大黄鱼(Pseudosciaena crocea)、鱼(Miichthys miiuy)和美国红鱼(Sciaenops ocellatus)同属鲈形目(Perciformes)石首鱼科(Sciaenidae)的鱼类。大黄鱼主要分布于我国黄海南部、东海和南海北部，是我国著名的四大海洋捕捞对象之一，也曾是浙江省重要的经济鱼类之一。但是由于过度捕捞，大黄鱼的自然资源遭到毁灭性破坏，种质资源退化现象严重^[1]。鱼主要产于我国沿海，朝鲜、韩国及日本均有分布，也是我国名贵经济鱼类。由于人为滥捕，鱼的自然资源曾经遭到严重破坏，形不成渔汛^[2]。10鱼具有较高的食用和药用价值^[3]，由于渔区社会保护渔业资源的意识和渔民休渔的自觉性普遍得到提高，自然资源得到一定程度恢复；2007年鱼在深水流网渔获物中所占比重达20%以上，已成为优势种类^①。美国红鱼原产于墨西哥海湾图克斯潘至美国马萨诸塞州沿岸，主要分布在从新泽西到佛罗里达的大西洋和墨西哥湾沿岸，在美国一直是养殖业和游钓业的重要种类^[4]。1991年美国红鱼由国家海洋局第一海洋研究所从美国引入稚鱼至今，美国红鱼养殖在国内已逐渐发展成规模产业。但由于养殖过程中某些环节的疏忽以及气候环境等因素的影响，美国红鱼逃逸现象时常发生，据不完全统计，近2年浙江海区由养殖网箱逃逸的红鱼数量达几十万尾之多，大陈、象山、嵊泗、洞头、佛渡等主要养殖海区均发生过美国红鱼逃逸事件。在养殖海域捕获4~6龄美国红鱼已是常见现象，造成生态环境隐患。

① 浙江省渔业资源动态检测站2007年渔业资源动态监测简报

由于3种鱼均属肉食性鱼类，在自然条件下有相近的食性，严重的食物竞争有可能导致资源的群落结构变化和优势种的交替。美国红鱼生长快、抗病力强、对水域环境条件要求不高，美国红鱼的逃逸势必会对自然海域的大黄鱼和鱼的资源造成一定的影响。此文对三者的线粒体DNA Cyt b基因序列进行了比较分析，旨在为大黄鱼和鱼的种质研究和资源保护提供科学数据，为美国红鱼的合理养殖与利用提供遗传学参考数据。

1.   材料与方法

1.1   材料来源

此研究中的大黄鱼于2007年5月30日取自象山宁波海湾苗种繁育中心当年繁育的苗种，体长为4 cm左右，活体运回实验室，取背部肌肉后在超低温冰箱(－70℃)保存，取20尾用于实验分析。鱼和美国红鱼均为海捕获得。鱼为2007年9月15日和25日在浙江南韭山调查时捕获，体重均在1 000 g左右，当场取背部肌肉，液氮中保存后带回实验室，取10尾用于实验分析。美国红鱼为2004年6月至2006年10月调查时在自然海域捕获，选体长在45 cm以上的鱼取背部肌肉于超低温冰箱中保存，取4尾用于实验。

1.2   实验方法

大黄鱼、鱼和美国红鱼基因组DNA的提取方法是参照《分子克隆实验指南》^[5]中DNA的提取方法。PCR所用的引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。PCR反应体系为25 μL体系：2.5 μL PCR缓冲液，DNA模版50 ng，dNTP 0.2 μmol · L^-1，引物1 μmol · L^-1，镁离子浓度2 μmol · L^-1，Taq聚合酶1 U，超纯水补至25 μL。反应在PCR扩增仪上经94℃预变性5 min后进行30个循环，每个循环包括94℃ 1 min，56℃ 1 min，72℃ 1 min，最后于72℃延伸7 min。PCR产物由上海生工进行双向测序，并对测序结果用DNAman、DNAsp和MEGA等软件分析。

2.   实验结果

此研究得到大黄鱼和美国红鱼的各1 140 bp片段的Cyt b序列，鱼的1 125 bp片段的Cyt b序列。所得序列的单倍型提交GenBank并获得序列号。分别选代表大黄鱼的单倍型EU346914(即将公布)，鱼的单倍型EU363521(即将公布)和美国红鱼的单倍型EF173450(即将更新)进行序列分析，获得的遗传特征如下。

2.1   碱基组成

大黄鱼、鱼和美国红鱼3种鱼序列的碱基组成见表 1。从表中可以看出，大黄鱼和美国红鱼的A+T含量高于C+G的含量。鱼的A+T含量为49.9%，略低于C+G的含量。从4种碱基在密码子的分布情况看，3种鱼密码子碱基的分布情况相似，密码子第一位4种碱基的分布比较均一，密码子第二位富含T，T的碱基含量均超过41.0%，密码子的第三位均出现C含量较高，T含量较低的碱基偏倚现象，尤其是鱼，C的碱基含量高达53.6%，G的碱基含量最低，为5.1%。周发林等^[6]在比较鲈形目6种笛鲷属鱼类也报道了该种情况，3种鱼Cyt b基因的碱基组成符合鱼类同源序列的特点。

表  1  大黄鱼、鱼和美国红鱼Cyt b基因的碱基组成

Table  1.  Base compositions of Cyt b genes in P.crocea, M.miiuy and S.ocellatus  %

	A	C	G	T	A+T	A1/A2/A3	C1/C2/C3	G1/G2/G3	T1/T2/T3
大黄鱼 P.crocea	23.1	33.2	15.4	28.4	51.5	23.7/20.5/25.1	27.6/24.7/47.0	25.8/13.7/6.6	22.9/41.1/21.4
鱼 M.miiuy	23.3	35.8	14.6	26.3	49.9	23.0/20.3/26.7	28.9//24.8/53.6	25.4/13.3//5.1	22.7/41.6/14.7
美国红鱼 S.ocellatus	23.2	33.6	15.3	28.0	51.2	21.8/20.3/27.4	27.6//25.0/48.0	26.3/13.7/5.8	24.2/41.1//18.7
注：表中数字1、2、3分别代表密码子的第1、2、3位 Note：No. 1, 2 and 3 denote the 1st, 2nd and 3rdcodon position, respectively.

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2.2   序列变异

将3种鱼的序列进行比对，3种序列的相似性为91.49%。由于鱼所得的序列为1 125 bp，除去大黄鱼和美国红鱼序列3′末端多出一段碱基，3种序列的相似性为91.90%。将3种鱼的序列进行比对，3种序列共有259个变异位点，其中有15个变异位点是由于鱼序列3′末端缺少15个碱基造成。选取3种鱼相对应的1 125 bp片段进行分析，得出3种鱼的序列间有244个多态位点，没有简约信息位点。3种序列间完全变异的位点有15个，分别为第33、75、159、210、225、387、408、444、591、732、774、786、846、921和1 093个位点。244个变异的位点中，碱基变异存在很大差异，有148个为C/T转换，有50个为A/G转换，C/T转换明显高于A/G转换，总转换数为198；有24个A/C，10个A/T颠换、8个G/C，4个G/T颠换，A/C和A/T的颠换明显高于G/C和G/T的颠换，总颠换数为46，转换/颠换率约为4.3，转换明显多于颠换。另外，在替换的碱基中，发生在第三密码子位置上占84.4%，只有6个替换发生在第二密码子位置上，密码子第三位点的变异率明显高于第一和第二位，表现出在密码子的第二位非常保守，第三位变异较大，符合密码子具有摇摆性这一特点。3种序列的碱基变异情况见图 1。

图  1  大黄鱼、鱼和美国红鱼Cyt b基因的变异位点

Figure  1.  Mutation sites of Cyt b genes in P.crocea, M.miiuy and S.ocellata

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通过对大黄鱼、鱼和美国红鱼的序列对比分析，虽然3种鱼具有较高的相似性，但是所测得的序列差异明显，碱基替换较多，可以将Cyt b基因作为种间分子鉴定或更高分类界元遗传分析的分子标记。

2.3   遗传距离和系统树

利用MEGA软件中基于Kimura-双参数法计算了3种序列的遗传距离(表 2)，并用“NJ”法构建系统树(图 2)。从表 2中可以看出鱼与美国红鱼的遗传距离最近，反映在系统树上表现为鱼和美国红鱼最先聚为一支。

表  2  3种序列的距离

Table  2.  Distances for three Cyt b sequences

	大黄鱼 P.crocea	鱼 M.miiuy	美国红鱼 S.ocellatus
大黄鱼
鱼	0.1786
美国红鱼	0.1755	0.1559

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图  2  基于Cyt b基因序列构建的NJ分子系统树

Figure  2.  NJ molecular phylogenetic trees based on Cyt b sequences

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3.   讨论

以大黄鱼、鱼为代表的石首鱼科鱼类，曾在我国水产业中占据着重要的地位。但是，大黄鱼资源严重衰退，种质严重退化，对其进行遗传结构和多样性分析、分子遗传图谱的构建、物种演化和亲缘关系研究以促进合理的资源保护，进而提出对大黄鱼的种质资源、基因库进行有目的、有策略保护的有效措施已变得势在必行。多年来对大黄鱼种质的研究报道较多，在大黄鱼的形态学方面^[7-8]、在细胞学方面^[9-10]、在生物化学方面^[11-12]以及分子生物学方面^[13-15]都有大量的研究报道，近年来由于大黄鱼的增殖放流工作的开展，使自然水域中的大黄鱼资源正处于恢复的趋势，但是，放流的大黄鱼对天然的大黄鱼的基因库是否产生破坏、以及破坏程度都有待于通过分子标记技术来研究，从而为政府管理部门决策提供科学依据。在大黄鱼资源衰退期间，鱼成为石首鱼科的主要捕捞对象之一，也曾面临着资源衰退的危险。对鱼的报道相对于大黄鱼较少，仅在养殖技术、育苗要点、摄食等方面有相关报道^{[2, 16]}。美国红鱼作为石首鱼科的引进物种，自1991年引进仔鱼，1995年繁殖成功起，我国已在辽宁、山东、浙江、福建、广东、海南等十几个省进行了大规模的美国红鱼繁育及养殖工作，并取得了一定的经济效益，仅浙江省2003~2005年美国红鱼的养殖产量连续达到1.1万t以上，美国红鱼已成为浙江省主要的鱼类养殖品种，产量位居第一位。但是在养殖过程中，由于管理不善和台风等非人为因素的影响，美国红鱼逃逸的现象时常发生，由于美国红鱼与大黄鱼、鱼同为肉食性鱼类，加之其生长快，对环境水域条件要求低等特点，美国红鱼的逃逸势必会对自然海域的生态系统造成不可忽视的影响。其一旦在自然水域形成规模，将破坏我国水域中现有的生物链，威胁我国的本土鱼类，破坏现有的鱼类区系，降低生物多样性，对我国的渔业资源和生产造成重大的损失。自美国红鱼引进后，有关美国红鱼的报道也涉及多个方面，1998年尤峰等^[17]对美国红鱼的核型进行了报道；1999年邓岳松^[18]对美国红鱼的繁育及养殖技术进行了报道；2002年刘世禄等^[19]对美国红鱼养殖群体的生化遗传情况进行了初步的分析；2006年陈刚等^[20]对美国红鱼的血细胞进行了报道等等。到目前为止，有关美国红鱼基因序列等方面的研究在国内也还没有见到。另外，大黄鱼、鱼和美国红鱼同属石首鱼科鱼类，2008年王晓清等^[21]报道了大黄鱼与鱼进行人工杂交的遗传分析，子代只有0.65%的鱼苗成活率，而且杂交子代与母本大黄鱼之间具有极高的遗传同质性。虽然美国红鱼与大黄鱼和鱼存在地理隔离，但是引进的美国红鱼能否与大黄鱼、鱼杂交，造成基因库的污染，还有待于利用有效的遗传学手段开展遗传学背景研究。

鱼类mtDNA是一种共价闭合环状的双链DNA分子，结构比较简单，仅编码少量蛋白质，呈母系遗传，且进化速度快，其碱基置换率为核DNA的5~10倍，从而增大了种群间及近缘物种间的遗传差异，使之易于被检测，因此，mtDNA为研究种群遗传结构和差异提供了一种灵敏的检测方法。另外，mtDNA不同的区域进化速度存在差异，用mtDNA检测地理隔离在鱼类群体间产生的遗传差异，是近年来鱼类分子遗传学研究的热点之一。线粒体细胞色素b(Cyt b)基因是目前线粒体中结构和功能了解得最为透彻的基因之一，进化速度适中，是线粒体DNA上的蛋白质编码基因，适合种群水平差异的检测，而且容易为保守序列扩增，研究最为广泛^[22]，是探讨种间和种内遗传分化程度的良好标记，其中的一个基因片段就包含了从种内到种间乃至科间的进化遗传信息^[23-24]，在系统进化和分类研究上有较强的适用性。

到目前为止，在GenBank中仅有大黄鱼和美国红鱼Cyt b基因短序列的报道，鱼也仅有381 bp Cyt b基因的报道。此研究进行的大黄鱼和美国红鱼线粒体DNA Cyt b 1 140 bp片段序列分析，鱼1 125 bp片段序列的分析，不仅为确立其在石首鱼类中的进化关系提供了遗传学基础数据，同时为保护大黄鱼和鱼的种质及对其资源的合理开发提供了科学依据；为美国红鱼引进后的论证和评估及其合理的利用和开发提供了参考依据。