Analysis of population genetic structure of bullet tuna(Auxis rochei) in the South China Sea based on mitochondrial control region sequences
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摘要:
利用线粒体控制区(D-loop)高变区序列作为遗传标记，分析了中国南海5°N~21°N之间7个圆舵鲣(Auxis rochei)地理群体的遗传结构特征。201尾样本的D-loop区序列共检测到185种单倍型。各个采样点均呈现出很高的单倍型多样性(0.958 2~1.000 0)和较高的核苷酸多样性(0.034 327~0.041 235)的特征。单倍型邻接关系树未呈现与地理群体对应的谱系结构。分子方差分析和成对遗传分化系数(FST)显示南海海域圆舵鲣的遗传变异主要来自群体内(98.33%)，群体间基因交流频繁，是一个随机交配群。核苷酸不配对分布和中性检验表明南海圆舵鲣在更新世晚期曾经历过种群的快速扩张。结果表明，南海圆舵鲣具有丰富的遗传多样性水平，遗传分化不显著，在渔业上可以作为一个单元来管理。
Abstract:Based on hypervariable region of mitochondrial control region (D-loop) sequences, we examined the population genetic structure of the bullet tuna (Auxis rochei) collected from seven locations between 5°N to 21°N in the South China Sea. A total of 185 haplotypes were defined from 201 individuals of fishes. The genetic diversity analysis shows that the samples of A.rochei from the seven locations in the South China Sea possessed quite high haplotype diversity (0.958 2~1.000 0) and high nucleotide diversity (0.034 327~0.041 235). The neighbor-joining tree for D-loop haplotypes reveals no significant genealogical clades of the fish samples corresponding to the sampling locations. Analyses of molecular variance and pairwise FST suggest most of the genetic variation (98.33%) was attributed to variability within populations. A high rate of gene flow between different populations implies a panmixia for A.rochei in the South China Sea. Both mismatch distribution analysis and neutrality tests indicate a late Pleistocene expansion in A.rochei. The results demonstrate that A.rochei in the South China Sea belong to the same population with high genetic diversity. Thus, a single-stock management regime can be supported in fishery management.
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在对虾养殖过程中，由于人工投饵和施肥，随着养殖时间的延长，水体中的化学需氧量(COD)、氨氮(NH3-N)和亚硝酸氮(NO2-N)含量不断增加，导致水质恶化，抑制了对虾的生长，甚至引发疾病和造成死亡[1-3]。枯草芽孢杆菌(Bacillus substilis)没有毒性，不会对生物体产生危害[4]，且能利用水体中的有机质，抑制NH3-N和NO2-N的产生[5]。目前，已有学者研究利用枯草芽孢杆菌及其提取物作为添加剂提高对虾抗病力、成活率及饲料利用[6-7]，但利用枯草芽孢杆菌改善凡纳滨对虾(Penaeus vannamei)幼体培育环境水质、提高对虾免疫力的研究未见报道。因此，该试验进行枯草芽孢杆菌改善水质，增强凡纳滨对虾幼体抗病力的研究，以期为对虾的生态育苗提供理论依据。
1. 材料与方法
1.1 试验设计
试验设1个对照组(编号为A0)和5个试验组(依浓度递增顺序编为A1、A2…A5)，试验组枯草芽孢杆菌投放量分别为1.25×102、1.25×103、1.25×104、1.25×105和1.25×106 cfu·mL-1，每组设2个平行组。试验过程中开增氧机，第5天再投放1次。试验水体为0.1 m3的水族箱放养凡纳滨对虾P6期幼体(以下简称对虾)300尾，试验期间不换水，每隔1 d测1次水质指标。20 d后检测相关酶的活性、成活率和增重率。
1.2 试验用对虾和海水
试验用对虾和海水均由湛江中联养殖有限公司提供。海水经沙滤处理。试验期间，投喂博尚牌顶好虾片，每天投喂4次(8：00，12：00，17：00和22：00)，每次投喂0.5 g。
1.3 菌种来源
枯草芽孢杆菌(固态，1.25×1012 cfu·g-1)由广东海洋大学微生物实验室提供。
1.4 水质测定的方法
NH3-N用纳氏试剂法测定；NO2-N采用重氮-偶氮光度法测定；COD用碱性高锰酸钾法测定(CODMn)[8]。
1.5 成活率与增重率
对虾体质量使用50尾对虾进行测量，成活率直接计数。
成活率(%) =收获时存活数目×100/初始放养数目
增重率(%) = (收获时50尾对虾的体质量-初始放养时50尾对虾的体质量) ×100/初始放养时50尾对虾的体质量
1.6 酶活力的测定
每组取50尾对虾，按1 : 5加入对虾生理盐水[9]，置于冰上匀浆，匀浆液0 ℃下，10 000 r·min-1离心10 min，取上清液进行酶活性测定。其中碱性磷酸酶(AKP)、过氧化物酶(POD)、溶菌活力和超氧化物歧化酶(SOD)活力用南京建成生物工程研究所生产的试剂盒测定。酚氧化酶(PO)活力参照以L-dopa为底物比色的方法测定[10]。抗菌活力测定以大肠杆菌为底物，用0.1 mol·L-1(pH 6)的KH2PO4-K2HPO4缓冲液配成OD570=0.4的大肠杆菌悬浮液，按王雷等[9]的方法测定。
1.7 统计分析
用SPSS 13.0对数据进行方差分析和Duncan多重比较。
2. 结果
2.1 水质分析结果
2.1.1 水体中NH3-N的变化
引入枯草芽孢杆菌能降低水体中NH3-N的含量。在投放枯草芽孢杆菌后的第3天，试验组的NH3-N降到最低；从第3天到第7天各组均有所上升；第7天后试验组NH3-N开始下降。A3组的NH3-N浓度平均值比对照组降低了59.70%。随机抽取第3、7和13天的数据进行方差分析，结果均显示对照组与试验组差异极显著(P < 0.01)，但各试验组间差异不显著(P>0.05)(图 1-a)。
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图 1 水体中NH3-N(a)、NO2-N(b)和CODMn(c)的变化Figure 1. Change of NH3-N(a), NO2-N(b) and CODMn(c) in cultured water2.1.2 水体中NO2-N的变化
引入枯草芽孢杆菌能抑制水体中NO2-N的含量。在试验期间，A3组NO2-N≤0.011 mg·L-1且保持较稳定的状态，该组的NO2-N浓度平均值比对照组低88.64%；对照组NO2-N逐渐上升；其余各组在前7 d NO2-N都维持在较低水平，第7天后NO2-N逐渐上升，但始终低于对照组。对第3、7和13天数据进行方差分析，结果显示，第3天各组间无显著差异(P>0.05)；第7天对照组NO2-N含量显著(P < 0.05)高于试验组，各试验组间差异不显著(P>0.05)；第13天对照组NO2-N含量显著高于试验组(P < 0.05)(图 1-b)。
2.1.3 水体中CODMn的变化
枯草芽孢杆菌能有效降解水体中的有机质。在投放枯草芽孢杆菌后的第3天，试验组中的CODMn降到最低；从第3天到第7天各试验组均有所上升；第7天后试验组CODMn下降。在试验期间试验组CODMn一直低于对照组；对照组CODMn随着养殖时间延长而逐渐升高。A3组的CODMn平均值比对照组降低了65.30%。取第3、7和13天的数据进行方差分析，结果均显示对照组与试验组差异极显著(P < 0.01)，但各试验组间差异不显著(P>0.05)(图 1-c)。
2.2 对虾免疫指标的测定
2.2.1 AKP活力测定结果
不同枯草芽孢杆菌投放浓度对对虾AKP活力的影响见图 2-a。枯草芽孢杆菌对AKP活力影响显著(P < 0.05)；投放浓度在1.25×104 cfu·mL-1时AKP活力最大，达31.65 U·gprot-1，比对照组提高3.67倍。Duncan多重比较结果表明，AKP活力最大时的枯草芽孢杆菌初始投放浓度为1.25×104 cfu·mL-1。
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图 2 AKP活力(a)、SOD活力(b)、PO活力(c)、POD活力(d)、抗菌活力(e)、溶菌活力(f)、对虾的成活率(g)和增重率(h)柱形图上标的字母差异是Duncan多重比较的结果，不同字母表示差异显著。Figure 2. Activities of AKP(a), SOD(b), PO(c), POD(d), antibacteria(e), bacteriolysis(f), survival rate of P.vannamei(g)and weight gain (h)of P.vannameiDifferent letters above columns mean significant difference, which is a result from Duncan multiple comparison.2.2.2 SOD活力测定结果
不同枯草芽孢杆菌投放浓度对对虾SOD活力的影响见图 2-b。枯草芽孢杆菌对SOD活力影响显著(P < 0.05)；投放浓度在1.25×104 cfu·mL-1时SOD活力最大，达225.78 U·gprot-1，比对照组提高3.06倍。Duncan多重比较结果表明，SOD活力最大时的枯草芽孢杆菌初始投放浓度为1.25×104 cfu·mL-1。
2.2.3 PO活力测定结果
不同枯草芽孢杆菌投放浓度对对虾PO活力的影响见图 2-c。枯草芽孢杆菌对PO活力影响显著(P < 0.05)；投放浓度在1.25×104 cfu·mL-1时PO活力最大，达3.00 U，比对照组提高了0.45倍。Duncan多重比较结果表明，PO活力最大时的枯草芽孢杆菌初始投放浓度为1.25×104~1.25×105 cfu·mL-1。
2.2.4 POD活力测定结果
不同枯草芽孢杆菌投放浓度对对虾POD活力的影响见图 2-d。枯草芽孢杆菌对POD活力影响显著(P < 0.05)；投放浓度在1.25×104 cfu·mL-1时POD活力最大，达9.70 U·mg prot-1，比对照组提高1.64倍。Duncan多重比较结果表明，POD活力最大时的枯草芽孢杆菌初始投放浓度为1.25×104 cfu·mL-1。
2.2.5 抗菌活力测定结果
不同枯草芽孢杆菌投放浓度对对虾抗菌活力的影响见图 2-e。枯草芽孢杆菌对抗菌活力影响显著(P < 0.05)；投放浓度在1.25×104 cfu·mL-1时抗菌活力最大，达0.35 U·mL-1，比对照组提高2.57倍。Duncan多重比较结果表明，抗菌活力最大时的枯草芽孢杆菌初始投放浓度为1.25×104 cfu·mL-1。
2.2.6 溶菌活力测定结果
不同枯草芽孢杆菌投放浓度对对虾溶菌活力的影响见图 2-f。枯草芽孢杆菌对溶菌活力影响极显著(P < 0.01)；投放浓度在1.25×104 cfu·mL-1时溶菌活力最大，达219.04 U·mL-1，比对照组提高2.14倍。Duncan多重比较结果表明，溶菌活力最大时的枯草芽孢杆菌初始投放浓度为1.25×104 cfu·mL-1。
2.3 成活率与增重率
2.3.1 成活率
不同浓度枯草芽孢杆菌对对虾成活率的影响见图 2-g。枯草芽孢杆菌对对虾成活率影响显著(P < 0.05)；当投放浓度为1.25×104 cfu·mL-1时，成活率最高，达到97.83%，比对照组增加了10.00%。Duncan多重比较结果表明，成活率最高时的枯草芽孢杆菌使用量为1.25×104 cfu·mL-1。
2.3.2 增重率
不同浓度枯草芽孢杆菌对对虾增重率的影响见图 2-h。不同浓度梯度枯草芽孢杆菌对对虾增重率影响极显著(P < 0.01)；当投放浓度达到1.25×104 cfu·mL-1时，增重率最高，达到432.31%，是对照组的2.44倍。Duncan多重比较结果表明，增重率最高时的枯草芽孢杆菌使用量为1.25×104 cfu·mL-1。
3. 讨论
3.1 枯草芽孢杆菌对水质的改善作用
枯草芽孢杆菌在水中增殖后产生的许多胞外酶能把养殖水体和底泥中的淀粉、蛋白质和脂肪等有机质分解，从而达到降低养殖水体富营养化和减少底泥生成的作用。在分解过程中，有机物一部分转化为细菌胞体物质，而大部分被转化为细菌生命活动过程中所需能量，同时氨气、氮气和二氧化碳等代谢终产物从水中弥散到空气中。通过这种方法，养殖水体中的NH3-N和NO2-N可显著减少[11]。枯草芽孢杆菌能迅速而有效地降低水中NO2-N的含量并显著降低水体的COD[12]；有研究发现使用枯草芽孢杆菌后NH3-N最大降解值出现在使用后的第3~4天，NO2-N的最大降解值出现在使用后的第3天[13]。这与此试验的研究结果一致，有可能是由枯草芽孢杆菌的生长周期决定的。虽然枯草芽孢杆菌30 ℃时的世代时间为31 min，每24 h可分裂46次，增殖数为7.0×1013个。事实上由于种种客观条件的限制，细菌的指数分裂速度只能维持数小时，因而在液体培养中，细菌的浓度一般仅能达到每毫升108~109个左右[14-15]。由此试验的初始浓度，如果按照每天指数分裂3~4 h计算，枯草芽孢杆菌的浓度最大值应该出现在第3天。试验期间，试验组的COD、NH3-N和NO2-N含量均显著(P < 0.05)低于对照组；当枯草芽孢杆菌使用浓度为1.25×104 cfu·mL-1时，COD、NH3-N和NO2-N含量均值比对照组分别降低了65.30%、59.70%和88.64%。成活率比对照组提高了10%，增重率是对照组的2.44倍；这可能是由于NH3-N、NO2-N和有机物等对对虾的生长造成胁迫，而枯草芽孢杆菌能利用有机物降低水体中的NH3-N和NO2-N，进而提高对虾成活率与增重率。因此，适宜浓度的枯草芽孢杆菌能改善养殖水体的水质，促进对虾生长。
3.2 NH3-N与NO2-N对对虾免疫指标的影响
高浓度NH3-N和NO2-N对虾体有致死作用[16]，即使在低于致死浓度的条件下对对虾生理功能(如氧消耗、氨排泄、ATPase活性及渗透压)也有显著影响[17]。甲壳类动物血液中的血蓝蛋白，其辅基是含铜的化合物，水体中的NO2-N进入虾类的血淋巴后，促使氧合血蓝蛋白转化为脱氧血蓝蛋白，导致血淋巴对氧的亲和性降低，从而降低了机体的输氧能力[18]，因此会对机体产生毒害作用。已有研究表明，水体中NH3-N浓度过高会导致中国对虾(Penaeus chinesis)血清中PO、SOD和溶菌酶活力下降[19]；NO2-N可降低日本对虾(P.japonicus)和罗氏沼虾(Macrobrachium rosenbergi)的抗病力水平、血细胞吞噬活力以及对细菌的清除效率[20]；高浓度的NO2-N降低了凡纳滨对虾的血细胞数、SOD活力、PO活力、抗菌活力和溶菌活力[21]。此试验表明，在枯草芽孢杆菌使用浓度为1.25×104 cfu·mL-1时，养殖水体中COD、NH3-N和NO2-N含量均值比对照组分别降低了65.30%、59.70%和88.64%；凡纳滨对虾的AKP、POD、PO、SOD、抗菌和溶菌活力均显著(P < 0.05)提高，相对于对照组分别提高了3.67、1.64、0.45、3.06、2.57和1.14倍。因此，枯草芽孢杆菌可以通过降低水体中NH3-N和NO2-N浓度，进而提高免疫相关酶的活性，增强对虾抗病力。基于试验结果，在对虾育苗过程中枯草芽孢杆菌的建议使用浓度为1.25×104 cfu·mL-1。
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图 1 圆舵鲣采样点示意图
南海九段线参见彩色宣传页的调查区域图
Figure 1. Map of sampling sites for A.rochei in the South China Sea
For information about the nine-dash line of the South China Sea, see the survey area map on the colored leaflet.
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图 2 圆舵鲣D-loop区单倍型邻接系统发育树
每一枝的末端代表单倍型来源群体；各分支标记大于70%的自展值
Figure 2. Neighbor-joining tree for D-loop haplotypes of A.thazard
The tails of branches represent the populations for each haplotypes. Bootstrap supports of >70% are shown at nodes.
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图 3 圆舵鲣D-loop区序列单倍型核苷酸不配对分布曲线
Figure 3. Mismatch distribution of D-loop haplotypes for A.rochei
表 1 南海圆舵鲣样本信息及D-loop区遗传多样性参数
Table 1 Specimen information of A.rochei and genetic diversity parameters based on D-loop sequences
采样点
sampling site采样时间
sampling date经度/纬度
longitude/latitude样本量(N)
number of samples单倍型数量(H)
number of haplotypes多态性位点数(S)
number of polymorphic sites单倍型多样性
(h±SD) haplotype diversity核苷酸多样性
(π±SD) nucleotide diversityA 2014-11-22 108°03′E /18°12′N 30 30 103 1.000 0±0.008 6 0.034 966±0.017 627 B 2015-03-17 112°58′E /18°29′N 42 34 130 0.958 2±0.025 3 0.037 692±0.018 765 C 2015-04-22 116°53′E /20°28′N 36 36 125 1.000 0±0.006 5 0.035 815±0.017 933 D 2013-03-27 115°32′E /11°01′N 38 35 116 0.994 3±0.008 2 0.037 030±0.018 494 E 2013-03-20 110°31′E / 5°34′N 32 32 103 1.000 0±0.007 8 0.034 327±0.017 276 F 2014-11-28 112°03′E /20°14′N 10 9 31 0.977 8±0.054 0 0.034 347±0.018 732 G 2013-04-05 117°28′E /15°04′N 13 13 83 1.000 0±0.030 2 0.041 235±0.021 749 总计 total - - 201 185 202 0.997 2±0.001 5 0.036 807±0.017 981 
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表 2 圆舵鲣5个地理群体D-loop区遗传变异的分子方差分析
Table 2 Analysis of molecular variance for five populations of A.rochei based on D-loop sequences
变异来源
source of variation自由度
degree of freedom变异百分比
percentage of variation分化系数
F statisticsP值
P value群体间 among populations 4 1.67 FST = 0.016 74 0.000 50 群体内 within populations 173 98.33 所有样本 total 177
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表 3 圆舵鲣两两地理群体间D-loop区的遗传分化系数(对角线下方)及显著性水平(对角线上方)
Table 3 Pairwise FST (below diagonal) and P values (above diagonal) among geographic populations of A.rochei based on D-loop sequences
A B C D E A 0.004 36 0.056 23 0.327 59 0.429 86 B 0.036 45 0.001 09 0.002 48 0.005 35 C 0.015 65 0.033 77 0.847 24 0.336 11 D 0.002 12 0.034 59 -0.007 26 0.645 38 E -0.000 13 0.033 57 0.001 82 -0.003 69
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表 4 圆舵鲣两两地理群体间随机交配假设检验的显著性水平
Table 4 P values of exact test of sample differentiation of A.rochei based on D-loop haplotype frequencies
A B C D B 0.000 01 C 1.000 00 0.000 01 D 0.128 85 0.000 01 0.128 70 E 1.000 00 0.001 60 1.000 00 0.112 95
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表 5 圆舵鲣D-loop区序列核苷酸不配对分布分析的参数估计值
Table 5 Mismatch distribution parameter estimates for A.rochei based on D-loop sequence
核苷酸不配对分布 mismatch distribution 吻合度检验 goodness-of-fit test 扩张时间
τ初始值
θ0最终值
θ1平方和
SSD显著性
P粗糙指数
HRI显著性
PA 21.7 0.003 52 248.325 00 0.001 82 0.817 20 0.003 80 0.926 20 B 19.8 3.636 91 152.992 97 0.004 68 0.202 30 0.011 64 0.016 80 C 21.3 0.047 46 387.304 30 0.001 53 0.713 70 0.004 09 0.710 80 D 22.7 0.007 03 189.716 41 0.001 71 0.740 30 0.004 31 0.653 60 E 19.9 0.451 76 703.750 00 0.001 40 0.818 30 0.004 54 0.735 10 总计 total 21.8 0.029 88 219.521 48 0.000 37 0.680 50 0.001 35 0.831 20
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表 6 圆舵鲣D-loop区序列的Tajima′s D和Fu′s FS统计值及显著性水平
Table 6 Tajima′s D, Fu′s FS statistics, corresponding P values for A.rochei based on D-loop sequences
Tajima′s D Fu′s FS D P FS P A -0.858 93 0.208 60 -15.264 13 0.000 40 B -1.044 75 0.145 60 -7.948 97 0.022 00 C -1.170 23 0.113 00 -20.597 32 0.000 01 D -0.851 71 0.203 60 -13.510 01 0.000 80 E -0.840 11 0.209 60 -17.268 99 0.000 01 总计 total -1.215 72 0.089 00 -23.701 30 0.003 60
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