Cloning, structure analysis and expression of interferon gamma (IFN-γ) gene in Oreochromis niloticus
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摘要:
γ-干扰素(interferon，IFN)是调控天然免疫与细胞免疫的一种重要细胞因子，在抵抗病毒入侵和细菌感染中发挥重要作用。该研究从尼罗罗非鱼(Oreochromis niloticus)脾脏组织中扩增到γ-干扰素基因的cDNA，大小为621 bp，编码206个氨基酸。生物信息学分析表明，尼罗罗非鱼γ-干扰素分子(On IFN γ)具有信号肽、IFN特征序列及核定位信号。预测的三级结构与人类IFN γ晶体结构最相似。qPCR检测显示，IFNγ在正常鱼体内的脾脏中表达量最高，其次是肠、鳃和肾脏。感染无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)后，On IFN γ在脾脏、肾和鳃中的表达均显著上调(P < 0.05)。On IFN γ在相关免疫器官中的高表达、受感染后的表达上调，说明其在罗非鱼免疫防御中可能具有重要作用。该研究为进一步开展On IFN γ基因的功能研究、探讨其在抗病转基因及抗病选育中的开发应用奠定了基础。
Abstract:Interferon-γ is a cytokine crucial for the regulation of both natural and cellular immunity, playing an important role in defending against virus invasion and bacterial infection. In this study, the cDNA of interferon-γ genes was amplified from the spleen tissues of Nile tilapia; this cDNA had an open reading frame of 621 bp, encodeing 206 amino acids. Bioinformatics analysis shows that the interferon-γ molecule of Nile tilapia contains one signal peptide and one nuclear localization signal. Its tertiary structure was similar with the crystal structure of human interferon-γ. Real-time fluorescent quantitative polymerase chain reaction (PCR) shows that the expression level of interferon-γ gene was the highest in the spleen of normal Nile tilapia, followed by the intestines, gills and kidneys (P < 0.05). Both the high expression of interferon-γ in immune-associated tissues and its upregulated expression after GBS infection reveal the significant role of interferon-γ in the immune defense of Nile tilapia. This study lays foundation for further research on the function of interferon-γ gene in Nile tilapia as well as its development and application in transgenesis and selective breeding for disease resistance.
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鱼类产品组织柔软，含水量高，蛋白质丰富且pH接近中性，体内组织酶类活性强，蛋白质和脂质较不稳定，易腐败变质。因此，其贮藏保鲜技术一直是许多学者的研究重点。目前，实际应用于水产品的保鲜技术已有低温保鲜、高压保鲜、辐照保鲜、气调保鲜和生物保鲜等，其中以低温保鲜应用最广泛[1]。冷藏是最常用的低温保鲜方式，但保质期短，一般都在7 d左右，且在贮藏过程中水产品原有的鲜味下降速度快；微冻保鲜是一种新型的低温保鲜技术，是指在生物体冰点(冻结点)和冰点以下(1~2 ℃)之间的温度带轻度冷冻贮藏，此技术能明显延长水产品货架期1.5~4倍，因而日益受到人们重视[2]。
鳙(Aristichthys nobilis)是中国四大家鱼之一，又名花鲢、黑鲢、胖头鱼，属硬骨鱼科，鲤形目，鲤科，鲢亚科。广泛分布于中国中部、东部和南部地区的江河中[3]。目前国内外学者已对罗非鱼(Oreochromis spp.)[4]、草鱼(Ctenopharyngodon idellus)[5]、鲢(Hypophthalmichys molitrix)[6]、鲈(Lateolabrax japonicus)[7]、大西洋白姑鱼(Argyrosomus regius)[8]、海鲤(Sparus aurata)[9]等鱼类在贮藏过程中的品质变化进行了研究。俞静芬等[10]仅对鳙微冻保鲜过程中的品质变化特性进行了研究，但未探究微冻对其品质的不利影响。为此笔者采用鳙为试验对象，测定其在不同贮藏条件下几个常用的指标[感官评分、pH、总挥发性盐基氮(TVB-N)、硫代巴比妥酸(TBA)、鲜度(K值)]和汁液流失率、蒸煮损失率的变化，以更全面地研究鳙在冷藏和微冻条件下品质的变化规律。
1. 材料与方法
1.1 样品及预处理
鲜活的鳙购于北京小月河农贸市场，体质量(1.5±0.5)kg，体长(42.0±8.0)cm。鳙运至实验室后击毙，去鳞、内脏、头尾，躯干部分等长度分为上、中和下3段，用清水洗净沥干后装入聚乙烯保鲜袋。分别放在4 ℃和-3 ℃下贮藏，每2 d和5 d随机选取3块，取背部白肉进行分析，每个指标重复测定3次。
1.2 测定方法
1.2.1 肌肉组成成分的测定
蛋白质采用GB 5009.5-2010中的凯氏定氮法测定；水分采用GB 5009.3-2010中的直接干燥法测定；粗脂肪采用GB/T 14772-2008中的索氏提取法测定；灰分采用GB 5009.4-2010中的干灰化法测定。
1.2.2 感官评定
分为生鲜和水煮2种评价方式，由10名评定人员逐项打分，每项满分5分。生鲜鱼块检验指标包括色泽、气味、组织、形态和肌肉弹性；水煮鱼块检验指标包括气味、滋味和汤汁浑浊度。感官分值为生鲜和水煮2种评价分值之和。具体评分标准参照黄晓春等[11]的评定方法。
1.2.3 pH的测定
取绞碎的鱼背脊部肌肉10.00 g于烧杯中，加入10倍体积蒸馏水，搅拌30 min后过滤，取其滤液用pH计测定。
1.2.4 汁液流失率的测定
按照AOAC的方法测定[12]：汁液流失率%=(贮藏前鱼质量-贮藏后鱼质量)/贮藏前鱼质量×100
1.2.5 蒸煮损失率的测定
参照余小领等[13]方法并作部分修改。取鳙鱼块背部肌肉切成约(2 cm×2 cm×2 cm)的肉块，保鲜袋包装后在80 ℃水浴锅中蒸煮15 min，蒸煮前称质量(Wb)。蒸煮后冷却到室温，用吸水纸吸干表面水分，然后再次称取质量(Wa)。蒸煮损失率(cooking loss，CL)计算公式为：CL(%)=(Wb-Wa)/Wb×100
1.2.6 TVB-N的测定
采用凯氏定氮仪按GB/T 5009.44-1996中蒸馏法测定。
1.2.7 TBA的测定
参照THANONKAEW等[14]的方法并作部分修改。取鳙鱼块背部肌肉，绞肉机搅碎，取4 g肉泥溶于20 mL TBA溶液(0.375%TBA，15%三氯乙酸和0.25 mol· L-1 HCl)，研钵研磨1 min，常温3 600 g离心20 min，取上清液，532 nm测定吸光度。标准曲线由不同浓度丙二醛(MDA)测吸光值得出：y=0.001 4x-0.000 008，R2=0.999 6。TBA由样品中MDA的质量分数(mg·kg-1)表示。
1.2.8 K值的测定
鲜度指标K值参照宋永令等[15]的方法测定。
2. 结果与讨论
2.1 鳙的组成成分
新鲜鳙鱼肉的主要成分为蛋白质[(15.20±0.40)%]、水分[(80.79±0.73)%]、粗脂肪[(0.94±0.04)%]和灰分[(1.00±0.07)%]。
2.2 感官分值的变化
鳙在冷藏和微冻过程中感官分值的变化见图 1。4 ℃和-3 ℃下鳙感官分值均随贮藏时间的延长而减小。这与REZAE等[16]研究的虹鳟(Oncorhynchus mykiss)在(3±1)℃下感官品质变化趋势相似。虹鳟在贮藏初期的品质较好，4 d后品质下降加快，第12天时品质已超过感官限度。4 ℃与-3 ℃下的鳙感官指标有明显差异。4 ℃的感官分值下降速率明显大于-3 ℃。4 ℃下贮藏至第8天的感官分值为18，而-3 ℃贮藏至第30天的则为18；鳙在4 ℃下贮藏至第10天时已有明显的氨臭味，其感官分值为14，而-3 ℃下第35天鳙才略带异味，感官分值为15。结果显示，鳙在-3 ℃微冻贮藏过程中感官分值较4 ℃冷藏下降缓慢。4 ℃和-3 ℃鳙的感官期限分别为8 d和30 d。
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图 1 鳙在不同贮藏温度下感官分值的变化Figure 1. Change in sensory scores of A. nobilis during storage at different temperatures2.3 pH的变化
鳙在不同温度下pH的变化规律见图 2。贮藏初期pH均呈下降趋势，4 ℃和-3 ℃下pH分别在第4天和第10天达到最小值，分别为6.81和6.76。张丽娜等[5]认为，贮藏初期鱼肉pH逐渐下降是由于糖原酵解产生乳酸，三磷酸腺苷(ATP)和磷酸肌酸等物质分解产生磷酸等酸性物质。此外，也有报道指出贮藏初期二氧化碳(CO2)溶于鱼肉组织中也会导致鱼肉pH下降[17]。当鳙在4 ℃和-3 ℃贮藏分别超过4 d和10 d后，微生物分解蛋白质产生碱性胺类物质，pH开始逐渐上升，鱼肉品质下降迅速，且4 ℃的pH上升速率高于-3 ℃。结果表明，与冷藏相比，微冻能够降低鱼肉微生物代谢速率，抑制内源酶的活力，延缓pH上升对鱼肉品质的破坏。
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图 2 鳙在不同贮藏温度下pH的变化Figure 2. Change in pH of A. nobilis during storage at different temperatures2.4 汁液流失率的变化
汁液流失率是衡量鱼肉蛋白持水性的主要指标之一，其反映了水产品在贮藏过程中的汁液流失状况，渗出的汁液会降低产品的商品价值，同时也会成为微生物生长繁殖的优质培养基。不同温度下鳙汁液流失率的变化结果见图 3。不同温度贮藏条件下鳙的汁液流失率均随时间的延长而增加。在-3 ℃贮藏至第20天时鳙汁液流失率达到8.04%，此后汁液流失率上升速率趋缓，在第55天时达到峰值(9.06%)。4 ℃下鳙汁液流失率在第8天达到2.80%，而-3 ℃下贮藏至第5天为5.18%，接近4 ℃下贮藏至第8天汁液流失率2倍的水平。DUUN等[18]认为这是由于微冻条件下鱼肉组织中部分水分冻结，使相邻未冻结区域的溶液浓度升高，从而增加了酶的浓度，破坏细胞膜结构，使鱼肉蛋白变性，蛋白质持水力下降，汁液流失率升高。SIMPSON等[19]对-3 ℃和0 ℃条件下大西洋鳕(Gadus morhua)的汁液流失变化进行了研究，结果表明，-3 ℃下的大西洋鳕的汁液流失率显著高于0 ℃时。鳙的汁液流失率的变化趋势与大西洋鳕一致。
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图 3 鳙在不同贮藏温度下汁液流失率的变化Figure 3. Change in drip loss of A. nobilis during storage at different temperatures2.5 蒸煮损失率的变化
蒸煮损失率是指鱼肉从鲜肉到熟肉成熟过程中水分的流失状况。高的蒸煮损失率不仅使鱼肉的食用品质下降，同时也影响鱼肉的外观。鳙在不同温度贮藏下蒸煮损失率的变化规律见图 4。新鲜状态下的鳙蒸煮损失率达到25.75%，贮藏至第2天时4 ℃和-3 ℃下的蒸煮损失率均下降至最小值，分别为18.57%和17.06%，这可能与鳙进入僵硬期肌肉变硬、煮后组织坚韧有关[1]。第2天后4 ℃和-3 ℃下的蒸煮损失率均呈较为明显的上升趋势，从第4天开始-3 ℃下的蒸煮损失率增加速率明显高于4 ℃。AUNCHALEE等[20]对不同贮藏条件下虹鳟鱼片蒸煮损失率的变化进行了研究，结果表明虹鳟鱼片在2 ℃贮藏至第3天和第7天后的蒸煮损失率分别为15.75%和15.55%，低于鳙相应天数的蒸煮损失率。
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图 4 鳙在不同贮藏温度下蒸煮损失率的变化Figure 4. Change in cooking loss of A. nobilis during storage at different temperatures2.6 TVB-N的变化
鳙在不同温度下TVB-N的变化见图 5。不同温度条件下TVB-N随着贮藏时间的延长而上升。在4 ℃和-3 ℃下TVB-N分别在贮藏至第6天和第5天时达到121.1 mg · kg-1和86.6 mg · kg-1，之后在4 ℃下的TVB-N开始迅速上升，而-3 ℃下的TVB-N上升缓慢。这与宋永令等[14]研究不同温度货架期间团头鲂(Megalobrama amblycephala)品质的变化规律的结果有差异。团头鲂在4 ℃贮藏至第12天时其TVB-N为169.9 mg · kg-1，之后上升速度增加。而在-3 ℃下TVB-N在整个贮藏过程中(46 d)变化缓慢，从96.9 mg · kg-1上升至212.1 mg · kg-1。表明不同鱼类在冷藏和微冻条件下TVB-N的变化存在差异，低温能延缓TVB-N的上升，这主要是由于低温抑制了鳙中微生物的繁殖，从而抑制了微生物对鳙中蛋白质的降解和腐败作用；低温也降低了鱼肉中酶的活性，减缓了其对鱼肉的降解作用[21]。
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图 5 鳙在不同贮藏温度下TVB-N的变化Figure 5. Change in TVB-N of A. nobilis during storage at different temperatures2.7 TBA的变化
鳙在不同贮藏温度下TBA的变化见图 6。在4 ℃和-3 ℃下，TBA均呈现明显的上升趋势。贮藏初期TBA上升缓慢，在4 ℃贮藏至第4天和-3 ℃贮藏至第5天时TBA分别为0.40 mg · kg-1和0.38 mg · kg-1，与初值0.37 mg · kg-1相比仅增加了0.03 mg · kg-1和0.01 mg · kg-1，增加不明显。第4天和第5天后4 ℃和-3 ℃下的TBA上升速率加快，且微冻上升速率快于冷藏的速率。4 ℃下鳙的TBA在第8天达到0.61 mg · kg-1，-3 ℃贮藏至第30天的TBA为0.74 mg · kg-1，均未超过2.00 mg ·kg-1的临界值。而鲤(Cyprinus spp.)4 ℃贮藏至第14天的TBA为0.52 mg · kg-1，-3 ℃贮藏至第40天的为1.06 mg ·kg-1[6]。结果表明，与4℃冷藏相比，-3 ℃微冻能延缓鳙鱼肉的脂肪氧化，但TBA不宜单独作为判断鳙货架期的指标。
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图 6 鳙在不同贮藏温度下TBA的变化Figure 6. Change in TBA of A. nobilis during storage at different temperatures2.8 K值的变化
鳙在不同贮藏温度下K值的变化见图 7。冷藏和微冻条件下鳙的K值均随贮藏时间的延长而升高。不同贮藏温度下K值的变化幅度有较大差异。4 ℃下K值随时间几乎呈直线上升状态，而-3 ℃的K值在贮藏前期上升速度较快，第25天后上升速度趋缓，且-3 ℃的K值在整个贮藏过程中上升速度均较4 ℃的慢。这与张丽娜等[5]关于冷藏和微冻条件下草鱼鱼片品质变化的研究中K值变化的研究结果不同，该研究显示-3 ℃下草鱼鱼片K值在前5 d上升较快，之后趋于平缓，贮藏至第25天后逐渐增加。
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图 7 鳙在不同贮藏温度下K值的变化Figure 7. Change in K value of A. nobilis during storage at different temperaturesMANJU等[22]的研究显示，橘子鱼(Etroplus suratensis)在冷藏过程中超过感官期限时所有样品的K值均超过60%。鳙在4 ℃和-3 ℃的感官期限分别是8 d和30 d，其对应的K值分别为64.51%和69.27%，均超过了60%。而4 ℃贮藏至第6天和-3 ℃贮藏至第20天的K值分别为57.90%和55.75%，因此，符合K值变化的合理货架期应为4 ℃贮藏至第6天和-3 ℃贮藏至第20天。
3. 结论
与4 ℃冷藏相比，-3 ℃微冻能明显延缓鳙在贮藏过程中TVB-N、TBA和K值的增长，降低鳙感官品质下降速率，延迟贮藏初期pH下降的时间，延长货架期，但-3 ℃明显增加了鳙的汁液流失率和蒸煮损失率。根据TVB-N、TBA、K值及感官品质指标预测冷藏和微冻鳙的货架期分别为6 d和20 d。
试验表明，贮藏温度的变化是造成鳙货架期间品质变化的主要影响因素。与冷藏相比，微冻保鲜虽然可以延长鱼体的保鲜期限、克服冷藏法保鲜时间短的缺陷，但鱼肉部分冻结，冰晶增长破坏细胞结构，导致汁液流失和蒸煮损失增加，影响鱼的品质。因此，微冻条件下鱼体品质变化的规律以及高效的控制方法还有待进一步的研究。
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图 1 尼罗罗非鱼γ-干扰素基因的cDNA序列及其编码氨基酸序列
A.灰色背景框标注为信号肽序列；白色背景框标注为保守的四螺旋细胞因子类结构(four-helical cytokine-like/core)；下划线标注为多腺苷酸化信号(AATAAAA)；B.尼罗罗非鱼IFNγ与其他物种IFNγ氨基酸序列3′端IFNγ特征序列及核定位序列比对结果，D.rerio IFNγ，I.punctatus IFNγ，E.coioides IFNγ，O.mykiss IFNγ，T.rubripes IFNγ，C.aurtus IFNγ，H.sapiens IFNγ，M. musculus IFNγ GenBank登录号见图 3图注；虚线框标注为IFNγ特征序列和核定位序列(NLS)。On.O.nilloticus; Dr.D.rerio; Ip.I.punctatus; Ec.E.coioides; Om.O.mykiss; Tr.T.rubripes; Ca.C.aurtus; Cc.Cyprinus carpio；Hs.H.sapiens; Mm.M.musculus
Figure 1. cDNA and amino acid sequence of O.niloticus γIFN gene
A. The signal peptides are gray boxed; the conserved four-helical cytokine-like/core are white boxed; the putative polyadenylation signal (AATAAAA) is dot-lined. B. The IFNγ signature sequence and nuclear localization sequence (NLS) are dashed boxed; the GenBank accession NO. of D.rerio IFNγ, I.punctatus IFNγ, E.coioides IFNγ, O.mykiss IFNγ, T.rubripes IFNγ, C.aurtus IFNγ, H.sapiens IFNγ, M.musculus IFNγ are listed in Fig. 3.
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图 3 尼罗罗非鱼与其他鱼类γ-干扰素基因的系统进化树
GenBank登录号：鲈形总目：红鳍东方鲀IFNi-CAE82301；斑点绿河豚IFNa-AHZ62714.1；牙鲆IFNl-AB435093；斜带石斑鱼IFNe-JX013936；骨鳔总目：斑点叉尾IFNal-AAZ40504，IFNγ2a-AAZ40505，IFNγ2b-AAZ40506；斑马鱼IFNio-NP_001018629，IFNγ2-NP_998029；兰氏鲫IFNas-BAM09181，IFNγ2-BAM66958；鲤鱼IFNγ-AM168523，IFNγrel-AM261214；金鱼IFNs-ACG68885，IFNγrel-ACV41807；其他：虹鳟IFNo-NP_001153976；人IFNγ-L07633；小鼠IFNγ-NM_008337
Figure 3. Phylogenetic tree based on γIFN gene of O.niloticus and other teleosts
GenBank accession NO.:Percomorpha: T.rubripes IFNb-CAE82301;T.nigroviridis IFNg-AHZ62714.1;P.olivaceus IFNa-AB435093; E.coioides IFNo-JX013936;Ostariophysi: I.punctatus IFNγ1-AAZ40504, IFNγ2a-AAZ40505, IFNγ2b-AAZ40506; D.rerio IFNio-NP_001018629, IFNγ2-NP_998029;C.auratus langsdorfii IFNγ1-BAM09181, IFNγ2-BAM66958;C.carpio IFNγ-AM168523, IFNγrel-AM261214;C.auratus IFNa-ACG68885, IFNγrel-ACV41807;O.mykiss IFNk-NP_001153976; H.sapiens IFNγ-L07633;M.musculus IFNγ-NM_008337
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图 2 尼罗罗非鱼γ-干扰素基因蛋白三级结构的模型
Figure 2. Protein tertiary structure model of O.niloticus γIFN
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图 4 尼罗罗非鱼γ-干扰素基因mRNAs在不同组织中的表达
以18S rRNA基因为内参基因，计算各组织表达量与表达量最低组织的表达量的倍数(数据点表示平均值±标准误，n=6)；标注具相同字母的各柱间，表示差异不显著(P>0.05)；反之，表示差异显著(P < 0.05)。
Figure 4. Tissue distribution of O.niloticus γ-IFN mRNAs measured by qPCR
Expression values were normalized to those of 18S rRNA gene. Data were expressed as the mean fold change (X±SE, n=6). Bars with different letters indicate significant difference (P < 0.05).
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图 5 受无乳链球菌感染后尼罗罗非鱼γ-干扰素基因mRNAs组织表达的变化
以18S rRNA为内参，计算各组织表达量与空白组织的表达量的倍数。*表示差异显著(P < 0.05)。
Figure 5. Temporal expression profile of the γIFN mRNAs of O.niloticus challenged by S.agalactiae measured by qPCR
Expression values were normalized to those of 18S rRNA. Data were expressed as the mean fold change from the control group. Significant difference among the samples at different time in the same tissue is indicated with asterisk (P < 0.05).
表 1 尼罗罗非鱼γ-IFN基因的克隆及qPCR引物序列
Table 1 Primers for Nile tilapia γ-IFN gene clone and qPCR analysis
引物 primer 引物序列(5′→3′) primer sequence 用途 purpose F1 ATGGCTACCACAGTGAGGGC 扩增γ-IFN基因 R1 CCTTTTAAACTCTGGGGCGA 扩增γ-IFN基因 F2 GGGTGGTGTTTTGGAGTCGT qPCR R2 TAGCGAGCCTGAGTTGTTGGT qPCR 18S-F CCTGAGAAACGGCTACCACAT qPCR 18S-R CAGACTTGCCCTCCAATGGAT qPCR 
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