鱼类的生长受内源和外源两类因子的调控。内源因子与鱼类的生理状况和遗传型相关, 外源因子则包括食物、温度、溶氧、盐度、光照、pH以及种内和种间的关系等, 其中溶氧被称为鱼类活动和生长的限制因子^[1]。溶氧是鱼类赖以生存的基础, 适宜的溶氧水平是保证鱼类正常生长的重要条件, 其对鱼类的孵化、成活、新陈代谢、生长、发育、摄食等各个方面都有着深刻的影响, 尤其是低氧易使鱼类正常的呼吸和生理代谢发生紊乱, 导致鱼类摄食量下降、食物转化效率降低、生长缓慢, 甚至影响鱼类的行为、形态学特征及生存策略^[2-4]。实际生产活动中, 由于近年来经常遭遇的极端天气, 赤潮、水华以及生产管理失误等均会造成养殖水体溶氧的降低, 苗种运输作为鱼类养殖过程重要的一部分, 长途运输过程也常出现低氧^[5-6]。鱼类在应对低氧胁迫的过程中极易造成体内环境稳态的失衡, 导致组织器官的损坏, 影响成活^[7-8]。

卵形鲳鲹(Trachinotus ovatus)属鲈形目、鲹科、鲳鲹亚科、鲳鲹属, 俗称金鲳。该鱼为暖水性鱼类, 在中国沿海均有分布, 是闽、粤、桂、琼等省(区)重要的海水养殖种类之一。目前国内外对卵形鲳鲹的繁殖生物学、发育生物学及养殖技术等方面已做了许多研究^[9-11], 笔者也对卵形鲳鲹幼鱼呼吸和排泄基本规律开展了系列探索^[10-13], 该文在前述基础上, 应用实验生理生态学方法, 测定急性和慢性低氧胁迫后鱼体的氧化应激和生理代谢相关指标的变化, 为其生物学文库提供基础资料, 为生产过程中苗种生产与活鱼运输, 养殖水质调控以及应对低氧采取应急措施提供系统的技术支撑。

1.   材料与方法

1.1   实验材料

实验材料为笔者课题组当年人工繁育的卵形鲳鲹苗种, 实验鱼体质量为(31.59±3.01)g, 在室内恒温循环水系统暂养2周, 暂养水温(23±0.7)℃, pH(7.76±0.02), 自然光照(92.5~3 786)lx, 盐度(20±0.5)g·L^-1, 溶氧质量浓度(6.82±0.45)mg·L^-1。每天早上9:00、下午16:30按照体质量的3%进行投喂, 饲料为浮水性鱼用配合饲料, 粗蛋白质量分数≥34%, 粗脂肪质量分数≥5%, 投喂后及时捞去残饵和粪便, 实验前1 d停止投喂。

1.2   实验方法

1.2.1   低氧胁迫

实验所用卵形鲳鲹分4组:急性实验组、慢性实验组及各自的对照组, 每组3个平行。低氧水平设置参考王刚等^[12-13]关于卵形鲳鲹耗氧率和窒息点的测定数据。各实验组分别置于0.43 m³玻璃钢桶中, 密度为30尾·桶^-1, 溶氧条件同暂养水平。实验中依据溶氧仪的实时读数, 通过调节充入水中的氮气和空气的速率控制溶氧, 急性实验组在30 min内将溶氧降至(1.55±0.10)mg·L^-1, 实验开始计时。慢性实验组第1天以平均0.13 mg·(L·h)^-1的速率将溶氧水平缓慢降低至(3.60±0.20)mg·L^-1, 第2天以0.085 mg·(L·h)^-1的速率从(3.60±0.20)mg·L^-1缓慢降低至(1.55±0.20)mg·L^-1, 对照组养殖条件与暂养条件一致, 实验过程中每天统计实验个体的成活数。

1.2.2   取样

急性实验组分别在第3、第6、第12和第24小时取样, 且同时取急性对照组样品。慢性实验组在低氧胁迫第14天时取样, 且同时取慢性对照组样品。取样时将实验鱼用适量MS-222溶液麻醉, 在灭菌操作台上解剖后取肝脏和右侧第二鳃弓的鳃, 迅速置于1.5 mL离心管后于液氮罐中速冻, 之后转移至-80 ℃超低温冰箱(Thermo 900, 美国)保存。

1.2.3   慢性低氧胁迫下卵形鲳鲹的成活率

成活率由慢性胁迫实验中各组实验鱼在胁迫过程中统计所得。

1.2.4   酶活性与含量测定

按每克待测样组织加入9 mL生理盐水的比例进行组织匀浆, 匀浆的制备使用180 ℃高温灭菌的预冷研钵充分研磨, 研磨后转移至1.5 mL离心管, 4 ℃, 3 000 r·min^-1离心10 min, 取上清液分装后4 ℃冰箱暂存, 用于测定酶活性和蛋白质、乳酸脱氢酶(LDH)、肝糖原(LG)含量。

丙二醛(MDA)、过氧化氢酶(CAT)、超氧化物歧化酶(SOD)、还原型谷胱甘肽(GSH)、总蛋白(TP)、LG以及LDH的酶活性与含量均使用南京建成公司试剂盒进行测定。用硫代巴比妥酸法测定MDA质量摩尔浓度(mol·mg^-1, 以蛋白质计); 用可见光法测定CAT含量, 活力单位定义为每毫克组织蛋白每秒分解1 μmol的H₂O₂的量为1个活性单位(U·mg^-1); 用黄嘌呤氧化酶法测定SOD活性, SOD活性单位定义为反应体系中SOD抑制率达到50%时所对应的酶量为1个SOD活性单位(U·mg^-1); 用微板法测定GSH质量摩尔浓度(μmol·g^-1); 用考马斯亮蓝法测定TP质量浓度(mg·mL^-1); 用比色法测定LG(U·mg^-1); 用微板法测定LDH(g·mL^-1)。

1.2.5   统计分析

统计数据采用“平均数±标准差(X±SD)”表示, 使用软件SPSS 20.0进行单因素方差分析, 结合Duncan氏法进行多重比较, 使用Sigma Plot 12.5软件作图。

2.   结果

2.1   慢性低氧胁迫下的成活率

慢性低氧胁迫过程中卵形鲳鲹的成活率下降, 初始成活个体为100%, 第5天时个体成活率降为初始的90%, 之后持续下降, 第11天时降为初始的50%, 实验结束时的成活率仅为初始的26%(图 1)。

图  1  慢性低氧胁迫下卵形鲳鲹的成活率变化(n=3)

Figure  1.  Survival rate of T.ovatus under chronic hypoxia stress

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2.2   低氧胁迫后的氧化应激

2.2.1   急性胁迫后鳃抗氧化酶活性和MDA水平变化

急性低氧胁迫过程中随低氧胁迫时间延长卵形鲳鲹鳃CAT活性下降, 第3小时活性最低, 随后缓慢升高, 第24小时显著高于其他各组(P < 0.05)。GSH质量摩尔浓度随低氧持续先上升后下降, 第3小时达到最大值, 第24小时降低至对照组水平以下。SOD活性随低氧持续增加, 第12小时最高, 到第24小时降低(图 2-A)。MDA质量摩尔浓度在低氧3 h上升后持续在该水平下略有波动(图 2-B)。

图  2  急性低氧胁迫后卵形鲳鲹鳃抗氧化酶活性和丙二醛水平的变化(n=5)

柱上不同小写字母组间有差异显著(P＜0.05), 后图同此。

Figure  2.  Anti-oxidation enzyme activity and MDA content of T.ovatus gill under acute hypoxia stress

Values with different lowercase letters indicate significant difference among different treatments (P < 0.05).The same case in the following figures.

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2.2.2   慢性胁迫后鳃抗氧化酶活性和MDA水平变化

慢性低氧胁迫下卵形鲳鲹鳃CAT、SOD活性均显著高于对照组(P＜0.05)(图 3-A), GSH(图 3-A)和MDA(图 3-B)水平也增加, 但不显著。

图  3  慢性低氧胁迫后卵形鲳鲹鳃抗氧化酶活性和丙二醛水平的变化(n=5)

Figure  3.  Anti-oxidation enzyme activity and MDA content of T.ovatus gill under chronic hypoxia stress

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2.3   低氧胁迫后肝脏能量代谢变化

2.3.1   低氧胁迫对LG的影响

LG在急性和慢性低氧胁迫中呈不同的变化趋势, 急性低氧胁迫中, 随低氧呈先下降后恢复的趋势, 第12小时降至最低, 第24小时回升并高于对照组水平(图 4-A); 慢性低氧胁迫后LG下降, 但与对照组相比下降程度不显著(P>0.05)(图 4-B)。

图  4  低氧胁迫后卵形鲳鲹肝脏糖原的变化(n=5)

Figure  4.  LG of T.ovatus gill under chronic hypoxia stress

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2.3.2   低氧胁迫对肝脏LDH的影响

卵形鲳鲹LDH水平在急性低氧胁迫过程中的变化明显(P＜0.05), 随低氧先急骤上升, 第3小时达到最大值, 然后缓慢下降, 第24小时下降到比对照组还低的水平(图 5-A), 慢性低氧胁迫后LDH水平显著高于对照组(P＜0.05)(图 5-B)。

图  5  低氧胁迫后卵形鲳鲹乳酸脱氢酶的变化(n=5)

Figure  5.  LDH of T.ovatus gill under chronic hypoxia stress

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3.   讨论

3.1   低氧胁迫下卵形鲳鲹鳃SOD和CAT的变化

正常动物细胞要求适当的氧化与抗氧化平衡, 即自由基的形成和清除处于动态平衡中, 若该动态平衡遭到破坏, 超氧自由基在机体中就会过多或过少, 机体就会处于氧化应激, 自由基会对细胞内生物大分子如蛋白质、脂质、核酸等造成损伤, 导致DNA分子突变, 诱发细胞的衰老死亡, 最终导致机体患病或衰老^[14]。自由基的清除主要依靠机体中的抗氧化防御体系统, CAT和SOD是该系统的重要组成成分, SOD的功能是将机体内超氧阴离子自由基(O^2-)歧化成过氧化氢(H₂O₂)和氧气(O₂), 清除细胞内产生的过量的氧自由基^[15]。CAT对环境变化较为敏感^[16], 是生物体内一种含巯基(-SH)的抗氧化酶, 可与GSH一起, 清除SOD歧化O^2-产生的H₂O₂, 进而阻断可产生活性极高的羟自由基(-OH)的反应, 在生物体的抗氧化防御系统中占有重要地位^[17]。

一般认为, SOD在清除活性氧的过程中最早发挥作用, 它首先促使O^2-歧化为H₂O₂和O₂, 随后CAT再将H₂O₂催化为H₂O和O₂, 从而达到为机体解毒的目的^[18]。笔者研究中观察到, 急性低氧胁迫下鳃SOD活性在第3小时已达最大值, 而CAT活性下降后才升高, 与尹飞等^[18]实验结果类似。

3.2   低氧胁迫下卵形鲳鲹鳃GSH和MDA的变化

抗氧化系统中的酶和小分子清除剂, 如GSH是其发挥解毒功能的重要物质, 其含量的变化与生物体受胁迫程度密切相关^[19], 在谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)的作用下GSH把H₂O₂还原成水, GSH自身被氧化为氧化型谷胱甘肽(GSSG), GSSG又在谷胱甘肽还原酶的作用下被还原为GSH, 维持体内正常的还原缓冲状态, GSH水平的变化, 显示了机体的氧化应激程度^[20]。

由于各种原因, 鱼类面临着不同的溶氧变动情况, 在低氧状态时, 可诱导鱼类使用厌氧途径, 促使一些副产物增加, 抗氧化机制发生改变。GSH作为一类小分子抗氧化剂参与一系列至关重要的保护细胞功能, 可以消除氧自由基, 在鱼类应对氧化应激压力中起非常重要的作用, 当出现氧化应激压力时, 谷胱甘肽的合成重新开始^[21]。笔者研究中发现, 急性低氧胁迫下鳃GSH水平上升后恢复, 表明低氧胁迫对卵形鲳鲹造成氧化压力, 且GSH增加来清除机体产生的多余自由基, 慢性低氧胁迫后鳃GSH亦增加, 表明相对正常溶氧, 持续的低氧胁迫对鳃造成氧化压力, 持续的低氧必将对其造成氧化应激。

鱼体内抗氧化酶的缺乏会导致体内原有自由基代谢平衡遭到破坏。自由基可与细胞膜、细胞器膜上的不饱和脂肪酸发生脂质过氧化反应, 产生环氧化物(如MDA), 从而影响机体的物质代谢、能量代谢和信息传递, 危及正常的生命活动^[22]。脂肪过氧化最终产物MDA的量可灵敏地反映机体内脂质过氧化的强弱^[23]。实验中卵形鲳鲹鳃MDA在急性低氧胁迫中上升后一直未下降, 第14天时亦显著高于对照组, 表明急性低氧胁迫过程对鳃中的自由基影响持续且尚未恢复, 慢性低氧胁迫中鳃持续受到自由基造成的脂质过氧化, 产生的大量自由基将对鳃产生严重的负面影响。

3.3   低氧胁迫下卵形鲳鲹肝脏LG和LDH的变化

LG是动物主要的储能形式, 是肝以外其他组织所需的血糖储存^[24]。运动训练可提高实验鱼的LG水平, 有利于为实验鱼长时间有氧运动储存充足的代谢底物^[25]。该实验中卵形鲳鲹在急性低氧胁迫后LG下降后恢复, 表明在急性低氧条件下, 卵形鲳鲹进行了脂肪动员, 分解的脂肪为其他组织提供了能量, 以应对突然出现的低氧环境。在慢性低氧胁迫下, 卵形鲳鲹的LG下降且不显著, 表明持续的低氧胁迫导致卵形鲳鲹的能量储备下降, 不利于卵形鲳鲹的生长。

LDH可催化丙酮酸和乳酸之间的相互转化, 是鱼类机体无氧代谢的标志酶, 其活性大小在一定程度上反映了无氧代谢能力的高低^[26], LDH在组织中的活性大大高于血液中的活性, 当机体各组织器官病变时, 其组织器官本身的LDH会发生变化, 同时也可引起血液中LDH的改变, 若血液中LDH活性升高则预示着肝脏、肾脏和肌肉等组织细胞发生改变、受到损伤, 这些指标在评价鱼类健康方面具有重要意义^[27]。该实验中急性低氧胁迫下, LDH先上升后恢复, 表明机体由于氧气不足进行了无氧代谢, 且进行生理调整后恢复; 慢性低氧胁迫过程中LDH显著升高, 表明持续的低氧使卵形鲳鲹的无氧代谢能力增加, 长期的无氧代谢会对肝脏造成损伤。