海洋红酵母(Rhodotorula mucilaginosa)是从海泥中分离出的单细胞真核生物，含有丰富的蛋白质、碳水化合物、不饱和脂肪酸、维生素、消化酶、生长因子及以虾青素为主的类胡萝卜素等多种营养物质^[1-3]。海洋红酵母作为生态养殖中广泛应用的饲料添加剂，具有促进水生动物生长、显著提高抗氧化能力、提高成活率和增强机体的非特异性免疫能力的作用^[4-5]。目前，海洋红酵母主要作为饵料应用于水产动物(鱼、虾、贝、蟹等)工厂化育苗以及轮虫养殖和营养强化，也可作为饲料添加剂应用于水产动物养殖，能促进生长发育，提高生长率，同时还对改善水质、预防疾病起到积极作用^[5-6]。目前在大菱鲆(Scophthalmus maximus L.)、凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)等水产动物上已开展相关研究^{[4-5, 7]}。

尼罗罗非鱼(Oreochromis niloticus)，是联合国粮农组织向世界各国推荐的养殖鱼类之一，2012年中国罗非鱼产量145×10⁴ t，居世界首位^[8-9]，而有关罗非鱼饲料中海洋红酵母的适宜添加量以及作用效果的研究尚未见报道。该实验通过在饲料中添加不同水平的海洋红酵母，研究其对罗非鱼幼鱼生长性能、消化酶活性以及相关免疫酶活性的影响，探讨罗非鱼幼鱼饲料中海洋红酵母的最适添加量，为海洋红酵母在罗非鱼幼鱼饲料中的应用提供依据。

1.   材料与方法

1.1   实验饲料

海洋红酵母由广州市欣海利生生物科技有限公司提供。海洋红酵母营养成分组成为：水分81.17%、粗蛋白9.27%、总糖4.2%、β-葡聚糖1.3%、β-胡萝卜素1.4 mg · kg^-1、虾青素1.0 mg ·kg^-1和维生素E 172 mg · kg^-1。

采用鱼粉、豆粕和花生粕为主要蛋白源，配制粗蛋白水平为31.2%的6组饲料(表 1)。分别为对照组(不添加)、添加1 g · kg^-1、2 g · kg^-1、3 g ·kg^-1、4 g · kg^-1和5 g · kg^-1的海洋红酵母组。所有原料粉碎过40目筛后混合均匀，制成直径为1.5mm和2.0 mm的沉性颗粒饲料(F-26(Ⅲ)型双螺旋杆挤条机)，将饲料放置在空调房内抽干，置于-20 ℃冰箱中保存备用。

表  1  罗非鱼基础饲料配方和营养成分(干物质)

Table  1.  Formulation and proximate composition of experimental diets of Nile tilapia (dry matter) %

原料 ingredient	饲料成分组成 dietary composition
鱼粉fishmeal	8
大豆粕soybean meal	30
花生粕peanut meal	15
次粉wheat flour	30
玉米淀粉corn starch	8
鱼油fish oil	5
维生素预混料1 vitamin mixture	1
矿物质预混料2 mineral mixture	1.5
氯化胆碱(50%) choline choride(50%)	1
卵磷脂lecithin	0.5
营养成分nutrient levels
干物质dry matter	88.9
粗蛋白crude protein	31.6
粗脂肪crude lipid	6.9
灰分ash	7.6
注：1. 多维(g · kg-1)：VD3 0.1；VE 80；VK3 15；烟酸121；核黄素22；VB6 10；VB1 10；VB12 10；泛酸钙10；生物素0.06；叶酸0.82；肌醇450；微晶纤维素9 271.02；2. 多矿(g · kg-1)：FeSO4 · 6H2O 85；MgSO4 · 7H2O 500；NaH2PO4 4 000；NaCl 1 740；CuSO4 · 5H2O 3.4；ZnSO4 · H2O 30；CoCl2 ·6H2O 40；MnSO4 · H2O 7；沸石粉3 337.1 Note：1. Vitamin premix (g · kg-1)：VD3 0.1；VE 80；VK3 15；VB3 121；VB2 22；VB6 10；VB1 10；VB12 10；Calcium pantothenate 10；Biotin 0.06；Folic acid 0.82；Inositol 450；Cellulose 9 271.02；2. Mineral premix (g · kg-1): FeSO4 ·6H2O 85；MgSO4 · 7H2O 500；NaH2PO4 4 000；NaCl 1 740；CuSO4 · 5H2O 3.4；ZnSO4 · H2O 30；CoCl2 · 6H2O 40；MnSO4 · H2O 7；Zeolite 3 337.1

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1.2   实验对象及实验管理

实验在中国水产科学研究院南海水产研究所深圳试验基地室内养殖系统进行。选择当年鱼种进行实验，经2周暂养，商品料驯化后，随机选择体质健康、平均体质量为(5.22±0.01) g的尼罗罗非鱼作为实验对象，在500 L自动充气玻璃纤维桶淡水养殖系统中进行养殖实验。实验分为6个处理，每个处理3个重复，每个重复20尾鱼。每天投喂2次，投喂时间分别为08: 30和17: 30，投饲量以体质量的2%~5%为准，以实时摄食量适当调节。温度25.7~30.2 ℃，溶氧5 g · L^-1以上，流水速度4 mL · s^-1。正式养殖56 d后结束，称质量、测量体长和采样等。

1.3   采样与处理

饲养实验结束后禁食24 h，每桶随机取5尾鱼放置在-20 ℃冰箱中保存用于体成分测定。每桶随机选取3尾鱼，每组9尾罗非鱼，用丁香酚(1 : 10 000)(上海医疗器械股份有限公司)麻醉^[10]，依次给每尾鱼称质量和量体长。然后立即剖开腹部，剥离出肝脏并称质量。同时采取胃、肠道和肝脏，-80 ℃冻存备用。

1.4   测定指标与方法

1.4.1   生长和形体指标

分别按下式计算增重率(weight gain，WG)、特定生长率(specific growth rate，SGR)、饲料系数(feed conversion ratio，FCR)、肝体比(hepatosomatic index，HSI)：

增重率(WG，%)=100×(W_t－W₀)/W₀

特定生长率(SGR)=100×(lnW_t－lnW₀)/t

饲料系数(FCR)=FI/(W_t－W₀)

肝体比(HSI)=W_h/W

其中W_t为实验结束时罗非鱼平均体质量(g)，W₀为实验开始时罗非鱼平均体质量(g)，t为养殖时间(d)，FI为实验期间罗非鱼摄食饲料的干物质质量(g)，W_h为所取肝脏的质量(g)，W为所取肝脏的罗非鱼体质量(g)。

1.4.2   鱼体营养成分分析

粗蛋白采用凯氏定氮法测定(Foss，2300)，粗脂肪采用索氏抽提法测定(Foss，2050)，水分采用105 ℃烘干法测定，粗灰分采用550 ℃马弗炉灼烧法测定(YATNATO，FO610C)。

1.4.3   酶活性测定

胃蛋白酶采用比色法测定；胰蛋白酶采用紫外比色法测定；淀粉酶采用淀粉-碘比色法测定；脂肪酶采用比色法测定。试剂盒均购自南京建成生物工程研究所。肝脏溶菌酶(lysozyme，LYZ)活力利用溶壁微球菌使用自身对照法测定；一氧化氮合成酶(Nitric Oxide Synthase，NOS)采用比色法测定。

1.5   数据处理

采用Excel 2010和SPSS 19.0软件对数据进行统计分析，先对数据进行单因素方差分析(ANOVA)，处理若有显著差异，再进行Duncan′s多重比较，P＜0.05表示差异显著，所有数值用平均数±标准差(X±SD)表示。

2.   结果与分析

2.1   对罗非鱼生长的影响

由表 2可知，实验组的末均质量、增重率和特定生长率随饲料中海洋红酵母添加量的增加呈先增加后降低的趋势，饲料系数则与之相反，呈先降低后增加的趋势(P＞0.05)。实验组的末均质量、增重率和特定生长率均优于照组，但差异不显著(P＞0.05)。2 g · kg^-1和4 g · kg^-1组的饲料系数显著低于对照组(P＜0.05)，但1 g · kg^-1、3 g · kg^-1和5 g · kg^-1组则与对照组没有显著性差异(P>0.05)。与对照组相比，1 g · kg^-1组的肝体比有增加的趋势，其余各组有降低的趋势，但是差异都不显著(P＞0.05)；4 g · kg^-1组的肝体比显著低于1 g ·kg^-1组(P＜0.05)。

表  2  饲料中添加不同水平的海洋红酵母对罗非鱼生长的影响

Table  2.  Effect of dietary R.mucilaginosa on growth performance of Nile tilapia

指标 indicator	海洋红酵母添加量level of R.mucilaginosa
	对照组control	1 g·kg-1	2 g·kg-1	3 g·kg-1	4 g·kg-1	5 g·kg-1
初始平均质量/g initial mean weight	5.23±0.03	5.18±0.02	5.26±0.04	5.23±0.04	5.23±0.07	5.21±0.05
终末平均质量/g final mean weight	62.02±0.25	63.58±0.59	63.85±0.93	62.87±0.03	63.20±0.97	63.20±0.55
特定生长率/%·d-1 specific growth rate	4.76±0.02	4.79±0.02	4.80±0.04	4.80±0.02	4.78±0.01	4.77±0.02
增重率/% weight gain	1 086±11	1 128±16	1 114±28	1 112±13	1 101±9	1 108±32
饲料系数feed conversion ratio	0.98±0.00c	0.99±0.01c	0.94±0.02ab	0.96±0.00bc	0.93±0.01a	0.97±0.01bc
肝体比/% hepatosomatic index	1.74±0.08ab	1.82±0.11b	1.64±0.07ab	1.70±0.09ab	1.51±0.07a	1.67±0.0.08ab
注：同一行数值不同上标字母表示差异显著(P＜0.05)。 Note：Values in the same column with different letter are significantly different from each other (P＜0.05).

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2.2   对罗非鱼体成分的影响

由表 3可知，各处理组鱼体的水分和粗脂肪含量没有显著性差异(P>0.05)。鱼体粗蛋白含量呈先增加后降低的趋势(表 3)。5 g · kg^-1组鱼体粗蛋白含量显著低于1 g · kg^-1和2 g · kg^-1组(P＜0.05)。其他各组之间鱼体粗蛋白含量差异不显著(P>0.05)。1 g · kg^-1、3 g · kg^-1和5 g · kg^-1组鱼体粗灰分含量显著低于对照组(P＜0.05)，2 g · kg^-1组和4 g · kg^-1组间的粗灰分含量有降低的趋势，但是差异不显著(P>0.05)。

表  3  饲料中添加不同水平的海洋红酵母对罗非鱼体成分的影响

Table  3.  Effect of dietary R.mucilaginosa on body composition of Nile tilapia %

海洋红酵母添加量 level of R.mucilaginosa	水分 moisture	粗蛋白 crude protein	粗脂肪 crude fat	灰分 ash
对照组control	56.86±4.32	52.69±0.77ab	34.23±3.11	13.45±0.16c
1 g·kg-1	55.82±2.35	54.27±0.96b	34.22±2.06	12.30±0.14a
2 g·kg-1	55.07±2.82	54.41±0.72b	32.30±2.51	13.05±0.13bc
3 g·kg-1	59.47±2.31	53.09±0.23ab	30.16±3.45	12.32±0.23a
4 g·kg-1	55.74±1.95	53.37±0.31ab	31.30±5.70	12.94±0.23bc
5 g·kg-1	58.16±2.31	52.05±0.26a	30.94±4.15	12.50±0.16ab
注：同一列数值不同上标字母表示差异显著(P＜0.05)，后表同此。 Note：Values in the same column with different letter are significantly different from each other (P＜0.05).The same case in the following table.

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2.3   对尼罗罗非鱼消化酶活性的影响

2.3.1   对尼罗罗非鱼蛋白酶活性的影响

随着饲料中海洋红酵母添加量的增加，罗非鱼胃、肝脏和肠道(前、中、后肠)的蛋白酶活性呈先升高后降低的趋势(图 1和图 2)。1 g · kg^-1组胃蛋白酶活性显著高于对照组(P＜0.05)，3 g · kg^-1、4 g · kg^-1和5 g · kg^-1组胃蛋白酶活性都显著低于对照组(P＜0.05)，2 g · kg^-1组有增加的趋势，但是差异不显著(P>0.05)。1 g · kg^-1组肝脏蛋白酶活性显著高于对照组(P＜0.05)，2 g · kg^-1、3 g · kg^-1、4 g · kg^-1和5 g · kg^-1组肝脏蛋白酶活性显著低于对照组(P＜0.05)。1 g ·kg^-1组前肠蛋白酶活性显著高于对照组(P＜0.05)，3 g · kg^-1~5 g · kg^-1组前肠蛋白酶活性显著低于对照组(P＜0.05)，2 g · kg^-1组有增加的趋势，但是差异不显著(P>0.05)。1 g · kg^-1、2 g · kg^-1、3 g · kg^-1和4 g · kg^-1组中肠蛋白酶活性均显著高于对照组(P＜0.05)，5 g · kg^-1组中肠蛋白酶活性则与之相反，显著低于对照组(P＜0.05)。与对照组相比，3 g · kg^-1组后肠蛋白酶活性显著升高(P＜0.05)，5 g · kg^-1组后肠蛋白酶活性显著降低(P＜0.05)，其他各组后肠蛋白酶活性与对照组之间没有显著差异(P>0.05)。

图  1  饲料中添加不同水平的海洋红酵母对罗非鱼胃蛋白酶活性的影响

Figure  1.  Effect of dietary R.mucilaginosa on pepsin activity of Nile tilapia

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图  2  饲料中添加不同水平的海洋红酵母对罗非鱼蛋白酶活性的影响

Figure  2.  Effect of dietary R.mucilaginosa on protease activity of Nile tilapia

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2.3.2   对尼罗罗非鱼淀粉酶活性的影响

随饲料中海洋红酵母添加量的增加，罗非鱼胃、肝脏和肠道(前、中、后肠)的淀粉酶活性呈升高的趋势(图 3)。2 g · kg^-1、3 g · kg^-1和4 g · kg^-1组胃淀粉酶活性显著高于对照组(P＜0.05)，1 g ·kg^-1和5 g · kg^-1组胃淀粉酶活性有增加的趋势，但是差异不显著(P>0.05)。2 g ·kg^-1组肝脏淀粉酶活性显著高于对照组(P＜0.05)，1 g · kg^-1、3 g · kg^-1、4 g · kg^-1和5 g · kg^-1组肝脏淀粉酶活性有增加的趋势，但是差异不显著(P>0.05)。1 g · kg^-1、2 g · kg^-1、3 g · kg^-1、4 g · kg^-1和5 g · kg^-1组前肠淀粉酶活性均显著高于对照组(P＜0.05)。与对照组相比，1 g · kg^-1、2 g · kg^-1和3 g · kg^-1组中肠淀粉酶活性显著升高(P＜0.05)，4 g · kg^-1组中肠淀粉酶活性有增加的趋势，5 g · kg^-1组中肠淀粉酶活性有降低的趋势，但是差异不显著(P>0.05)。5 g · kg^-1组后肠淀粉酶活性显著高于对照组(P＜0.05)，1 g · kg^-1、2 g · kg^-1、3 g · kg^-1和4 g · kg^-1组后肠淀粉酶活性有增加的趋势，但是差异不显著(P>0.05)。

图  3  饲料中添加不同水平的海洋红酵母对罗非鱼淀粉酶活性的影响

Figure  3.  Effect of dietary R.mucilaginosa on amylase activity of Nile tilapia

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2.3.3   对尼罗罗非鱼脂肪酶活性的影响

由图 4可知，各组之间的罗非鱼胃脂肪酶活性没有显著差异(P>0.05)。5 g · kg^-1组肝脏脂肪酶活性显著高于对照组(P＜0.05)，1 g · kg^-1、3 g ·kg^-1和4 g · kg^-1组肝脏脂肪酶活性有降低的趋势，2 g · kg^-1组肝脏脂肪酶活性有增加的趋势，但是差异都不显著(P>0.05)。2 g · kg^-1、3 g · kg^-1、4 g · kg^-1和5 g · kg^-1组前肠脂肪酶活性均显著高于对照组(P＜0.05)，1 g · kg^-1组前肠脂肪酶活性有增加的趋势，但是差异不显著(P>0.05)。1 g · kg^-1、2 g · kg^-1、3 g · kg^-1和5 g · kg^-1组中肠脂肪酶活性均显著高于对照组(P＜0.05)，4 g ·kg^-1组中肠脂肪酶活性有降低的趋势，但是差异不显著(P>0.05)。1 g ·kg^-1、2 g · kg^-1、3 g ·kg^-1组后肠脂肪酶活性显著高于对照组(P＜0.05)，4 g · kg^-1和5 g ·kg^-1组后肠脂肪酶活性有降低的趋势，但是差异不显著(P>0.05)。

图  4  饲料中添加不同水平的海洋红酵母对罗非鱼脂肪酶活性的影响

Figure  4.  Effect of dietary R.mucilaginosa on lipase activity of Nile tilapia

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2.4   对尼罗罗非鱼肝脏免疫酶活性的影响

随饲料中海洋红酵母添加量的增加，罗非鱼肝脏溶菌酶和一氧化氮合酶活性都呈先升高后降低的趋势(表 4)。2 g · kg^-1和3 g · kg^-1组肝脏溶菌酶活性均显著高于对照组(P＜0.05)，1 g ·kg^-1、4 g ·kg^-1和5 g · kg^-1组肝脏溶菌酶活性有增加的趋势，但是差异不显著(P>0.05)。类似地，与对照组相比，2 g · kg^-1和3 g · kg^-1组肝脏一氧化氮合酶活性均显著升高(P＜0.05)，1 g ·kg^-1、4 g · kg^-1和5 g · kg^-1组肝脏一氧化氮合酶活性有增加的趋势，但是差异不显著(P>0.05)。

表  4  饲料中添加不同水平的海洋红酵母对罗非鱼肝脏免疫酶活性的影响

Table  4.  Effect of dietary R.mucilaginosa on hepatic lysozyme and nitric oxide synthase activities of Nile tilapia U · mL^-1

海洋红酵母添加量 level of R.mucilaginosa	溶菌酶 LYZ	一氧化氮合酶 NOS
对照组control	0.62±0.08a	0.62±0.08a
1 g·kg-1	1.22±0.15a	1.16±0.21a
2 g·kg-1	99.03±2.96c	105.20±3.21c
3 g·kg-1	82.28±4.50b	88.24±6.50b
4 g·kg-1	6.84±0.16a	6.58±0.09a
5 g·kg-1	2.71±0.23a	2.71±0.23a

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3.   讨论

海洋红酵母及其产生的生长因子和消化酶类能有效促进水产动物对营养素的消化吸收，提高其生长速度和对饲料的利用率^[10]。海洋红酵母含有的营养因子能够帮助有益菌的生长，饲料中添加海洋红酵母(Rhodotorula benthica)，能够促进哺乳母猪采食性能的提高^[11]。饲料中添加1 g · kg^-1海洋红酵母(R.benthica)对大菱鲆的体成分和形体指标的影响不显著，但能显著提高大菱鲆对红鱼粉替代白鱼粉饲料的摄食率、蛋白效率和生长性能，使得红鱼粉替代组的饲料性能达到白鱼粉组的生长水平^[4]。在海洋红酵母(R.benthica)和微生态饲料添加剂的对照实验中，发现海洋红酵母显著增加了对虾的末均质量^[1]。在饲料中添加一定量的海洋红酵母(R.benthica)后，能提高日本对虾(Penaeus japonicus)幼虾的成活率，促进其生长^[12]。海洋红酵母也显著提高了凡纳滨对虾的增重率和特定生长率^[13]。添加海洋红酵母(R.mucilaginosa)的实验鱼的末均质量、增重率和特定生长率随饲料中海洋红酵母添加量的增加均优于照组，但差异不显著。在对大菱鲆4周养殖实验中，也发现其摄食率、相对增重率、特定生长率和饵料系数均没有显著差异，在白鱼粉为主的大菱鲆饲料中添加海洋红酵母(R.benthica)0.5~1.5 g · kg^-1不能提高大菱鲆的摄食和生长性能^[5]。笔者认为，导致以上研究结果不一致的原因可能与红酵母的种类、实验鱼的种类和规格以及养殖周期、饲料配方等有关。

鱼类消化酶对食物的催化作用易受饲料和外界环境因素的影响，饲料不仅影响消化酶活性和分布，而且还可影响酶的分泌，饲料中营养物质影响消化酶的活性，蛋白质含量影响各种消化酶的活性，脂肪含量影响消化道脂肪酶和淀粉酶活性^[14-15]。养殖水体温度的变化对消化酶活性具有显著的影响^[16-17]。饲料中添加沼泽生海洋红酵母(R.paludigenum)显著提高凡纳滨对虾肝胰腺中蛋白酶和脂肪酶活性，但是对肝胰腺中淀粉酶没有显著影响^[18]。饲料中添加一定量的海洋红酵母能够显著提高罗非鱼消化道蛋白酶、淀粉酶和脂肪酶的活性，表明海洋红酵母能够提高罗非鱼消化酶的活性，增强其对营养物质的消化吸收能力，进而促进鱼体生长。

海洋红酵母含有丰富的类胡萝卜素、维生素E和β-葡聚糖。类胡萝卜素通过消除自由基维护细胞膜的稳定性^[19]，具有增强免疫功能的作用^[20]。类胡萝卜素(从红假单胞菌中提取)可以显著提高罗非鱼的生长性能，增强其非特异性免疫因子血清溶菌酶的活性，通过调节免疫功能提高罗非鱼的生长性能^[21]。饲料中添加适量的维生素E(300 mg ·kg^-1)可以促进尼罗罗非鱼的生长，提高其溶菌酶活力和巨噬细胞的吞噬活性，但过量的维生素E(>1 000 mg · kg^-1)会抑制其生长^[22]。该实验中由海洋红酵母提供的类胡萝卜素和维生素E含量都较低，对尼罗罗非鱼的生长和非特异性免疫可能起到辅助作用。

在饲料中添加β-葡聚糖和肽聚糖未能促进罗非鱼生长，而且复合肽聚糖还会抑制其生长^[23]。多糖会抑制尼奥罗非鱼的生长，降低脂肪沉积率^[24]。酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)提取物甘露寡糖可以显著促进尼罗罗非鱼的生长，提高其抵抗病原菌的能力^[25]。益生菌产物β-葡聚糖具有免疫调节作用^[26-27]。异育银鲫(Carassius auratus gibelio)短时间(28 d)投喂酵母β-葡聚糖(200 mg ·kg^-1)饲料可以增强抵抗嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)的能力，具有促生长作用^[28]；鲤(Cyprinus carpio)长时间(60 d)投喂β-葡聚糖饲料，虽然对生长性能没有显著影响并且降低其对嗜水气单胞菌的抵抗力，但可以提高其肝脏溶菌酶和酸性磷酸酶的活性^[29]。该实验中，随着海洋红酵母添加量的增加，肝脏溶菌酶和一氧化氮合酶活性呈现先升高后降低的趋势，投喂1~2 g · kg^-1的海洋红酵母依然可以提高尼罗罗非鱼的免疫酶活性；但是，高浓度海洋红酵母(3~5 g · kg^-1组)会抑制罗非鱼的免疫能力，可能是因为长期投喂高浓度的β-葡聚糖导致的免疫疲劳。

4.   结论

饲料中添加海洋红酵母可以促进罗非鱼的生长，提高其消化酶活性和增强其非特异性免疫能力。根据尼罗罗非鱼幼鱼的生长性能、消化酶及免疫酶活性等指标综合分析得出，海洋红酵母在罗非鱼饲料中的建议添加量为2~3 g · kg^-1。