pH值的变动情况见图 1。结果表明，实验组和对照组的波动都维持在较适宜范围，在育苗后期均有较大幅度的下降，但实验组Ⅲ和实验组Ⅳ仍然维持较高的pH，与对照组差异显著(P＜0.05)，实验组Ⅰ和实验组Ⅱ的pH值也高于对照组，但差异不显著。

图  1  实验过程中水体pH值变动情况

Figure  1.  The variation of pH value during the experiment

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2.1.2   益生菌对育苗水体中H₂S的影响

结果见图 2，从实验开始到幼体发育至P₇期间，各实验组和对照组均保持较低的H₂S含量，组间无明显差异，但到了幼体发育到P₁₀时，各实验组H₂S含量明显低于对照组，差异显著(P＜0.05)；到实验结束时，实验组Ⅱ、实验组Ⅲ和实验组Ⅳ的H₂S含量显著低于对照组(P＜0.05)，其中实验组Ⅳ的H₂S含量最低。

图  2  实验过程中水体H₂S含量变动情况

Figure  2.  The variation of H₂S concentrations during the experiment

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2.1.3   益生菌对育苗水体中COD的影响

结果见图 3，从实验开始到结束，各实验组和对照组育苗水体的COD基本接近；且随着幼体的发育，COD逐渐上升，到P₄时达到最高，随后稍微有所下降；各实验组和对照组变化规律相同，组间差异不显著。

图  3  实验过程中水体COD含量变动情况

Figure  3.  The variation of COD concentration during the experiment

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2.1.4   益生菌对育苗水体中NH₄⁺-N含量的影响

结果见图 4，从实验开始到结束，各实验组和水体中NH₄⁺-N的含量基本呈现逐渐增加的趋势，从P₁开始有较大幅度上升；但在实验后期(P₇以后)，各实验组NH₄⁺-N的含量开始低于对照组，其中实验组Ⅰ、实验组Ⅱ和实验组Ⅲ的NH₄⁺-N的含量与对照组差异显著(P＜0.05)。

图  4  实验过程中水体含量NH₄⁺-N变动情况

Figure  4.  The variation of NH₄⁺-N concentration during the experiment

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2.1.5   益生菌对育苗水体中NO₂^--N含量的影响

结果见图 5，从实验开始到幼体P₇期间，各实验组和对照组水体中NO₂^--N的含量均比较低，但在幼体发育到P₇时，对照组的NO₂^--N的含量有较大上升，与各实验组差异显著(P＜0.05)，到实验结束，各实验组NO₂^--N的含量也上升较快，但实验组Ⅲ和实验组Ⅳ的NO₂^--N的含量明显低于对照组、实验组Ⅰ和实验组Ⅱ(P＜0.05)。

图  5  实验过程中水体NO₂^--N含量变动情况

Figure  5.  The variation of NO₂^--N concentration during the experiment

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2.2   益生菌对各期幼体的成活率的影响

实验开始每个水池放入无节幼体10万尾，各个阶段幼体成活率见表 2。在幼体发育至糠虾至仔虾阶段，各实验组和对照组的幼体都有不同程度的黏附污物，在没有使用药物的情况下，通过加强营养，各实验组的幼体从糠虾幼体M₁期发育到仔虾P₁期的存活率平均为51.2%，而对照组只有28.3%。实验数据统计表明，当幼体发育至糠虾阶段时，各实验组成活率明显高于对照组，差异显著(P＜0.05)；最终育苗成活率实验组Ⅲ(32.5%)和实验组Ⅱ育苗成活率(27.5%)最高，与对照组(8.5%)差异显著(P＜0.05)。实验组Ⅰ和实验组Ⅳ育苗成活率也高于对照组，但差异不显著。

表  2  不同处理组各期幼体的成活率(平均值±SD)

Table  2.  Influences of different treatments on survival rate of L.vannamei larvae (means±SD) %

幼体期larval stage	实验组Ⅰgroup 1	实验组Ⅱgroup 2	实验组Ⅲgroup 3	实验组Ⅳgroup 4	对照组control
Z1	90.0±0.0	90.0±0.0	90.0±0.0	90.0±0.0	90.0±0.0
Z2	80.0±0.0	80.0±0.0	80.0±0.0	80.0±0.0	80.0±0.0
Z3	80.0±0.0	80.0±0.0	80.0±0.0	80.0±0.0	75.0±7.1
M1	70.0±0.0b	70.0±0.0b	70.0±0.0b	70.0±0.0b	60.0±14.1a
M2	55.0±7.1	60.0±0.0	55.0±7.1	55.0±7.1	42.5±17.7
M3	40.0±14.1	47.5±3.5	45.0±7.1	42.5±10.6	32.5±17.6
P1	32.5±11.0	37.5±3.5	37.5±10.6	27.5±10.6	17.5±3.5
P13	25.0±7.1ab	27.5±3.5b	32.5±10.6b	20.0±7.1ab	8.5±2.1a
注：同行数据上标字母不同者之间表示存在显著差异(P＜0.05) Note: Means within rows with the different letter are significantly different(P＜0.05).

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3.   讨论

3.1   益生菌对育苗水体水质的影响

COD是衡量水体中还原性物质如有机酸、亚硝酸盐、亚铁盐，硫化物等多寡的一个重要指标；当其数值过高时，会因还原性物质的氧化分解作用而降低水体中的溶解氧含量，从而影响到水生动物的摄食及生长^[15]。本实验开始到结束，各实验组和对照组育苗水体的COD虽然基本上呈现逐渐上升趋势，但均维持在较合适的范围内，各实验组和对照组之间没有表现出显著性差异，所以没有表现出其他学者报道的益生菌能降低COD的效果^{[2, 10]}。

在整个实验过程中，各实验组和对照组的pH值都维持在较适宜范围内；但在育苗后期，与对照组、实验组Ⅰ和实验组Ⅱ相比较，实验组Ⅳ(光合细菌组)和实验组Ⅲ(芽孢杆菌+光合细菌组)仍然维持较高pH值，这证明光合细菌对提高pH值有一定的作用^[16]。这可能的原因是光合细菌去除水体中H₂S效果较好，降低了水体中H₂S含量，从而提高pH值。

幼体发育到P₁₀时，各实验组H₂S含量明显低于对照组，说明光合细菌和芽孢杆菌均具有降低育苗水体中H₂S含量的作用；到实验结束时，实验组Ⅱ、实验组Ⅲ和实验组Ⅳ的H₂S含量显著低于对照组，而以实验组Ⅳ的H₂S含量最低，说明光合细菌去除H₂S的效果略优于芽孢杆菌；幼体发育到P₁₄时，实验组Ⅰ的H₂S含量升高，说明1 mg· L^-1芽孢杆菌(利生健)的投放量在育苗后期是不够的。

水体中的无机氮包含硝酸氮(NO₃^--N)、NO₂^--N和NH₄⁺-N 3种形态，它们可互相转化；NO₃^--N一般对水产动物无毒害作用，毒害主要来自NH₄⁺-N和NO₂^--N^[17]。LIN和CHEN^[18]研究表明凡纳滨对虾幼体的NH₄⁺-N安全阈值为0.16 mg · L^-1，而本实验过程中后期P₄以后各实验组和对照组均高于此值，但实验组P₁至P₁₃的存活率还是比较高，说明对虾幼体的NH₄⁺-N安全阈值还可能受其他因子的影响；但对照组后期NH₄⁺-N含量和NO₂^--N含量与各实验组相比明显偏高(最高分别达0.48和0.47 mg · L^-1)，是造成对照组仔虾以后仍然不稳定的因素之一。从图 4和图 5可以看出，光合细菌降解NO₂^--N的能力较芽孢杆菌强一些，而芽孢杆菌降解NH₄⁺-N的能力较光合细菌强一些，这与阎斌伦等^[10]在中华绒螯蟹工厂化育苗中的研究结果相反，造成这一差异的原因是否与其他环境因素或实验条件有关，还待进一步研究，目前还没有见到其他光合细菌和芽孢杆菌作用能力比较的研究报道。

尽管益生素显著降低了育苗水体有害物质含量，但实验组育苗后期的有害物质含量仍然偏高，所以在不换水的条件下，后期育苗益生素使用量和使用频率有必要提高。

3.2   微生物制剂对幼体成活率的影响

实验结果说明，益生菌对提高育苗成活率效果显著，这点与其他相关的报道结果一致^{[2, 5-14]}；1 mg · L^-1芽孢杆菌与10 mg · L^-1光合细菌合用(实验组Ⅲ)和5 mg · L^-1芽孢杆菌(实验组Ⅱ)效果较好。本实验在幼体发育至糠虾至仔虾阶段，由于各实验组和对照组幼体都有不同程度的黏附污物，造成育苗成活率低于刘建勇^[2]报道的育苗成活率；在没有使用药物的情况下，通过加强营养，实验组的幼体成活率远高于对照组，说明在完全不使用抗菌药的封闭式育苗方式的情况下，如果不采用其它防病措施，当幼体发育至糠虾阶段时，容易发生病害导致育苗失败，预先施用益生菌可以避免或降低发病率。

综合益生菌对水质的改良效果和幼体的成活率的影响，在对虾育苗中使用芽孢杆菌(利生健)+光合细菌效果最佳，它们具有协同作用效果。

3.3   益生菌在对虾育苗中的作用机理探讨

作为添加到育苗水体中的益生菌，首先必须是“无害”，即不会破坏原来的微生态系统和危及幼体健康；其次是“有益”，即接种的微生物能改善微生态环境和增强幼体抗病力，光合细菌和芽孢杆菌都能满足这2个条件。光合细菌是一类能在厌氧或好氧条件下利用有机酸、氨和硫化氢等作供氢体进行不放氧光合作用的细菌，可参与水体中污染物的降解过程^[19]；光合细菌含有丰富的蛋白质(约含70 %)，而且氨基酸的种类齐全，还含有生物素、B族维生素、叶酸、辅酶Q、类胡萝卜素等生理活性物质，对水产动物起促生长作用；光合细菌还含有抗病毒因子和多种促免疫因子，可以增强水产动物对水产疾病的抗病能力^[20]。枯草芽孢杆菌是需氧芽孢杆菌中的非致病菌，可耐酸、耐碱、耐高温和挤压，是所有益生菌中稳定性最强的一种。芽孢杆菌在生长过程中能产生乙酸、丙酸、丁酸等挥发性脂肪酸，可降低消化道内pH和氨的含量，同时还能产生大量的维生素B和维生素C^[20]。

可见，光合细菌和芽孢杆菌均兼有改善水质、营养及增强免疫力的作用。在本实验中，幼体发育到仔虾之前，各实验组和对照组的水质各项指标均良好，且无显著性差异，但对照组在糠虾阶段的成活率远低于各实验组，说明育苗早期益生菌起作用的方式可能在于营造良好的微生态环境和营养免疫，从而提高幼体的抗病能力。NOGOMI和MAEDA^[21]认为益生菌可能分泌抑菌物质，竞争生态位来抑制病原菌的生长，从而提高幼体的抗病力。李卓佳等^[22]认为益生菌提高水生动物抗病力是通过益生菌与有害微生物竞争营养物质及生存和繁殖的空间，从而抑制了有害菌的生长，无形中也就形成了一道阻碍病原菌侵入的微生物屏障。而在育苗后期益生菌改善水质条件的功能则显得比较重要，因此在育苗的不同时期，益生菌起作用的方式可能不尽相同。