紫贻贝4种同工酶的组织特异性表达研究

刘慧慧, 常抗美

刘慧慧, 常抗美. 紫贻贝4种同工酶的组织特异性表达研究[J]. 南方水产科学, 2008, 4(4): 60-63.
引用本文: 刘慧慧, 常抗美. 紫贻贝4种同工酶的组织特异性表达研究[J]. 南方水产科学, 2008, 4(4): 60-63.
LIU Hui-hui, CHANG Kang-mei. Study on tissue-specificity expression of 4 isozymes in Mytilus edulis[J]. South China Fisheries Science, 2008, 4(4): 60-63.
Citation: LIU Hui-hui, CHANG Kang-mei. Study on tissue-specificity expression of 4 isozymes in Mytilus edulis[J]. South China Fisheries Science, 2008, 4(4): 60-63.

紫贻贝4种同工酶的组织特异性表达研究

基金项目: 

浙江省自然科学基金项目 Y307381

浙江省重大科技攻关项目 2004C13006

浙江海洋学院校内项目 X06LY05

详细信息
    作者简介:

    刘慧慧(1977-), 女, 硕士, 讲师, 从事海洋生物学研究。E-mail: liuhuihui_77@163.com

  • 中图分类号: Q55; Q959.215

Study on tissue-specificity expression of 4 isozymes in Mytilus edulis

  • 摘要:

    采用聚丙烯酰胺垂直电泳法对紫贻贝Mytilus edulis的鳃、消化腺、外套膜、足、闭壳肌等5种组织的超氧化物歧化酶(SOD)、三磷酸腺苷酶(ATPase)、苹果酸脱氢酶(MDH)、苹果酸酶(ME)进行了检测分析。结果表明,SOD在紫贻贝的5种组织中均有表达,共有4条酶带,但迁移率最大的酶带在足和外套膜中未出现,而在另外3种组织中呈弱表达;ATPase在除消化腺外的组织中都表现为2条带;MDH在5种组织中都表达出1条酶带,其中足和闭壳肌的MDH染色最深;ME存在1~2条酶带,其中迁移率大的条带在5种组织中都有表达,而迁移率小的条带只存在于外套膜、闭壳肌和足中。从检测结果来看,上述4种酶在紫贻贝体内的表达有一定的组织特异性。

    Abstract:

    SOD, ATPase, MDH and ME isoenzymes in gill, digestive gland, foot, adductor muscle and mantle of Mytilus edulis were tested and analyzed using polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE).The results indicated that four SOD bands were identified in five tissues, and the band with the biggest mobility ratio were found weakly in gill, digestive gland and adductor muscle but not in foot and mantle.Two ATPase bands were found in four tissues except digestive gland.One MDH band was found in five tissues, but the MDH gene expressed strongly in foot and adductor muscle.Two ME bands were examined in foot, adductor muscle and mantle, but the band with smaller mobility ratio was found in gill and digestive gland.Four isozymes showed diverse bands in different tissues, displaying tissue-specificity.

  • 酶是活细胞产生的一类具有催化能力的蛋白质,是促进生化反应的高效物质。从20世纪80年代以来酶制剂已成为养殖业应用的热点。现今使用的多为复合酶制剂,对单一酶制剂的研究侧重于植酸酶、木聚糖酶及葡聚糖酶,而对于蛋白酶作为饲用酶制剂的研究甚少[1-2]。蛋白酶的作用是将组成蛋白的大分子多肽水解成寡肽或氨基酸,从而提高饲料蛋白的利用率。金属蛋白酶是从韩国巫婆蜘蛛(Nephila clavata)肠道分离出的微生物产生的高活性蛋白酶,该蛋白酶与饲料中的金属离子具有高度协同作用,对植物蛋白和动物蛋白有很强的分解能力,且安全、无毒,可作为各种饲料的酶制剂[3]。本试验在罗非鱼基础饲料中添加金属蛋白酶制剂,研究其对奥尼罗非鱼生长、消化率及非特异性免疫功能的影响,从营养物质的消化吸收和免疫学角度来探讨酶制剂的作用机理,为其在罗非鱼饲料中的推广应用提供依据。

    试验时间: 2006年6月30日~2006年8月24日。

    试验地点: 中国水产科学院珠江水产研究所基地。

    奥尼罗非鱼(Oreochromis niloticus × O.aureus)购于珠江水产研究所良种基地。

    试验的基础饲料营养成分为粗蛋白30%、粗纤维15%、粗灰分15%、总磷0.6%、钙0.5%~1.2%、食盐0.2%~0.8%、赖氨酸1.0%、水分12.9%,试验饲料为基础饲料中分别添加0、0.03%、0.05%、0.10%的金属蛋白酶。试验饲料由佛山市金屏饲料有限公司加工。

    金属蛋白酶由北京金英赛得科技有限公司提供,含600 000 IU · kg-1的蛋白酶,该蛋白酶是从韩国巫婆蜘蛛肠道分离出的微生物产生的高活性蛋白酶,并且与多数金属离子(Zn2+、Mn2+、Ca2+、Mg2+、Fe2+、Co2+、Cu2+)具有高度协同作用,该酶制剂经特殊工艺包埋处理可耐高温,经检测,制粒后仍可保持80%以上的酶活。

    试验鱼暂养1周后,挑选规格较为一致的个体(平均体重8.5 g左右)放于网箱(1 m×1 m×1 m),网箱置于室外水泥池,每网30尾。试验分4组,即对照、低浓度、中浓度、高浓度,每组各设3个重复。每天定时投饵(8:00, 11:30,17:00),定时测定水温、溶氧、pH值,日投饵量为鱼体重的4%~6%,并根据鱼体进食情况和天气变化情况及时调整投饵量,试验期间水温为27.6~32.3℃,DO>4.0 mg · L-1,pH值为7.0~8.5。

    试验分4组,同上,每组各设3个重复,在规格为69 cm×48 cm×60 cm的塑料箱中进行,每箱放鱼8尾,投喂添加1% Cr2O3的试验饲料,24 h连续充气。每天投饵2次(9:00,16:00),投喂7 d后,每天喂料2 h后收集粪便,用捞网捞起条状粪便,用镊子选择新鲜、外表带有包膜的,尽可能完整的粪便放入容器中冷冻保存,实验结束后将每天收集到的粪便集中,并在60℃烘箱中烘干备用。

    血清制备,生长试验结束次日,从每个网箱中对应取出8尾鱼,用1 mL一次性无菌注射器从鱼侧线下第2个鳞片处深入针头于脊柱正下方血管中取血,去掉针头,将血液注入1.5 mL的灭菌离心管中,放4℃冰箱过夜后,以4 000 rmp · min-1低温离心5 min,吸取上清液,每4尾鱼的上清液混合,置于-20℃冰箱备用。

    在试验开始及试验结束的前1 d停止投饵,将鱼饥饿1 d。然后用电子天平称鱼体重,精确到0.01 g,计算相对增重率,饲料系数及成活率。有关计算公式如下:

    $$ \begin{aligned} & \text { 相对增重率 }(\%)=\frac{\text { 试验末鱼均重-试验初鱼均重 }}{\text { 试验初鱼均重 }} \times 100 \\ & \text { 饵料系数 }=\frac{\text { 总摄食量 }}{\text { 鱼体净增重 }} \\ & \text { 成活率 }(\%)=\frac{\text { 试验末鱼总数-试验初鱼总数 }}{\text { 试验初鱼总数 }} \times 100 \end{aligned} $$

    蛋白质的测定采用凯氏定氮法,Cr2O3含量的测定采用湿氏灰化定量法。其计算公式为:

    $$ \begin{array}{l} 蛋白质表观消化率(\% ) = 100 - 100 \times \frac{{{\rm{ 粪便中粗蛋白含量 }}}}{{{\rm{ 含量饲料中粗蛋白含量 }}}} \times \frac{{{\rm{ 饲料中 C}}{{\rm{r}}_2}{{\rm{O}}_3}{\rm{ 含量 }}}}{{{\rm{ 粪便中C}}{{\rm{r}}_2}{{\rm{O}}_3}{\rm{含量}}}}\\ 干物质表观消化率(\% ) = 100 - 100 \times \frac{{{\rm{ 饲料中 C}}{{\rm{r}}_2}{{\rm{O}}_3}{\rm{ 含量 }}}}{{{\rm{ 粪便中C}}{{\rm{r}}_2}{{\rm{O}}_3}{\rm{含量}}}} \end{array} $$

    (1) 溶菌酶活力测定。采用溶菌酶试剂盒(购于南京建成生物工程研究所),其原理为在一定浓度的混浊菌液中,由于溶菌酶能水解细菌细胞壁粘多肽使细菌裂解浓度降低,透光度增强,故可以根据浊度变化来推测溶菌酶含量。具体步骤见试剂盒说明书。

    $$ \begin{aligned} &\text { 溶菌酶活力计算公式: 溶菌酶活力 }(\mathtt{μ} \mathrm{g} \text { • }\\ &\begin{aligned} & \left.\mathrm{mL}^{-1}\right)=\frac{\text { 测定管透光度 }- \text { 空白管透光度 }}{\text { 准管透光度 }- \text { 空白管透光度 }} \times \text { 标准管浓 } \\ & \text { 度 }\left(10 \mathtt{μ} \mathrm{~g} \cdot \mathrm{~mL}{ }^{-1}\right) \end{aligned} \end{aligned} $$

    (2) SOD活力测定。采用超氧化物歧化酶试剂盒(购于南京建成生物工程研究所),其原理为通过黄嘌呤及黄嘌呤氧化酶反应系统产生超氧阴离子自由基(O2- ·),后者氧化羟胺形成亚硝酸盐,在显色剂的作用下呈现紫红色,用可见光分光光度计测其吸光度。当被测样品中含SOD时,则对超氧阴离子自由基有专一性的抑制作用,使形成的亚硝酸盐减少,比色时测定管的吸光度值低于对照管的吸光度值,通过公式计算可求出被测样品中的SOD活力。

    SOD活力定义为,每毫升反应液中SOD抑制率达50%时所对应的SOD量为1个SOD活力单位(U)。测定步骤参照说明书进行,取样量为50 μL。SOD活力计算公式: 总SOD活力(U · mL-1) = $\frac{\text { 对照管吸光度 }- \text { 测定管吸光度 }}{\text { 对照管吸光度 }} \div 50 \% \times \frac{\text { 反应液总量 }}{\text { 取样量 }} $

    实验数据用Microsoft Excel作初步处理,用SPSS(Ver.11.5)进行统计分析。实验各组间的差异采用单因子方差(One-Way Anova)分析,多重比较采用最小显著差数法(LSD),结果用平均数±标准差表示。

    表 1可知,与对照组相比,添加高浓度蛋白酶组的增重率表现显著性差异(P<0.05),其增重率提高了25.13%,而低浓度与中浓度组增重率虽有所提高,但差异不显著(P>0.05)。饵料系数各浓度组与对照组相比均有所降低,分别降低了6.98%、4.65%、12.79%,其中高浓度蛋白酶组与对照组相比,差异显著(P<0.05)。饲料中添加金属蛋白酶对奥尼罗非鱼成活率没有显著性影响(P>0.05)。

    表  1  金属蛋白酶对奥尼罗非鱼生长性能的影响
    Table  1.  Effects of metalloprotease on growth performance of tilapia
    组别
    group
    初均重/g
    initial average weight
    末均重/g
    final average weight
    增重率/%
    weight gain rate
    饵料系数
    feed conversation rate
    成活率/%
    survival rate
    对照 control 8.70±0.14 45.23±1.54a 420.10±24.34a 1.72±0.04a 98.89±0.02
    低浓度(0.03%)
    light concentration
    8.38±0.36 45.88±2.59a 447.06±8.09a 1.60±0.14ab 96.67±0.01
    中浓度(0.05%)
    medium concentration
    8.17±0.17 44.18±1.54a 441.09±26.72a 1.64±0.08ab 97.78±0.04
    高浓度(0.10%)
    high concentration
    8.55±0.41 53.37±3.38b 525.68±64.05b 1.50±0.07b 97.78±0.04
    注: 同一列不同字母表示差异显著(P<0.05)
    Note:Different letters in the same row mean significant difference(P<0.05).
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    表 2可知,饲料中添加金属蛋白酶可提高奥尼罗非鱼对蛋白质的表观消化率。与对照组相比,添加高浓度蛋白酶组差异显著(P<0.05),其蛋白质消化率提高了5.25%。随着饲料中蛋白酶含量的增加干物质表观消化率呈上升趋势,与对照组相比,饲料中添加中浓度、高浓度蛋白酶组差异均显著(P<0.05),其干物质消化率分别了16.63%、27.82%,同时,高浓度组与低浓度组相比差异显著(P<0.05)。

    表  2  金属蛋白酶对奥尼罗非鱼营养物质表观消化率的影响
    Table  2.  Effects of metalloprotease on the apparent digestibility of nutrient of tilapia
    组别
    group
    蛋白质表观消化率
    protein apparent digestibility
    干物质表观消化率
    dry matter apparent digestibility
    对照 control 80.79±0.67a 46.37±1.50a
    低浓度  light concentration 83.02±0.88ab 51.32±0.87ab
    中浓度 medium concentration 82.91±2.25ab 54.08±5.19bc
    高浓度  high concentration 85.03±0.92b 59.27±0.93c
    注: 同一列不同字母表示差异显著(P<0.05)
    Note:Different letters in the same mean significant difference(P<0.05).
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    图 1可知,饲料中添加金属蛋白酶可提高血清溶菌酶活力,但差异不显著(P>0.05)。

    图  1  金属蛋白酶对奥尼罗非鱼血清溶菌酶活力的影响
    Figure  1.  Effects of metalloprotease on the lysozyme activity in tilapia serum

    图 2可知,与对照组相比,饲料中添加高浓度蛋白酶的实验组差异显著(P<0.05),低浓度组、中浓度组SOD活力均有所提高,但差异不显著(P>0.05)。

    图  2  金属蛋白酶对奥尼罗非鱼血清超氧化物歧化酶活力的影响
    Figure  2.  Effects of metalloprotease on the SOD activity in tilapia serum

    金属蛋白酶之所以促进罗非鱼生长,可能有以下几点原因: (1)该蛋白酶与饲料中的金属离子具有高度协同作用,当豆粕等饲料原料中含有金属离子时可以使金属蛋白酶的活性增加; (2)该蛋白酶对植物蛋白和动物蛋白有很强的分解能力,尤其是对植物蛋白,通过在动、植物原料中添加金属蛋白酶,可以显著提高水解产物中容易被动物吸收利用的必需氨基酸和非必需氨基酸的含量[3-4]; (3)可能会激活内源消化酶的分泌[5-6],促进内外消化酶共同作用。

    在奥尼罗非鱼基础饲料中添加0.10%的金属蛋白酶可以显著提高增重率并降低饵料系数。这与蛋白酶在畜禽上的许多报道相符,如在断奶仔猪日量中添加0.2%的酸性蛋白酶能提高仔猪断奶后日增重1.4%,提高饲料转化率9.0%[7]; 在肉鸡饲料中添加蛋白水解酶能提高饲料转化率[8]

    在尼罗罗非鱼O.niloticus[9]、异育银鲫Carassius auratus gibelio[10]、黄颡鱼Pelteobagrus fulvidraco[11]和彭泽鲫Carassius auratus varpengze[12]等的研究中,含蛋白酶的复合酶制剂能提高营养物质消化率,特别是显著提高粗蛋白质和干物质的表观消化率。在虹鳟Oncorhynchus mykiss饲料中添加蛋白水解酶时,能增加粗蛋白的表观消化率[13]。奚刚等[14]也报道了饲料中添加中性蛋白酶能显著提高前期、后期丝毛乌骨鸡Gallus gallus domesticus brisson对粗蛋白的表观消化率。本试验中,饲料中添加0.10%的金属蛋白酶能显著提高奥尼罗非鱼对粗蛋白的表观消化率,添加0.05%和0.10%的金属蛋白酶能显著提高对干物质的表观消化率。这与上述研究报道相似。

    水产动物体内的溶菌酶是一种重要的非特异性防御因子,特别是鱼生理防御水平的一个重要标志,也可以体现病原菌及其它环境因素对鱼体健康的影响[15]。溶菌酶活性提高,表明吞噬细胞活性增加,促进机体的免疫保护[16]

    超氧化物歧化酶广泛存在于各种需氧生物体内,具有清除机体在新陈代谢过程中产生的超氧阴离子自由基(O2+ ·)的能力,属于生物体内的防御系统酶类[17]。已有研究发现,SOD活性与生物的免疫水平密切相关,因此,可作为机体非特异性免疫评价指标[18]

    近年来,有关鱼类非特异性免疫功能的研究多数是关于低聚果糖、β-葡聚糖、低聚木糖、中草药、维生素C和维生素E的研究[19-23],而对于酶制剂的研究很少。本研究结果表明,金属蛋白酶可提高罗非鱼血清SOD活力,且添加量为0.10%时与对照组相比差异显著(P<0.05)。这与钟国防等[24]的报道,饲料中添加木聚糖酶和含蛋白酶的复合酶制剂能提高罗非鱼SOD活力(P<0.01)相符,钟国防等认为添加酶制剂能提高非特异性免疫能力,主要是养分利用率对免疫应答有间接作用,其作用机制是添加酶制剂后,提高了罗非鱼的消化吸收能力,特别是提高了鱼体对蛋白质及其它营养成分的利用率,从而促进了相关免疫因子的合成。这与本研究的结果,即金属蛋白酶能提高奥尼罗非鱼蛋白质表观消化率和干物质表观消化率相符。另外,本研究显示,金属蛋白酶可以提高血清溶菌酶活力,但与对照组相比差异不显著。其原因可能是罗非鱼血清中溶菌酶含量比较低,微量酶制剂在短时间内对其发挥作用不明显。

  • 图  1   紫贻贝5种组织SOD同工酶电泳图谱

    1、2.足;3.鳃;4、5、6.闭壳肌;7.外套膜;8.消化腺

    Figure  1.   The PAGE pattern of SOD isozyme in five tissues of M.edulis

    1, 2.foot; 3.gill; 4, 5, 6.adductor muscle; 7.mantle; 8.digestive gland

    图  2   紫贻贝5种组织ATPase同工酶电泳图谱

    1、2.消化腺;3.闭壳肌;4、5.外套膜;6、7.足;8.鳃

    Figure  2.   The PAGE pattern of ATPase isozyme in five tissues of M.edulis

    1, 2.digestive gland; 3.adductor muscle; 4, 5.mantle; 6, 7.foot; 8.gill

    图  3   紫贻贝5种组织MDH同工酶电泳酶谱

    1、7.鳃;2、3、4.闭壳肌;5.消化腺;6.外套膜;8、9.足

    Figure  3.   The PAGE pattern of MDH isozyme in five tissues of M.edulis

    1, 7.gill; 2, 3, 4.adductor muscle; 5.digestive gland; 6.mantle; 8, 9.foot

    图  4   紫贻贝5种组织ME同工酶电泳酶谱

    1、2.外套膜;3.足;4.消化腺;5.鳃;6、7、8.闭壳肌

    Figure  4.   The PAGE pattern of ME isozyme in five tissues of M.edulis

    1, 2.mantle; 3.foot; 4.digestive gland; 5.gill; 6, 7, 8.adductor muscle

  • [1] 崔龙波, 刘传林, 陆瑶华, 等. 紫贻贝(Mytilus edulis L. )鳃的研究[J]. 齐鲁渔业, 1996, 13(5): 11-14. https://xueshu.baidu.com/usercenter/paper/show?paperid=b27ab3995349ee2e779587b5a6581caf&site=xueshu_se&hitarticle=1
    [2] 崔龙波, 马圣媛, 刘萍, 等. 紫贻贝消化系统的组织学和组织化学研究[J]. 上海水产大学学报, 1999, 8(4): 316-321. doi: 10.3969/j.issn.0250-3263.2000.06.001
    [3] 苏秀榕, 张健, 李太武, 等. 两种贻贝营养成分的研究[J]. 辽宁师范大学学报: 自然科学版, 1997, 20(3): 239-243. https://xueshu.baidu.com/usercenter/paper/show?paperid=8284cb2b5e2cefc0f3396d16a9ee8a64
    [4] 苏秀榕, 李太武, 丁明进. 紫贻贝和厚壳贻贝营养成分的研究[J]. 中国海洋药物, 1998(2): 30-32. https://d.wanfangdata.com.cn/periodical/Ch9QZXJpb2RpY2FsQ0hJTmV3UzIwMjQxMTA1MTcxMzA0Eg5RSzE5OTgwMDI3MjM5NRoINjk2MXc1ejc%3D
    [5] 孙显武, 王洪瑞, 赵永益, 等. 贻贝套网兼养刺参技术[J]. 科学养鱼, 2001(1): 28. https://xueshu.baidu.com/usercenter/paper/show?paperid=5bf075900501941162739d1ab6170e7a&site=xueshu_se&hitarticle=1
    [6] 李世栋, 舒云华, 方圃, 等. 贻贝自然海区半人工采苗的技术[J]. 水产养殖, 1995(4): 6-7. https://xueshu.baidu.com/usercenter/paper/show?paperid=4a397ddafcaf7292a313b1b2f2fb3a01&site=xueshu_se&hitarticle=1
    [7] 刘德经, 王聪明, 施孙福, 等. 紫贻贝(Mytilus galloprovincialis Lamarck)筏式采苗和渡夏的研究[J]. 福建水产, 1997(1): 46-52.
    [8] 李太武, 王冬群, 苏秀榕. 缢蛏(Sinonvacula constricta)生物遗传特征分析[J]. 海洋与湖沼, 2003, 34(6): 640-647. https://www.semanticscholar.org/paper/%E7%BC%A2%E8%9B%8F%EF%BC%88Sinonovacula-constricta%EF%BC%89%E7%94%9F%E5%8C%96%E9%81%97%E4%BC%A0%E7%89%B9%E5%BE%81%E5%88%86%E6%9E%90-%E6%9D%8E%E5%A4%AA%E6%AD%A6-%E7%8E%8B%E5%86%AC%E7%BE%A4/23e8603e9735883a5b2a4c465a0286d91bc5f372
    [9] 李太武, 吕振明, 林志华, 等. 泥蚶同工酶谱在不同组织的差异研究[J]. 海洋学报, 2004, 26(4): 152-162. doi: 10.3321/j.issn:0253-4193.2004.04.014
    [10] 李广丽, 叶富良. 马氏珠母贝不同组织同工酶的比较[J]. 水产学报, 2000, 24(5): 417-421. doi: 10.3321/j.issn:1000-0615.2000.05.006
    [11] 梁玉波, 络喜昌. 中国北方菲律宾蛤仔同工酶电泳的初步分析比较[J]. 海洋环境科学, 1999, 18(1): 24-28. doi: 10.3969/j.issn.1007-6336.1999.01.006
    [12] 王梅芳, 师尚丽, 刘永, 等. 企鹅珍珠贝同工酶表达多态性的初步研究[J]. 湛江海洋大学学报, 2004, 24(1): 9-14. doi: 10.3969/j.issn.1673-9159.2004.01.002
    [13] 姜建国, 熊全沫, 姚汝华. 鳙鱼不同组织的同工酶研究[J]. 华南理工大学学报: 自然科学版, 1998, 26(3): 68-72. doi: 10.3321/j.issn:1000-565X.1998.03.014
    [14] 李广丽, 杜晓东, 叶富良. 合浦珠母贝同工酶的电泳分析[J]. 中国水产科学, 2001, 8(2): 17-22. doi: 10.3321/j.issn:1005-8737.2001.02.006
    [15] 王志铮, 李太武, 刘艳, 等. 栉孔扇贝六种同工酶的生化遗传分析[J]. 海洋与湖沼, 2002, 33(3): 232-238. doi: 10.3321/j.issn:0029-814X.2002.03.002
图(4)
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出版历程
  • 收稿日期:  2008-01-14
  • 修回日期:  2008-03-30
  • 刊出日期:  2008-08-04

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