繁殖生物学是种群生物学研究的主要内容之一，可以为资源评估提供重要的基础资料。大眼金枪鱼(Thunnus obesus)是世界金枪鱼渔业的重要捕捞对象之一，分布于三大洋的热带和温带海域，但其资源正面临过度捕捞的危险^[1]。国内外学者对各不同洋区大眼金枪鱼的繁殖生物学开展了不少研究，内容涉及成熟个体长度^[2-4]、产卵时空分布^[5-6]、繁殖力^{[4, 7-8]}、繁殖频率^{[4, 9-10]}、繁殖高峰期^[11-12]、繁殖活动的季节变化^[13-14]等。

根据种群遗传研究，目前认为南太平洋大眼金枪鱼属于单一种群^[15]。以往的研究表明，太平洋大眼金枪鱼雌雄比例小于1，且叉长越长，雄性所占比例越高^{[4, 10-11]}。雌性个体的初次性成熟长度大于100 cm^{[2, 8]}，而50%成熟叉长约为120~130 cm^{[8, 11]}。繁殖活动具有季节性^[16]，繁殖活动积极的月份因具体海域不同而有差异^{[11, 16]}。一般情况下，在表层水温高于24 ℃的海域可全年产卵，在水温高于28 ℃的水域产卵个体比率更高^[5]。产卵活动多于夜间进行，高峰时段在19: 00至午夜^[17]。大眼金枪鱼怀卵数低于黄鳍金枪鱼(T.albacares)^[7]和南方蓝鳍金枪鱼(T.maccoyii)^[18]。中东太平洋雌性大眼金枪鱼的相对繁殖力估算值为每克体质量24粒^[5]。

虽然近年国内外对南太平洋中西部和东部海域大眼金枪鱼的繁殖生物学开展过研究^{[3, 8, 11]}，但针对中西部的研究是采用肉眼观测法来判断成熟度^[3]，而采用切片方法的研究针对的是东太平洋群体^{[8, 11]}。以往的研究具体采样水域、年份、季节等差别较大，且数据较陈旧，而性别比例、成熟长度、繁殖力等结果亦表现出地域性。大眼金枪鱼的繁殖活动因区域而异这一特点，使得不同水域的分别研究与不同年份的跟进研究变得十分必要。另外，石蜡切片技术是组织学、发育生物学研究的主要实验方法^[19]，结果较为准确，但进行大量组织切片实验的耗时很长，加上海上取样困难，不少研究直接通过肉眼观测性腺外貌特征来判断成熟等级^[11-13]。其优点是速度快，适合大量样品的观测，但对该判断方法准确性的验证及误差大小的估算却未见有报道。

因此，文章对南太平洋中西部海域的雌性大眼金枪鱼性腺样本采用石蜡切片实验，主要针对成熟等级鉴定、成熟等级个体差异、繁殖力估算、不同钓获深度的成熟等级差异等方面展开研究，以进一步提高对南太平洋大眼金枪鱼性腺成熟等级特征的认识。

1.   材料与方法

1.1   样品来源

大眼金枪鱼性腺(卵巢)样品来自金枪鱼科学观察员海上取样，取样时间为2010年~2013年，每年的9月至次年1月。位置范围为：0°40′S~11°12′S，168°1′W~133°19′W，位于南太平洋中西部。共176个延绳钓钩次，具体位置及月份分布见图 1。观察员记录钓获的大眼金枪鱼长度(叉长，cm)、性别、性腺湿质量等信息后，切取约2~3 cm长的卵巢组织浸入10%甲醛溶液，常温或冷藏固定保存，航次结束后带回实验室。通过肉眼观察性腺外貌，判断成熟等级，判断依据见2.1。共采集雌性大眼金枪鱼性腺样品263个。

图  1  各月采样站点分布

Figure  1.  Monthly distribution of sampling stations

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1.2   组织切片实验

采用常规石蜡切片步骤^[19-21]进行实验。从样品上剪取2 mm×2 mm×2 mm的组织块，浸入10%甲醛溶液固定12 h。固定是为了使组织在切片制作过程中保持细胞的形态结构，使之与成活时的原有形态和结构相似而不发生变形^[20]。70%、80%、85%梯度乙醇溶液脱水各1 h，浸入90%乙醇溶液Ⅰ脱水0.5 h，再浸入90%乙醇溶液Ⅱ 12 h脱水、脱脂，接着分别用100%乙醇Ⅰ、100%乙醇Ⅱ 0.5 h进一步脱水。梯度乙醇脱水，严格控制时间，使组织块脱水完全而不过度，防止组织块硬化。相同浓度乙醇溶液分Ⅰ和Ⅱ两步脱水是为保证高浓度乙醇纯度，保障脱水效果^[19]。分别入1 : 1乙醇与二甲苯混合液、二甲苯，1 : 1二甲苯与石蜡混合液0.5 h透明。透明是为了方便石蜡熔液渗入组织块中，并使组织更加通透^{[19, 21]}。分别入石蜡熔液Ⅰ、石蜡熔液Ⅱ 1 h浸蜡。将浸透蜡的组织块放入药品盒，盒中倒满融化的石蜡，冷藏0.5 h。蜡块取出后经切片机切片。将蜡带置入水池展片，贴于载玻片上后入恒温箱烤片12 h。样本切片经苏木素-伊红染液复染后，用中性树胶封片保存。

在显微镜下观察切片中卵细胞，参照SCHAEFER等^[5]和王修国^[8]的特征描述将样品的成熟等级分为1~5等级，认为3期为成熟，数出成熟卵细胞个数。各等级对应的显微镜下特征见2.1。

1.3   数据分析方法

性腺指数是一种用卵巢或睾丸发育来衡量动物性成熟情形的指标。参照MIYABE^[22]的方法(式1)计算各尾渔获物的性腺指数(gonadosomatic index，GSI)。

式中GSI为性腺指数，GW为鱼体性腺湿质量(g)；FL为渔获叉长(cm)。

运用SPSS 21做性腺指数与叉长的散点分布图，分析其关系。以10 cm为一个叉长组统计各组成熟等级分布情况，分析成熟等级随叉长的变化趋势；统计各叉长组成熟个体的比率，并用Origin 9软件按Logistic方程进行拟合(式2)，估算得出50%成熟叉长。

式中y为成熟比例，x为渔获物叉长，A₁、A₂、x₀和p均为参数。

参照SCHAEFER等^[5]的繁殖力估算方法，选择显微镜下鉴定成熟的切片，称量切片质量，精确到0.1 mg。显微镜下数出切片中成熟卵细胞数目为n(粒)，用分析天平称量切片质量为w(g)，鱼体加工后质量为GT(g)，鱼体性腺湿质量为W(g)，相对繁殖力f由式(3)求出：

运用悬链线公式^[23]计算出各尾渔获的理论钓获深度，按成熟等级分成5组。对各组的钓获深度做单样本K-S检验，分析是否符合正态分布。若深度均为正态分布，则对不同成熟等级之间做独立样本t检验，分析两者间方差是否相等和差异性是否显著，分析不同成熟等级钓获深度的变化。按不同成熟等级分组，统计各组每尾渔获钓获深度，运用SPSS 21作组间聚类分析，分析各组间欧式距离大小，探索因钓获深度不同成熟等级的分类情况。

2.   结果

2.1   卵巢成熟特征

综合马世磊等^[24]对卵巢外貌的描述和王修国^[8]对显微镜下切片的描述，将大眼金枪鱼卵巢的成熟过程分为1~5阶段：未成熟期、成熟前期、成熟后期、排卵期和排卵后期。各阶段显微镜下特征展示见图 2，各阶段卵巢外观和显微镜下特征描述为：

图  2  显微镜下大眼金枪鱼卵巢发育不同阶段

a~e分别对应1~5期

Figure  2.  Microstructures of bigeye tuna ovary at different maturity stages

a~e represent Stage 1~5.

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未成熟期(1期)。性腺已可以区分雌雄，卵巢延长、纤细；解剖后目测不到卵细胞颗粒。显微镜下观察，细胞小而密集，形状为多边形，不规则；卵细胞嗜碱性，整体被苏木素染成深紫色；细胞中央具浅色区域，为细胞核，相对体积较大(图 2-a)。

成熟前期(2期)。卵巢生长变大变粗，血管变得明显；解剖后偶见卵细胞颗粒，多数仍不显。显微镜下，细胞增大，出现卵黄颗粒，围成环状散于细胞质间；出现脂肪泡，亦散布于细胞质间(图 2-b)。

成熟后期(3期)。卵巢肥壮，呈鲜黄色，外布较粗血管；解剖后可见卵细胞颗粒，但尚不显游离的卵。显微镜下，脂肪泡扩展，发育成一层或多层；卵黄颗粒成熟，被染成紫红色，充满细胞质；脂肪泡汇聚于中央，形成大的脂肪球(图 2-c)。

排卵期(4期)。卵巢发育到最大，卵巢皱褶剧烈增大增厚，呈乳黄色或橘黄色；解剖后发现卵巢内充满液化的卵，卵粒饱满，向外自由流出。显微镜下，卵细胞亦发育至最大，细胞核极化，不显；细胞中央出现脂肪球转变成的大油滴，染色后呈大空泡；卵黄颗粒融合成板状；细胞水化(图 2-d)。

排卵后期(5期)。卵巢皱缩变小，呈暗红色，处于排卵即将结束或已结束时期；解剖后仍可发现少量残留的卵。显微镜下，卵细胞因吸收作用而被破坏，细胞消融，细胞膜收缩，细胞整体形状不规则，出现空腔；卵细胞嗜酸性，整体被伊红染成深红色(图 2-e)。

2.2   性腺发育与叉长的关系

对样本的观察员数据进行整理，叉长为70~196 cm，叉长分布见图 3。单样本K-S检验叉长显示，显著性检验值为0，非常显著，即叉长服从正态分布。

图  3  样品长度分布

Figure  3.  Distribution of length of samples

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叉长与性腺指数的散点分布见图 4。数据显示，雌性大眼金枪鱼样本的性腺指数为0.26~8.58，平均为3.56；回归分析显示，P < 0.05，说明性腺指数随叉长增长而增大，但并无明确的函数关系。

图  4  叉长和性腺指数的关系

Figure  4.  Relationship between fork length and GSI

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各叉长组的钓获尾数和平均成熟等级统计见表 1。忽略部分叉长组因样本数目较少带来的误差影响，大体上，平均成熟等级随叉长增长而增大。各叉长组的成熟等级分布情况如图 5所示，叉长较小时，以1、2期为主；随叉长增大，3、4期出现且比例逐渐增大；叉长大于等于130 cm的组中以4、5期为主；叉长大于等于170 cm的组中更是几乎全为4期和5期样本。

表  1  各叉长组平均成熟等级、成熟尾数及成熟比例

Table  1.  Average maturity stage, mature tail and mature proportion for each size bin

叉长组 size bin	平均成熟等级 average maturity stage	成熟个体/尾 number of matured tuna	成熟比例/% mature proportion
70~79	1	0	0
80~89	1	0	0
90~99	2.5	6	25.00
100~109	2.7	11	20.00
110~119	3.4	25	46.67
120~129	3.7	24	61.29
130~139	3.8	15	88.89
140~149	4.1	13	80.00
150~159	4.1	10	91.67
160~169	4.1	10	82.35
170~179	4.4	3	100
180~189	3.6	3	60.00
190~199	4.5	1	100

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图  5  各叉长组成熟等级分布

Figure  5.  Distribution of maturity stages of size bins

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统计各叉长组渔获尾数，通过切片实验鉴定各尾渔获物是否成熟，从而计算出各叉长组的成熟比例如表 1所示，由此拟合出雌性大眼金枪鱼的成熟曲线(图 6)。其中A₁=0.03，A₂=0.88，x₀=114.22，p=11.98，曲线的拟合优度为87.2%，50%成熟叉长为116.32 cm。如果剔除180~190 cm叉长组这一因数据量少而明显偏离的点，则A₁ =-0.02，A₂=0.98，x₀=115.75，p=8.71，曲线的拟合优度提高至95.2%，50%成熟叉长为116.80 cm。

图  6  雌性大眼金枪鱼成熟曲线

Figure  6.  Maturity curve of female bigeye tuna

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2.3   繁殖力估算

选择10尾样本估算怀卵数与相对繁殖力(表 2)。大体上怀卵数随个体增大而增多，而相对繁殖力亦有此趋势，但波动性更大，规律性较弱。平均怀卵数为109×10⁴粒，平均相对繁殖力为20.5粒· g^-1。

表  2  雌性大眼金枪鱼繁殖力与相对繁殖力

Table  2.  Batch and relative fecundity of female bigeye tuna

叉长/cm fork length	切片质量 /g·10-3 slice weight	成熟卵细胞数/粒 mature oocyte number	性腺湿质量/g gonad weight	加工后质量/kg processing weight	怀卵数/104粒 batch fecundity	相对繁殖力 /粒·g-1 relative fecundity
122	95.1	51	880	29	47.2	16.3
124	82.8	50	965	31	58.3	18.8
129	80.2	58	975	34	70.5	20.7
133	84.1	62	980	41	72.2	17.6
138	85.5	77	730	42	65.7	15.7
144	82.2	71	1 735	55	149.9	27.2
147	88.9	88	510	47	50.5	10.7
153	90.1	86	1 875	76	179.0	23.5
158	84.7	94	1 825	77	202.5	26.3
163	80.6	80	2 005	70	199.0	28.4

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2.4   成熟等级与钓获深度的关系

运用悬链线公式，计算出记录钓获钩位的106尾大眼金枪鱼的理论钓获深度，并按不同成熟等级统计见表 3。1~4期的样本理论深度均值差距较相近，而5期的均值明显小于前者。单样本K-S检验结果显示，各组钓获深度均符合正态分布。对不同成熟等级间的理论钓获深度做独立样本t检验，结果表明：各组间方差均相等；t检验的P值均大于0.05(表 4)。说明两两之间差异性均不显著。但是5期与其他等级理论深度的检验结果均明显小于1~4期间的检验结果。

表  3  不同成熟等级雌性大眼金枪鱼平均钓获深度(95%置信区间)

Table  3.  Average catch depth of female bigeye tunas at maturity stages (CI=95%)

成熟等级/maturity stage	样本数sample number	平均深度/m average depth	标准误standard error
1	5	276.55±39.72	14.31
2	9	279.35±46.90	20.34
3	25	277.34±21.47	10.40
4	44	277.87±16.15	8.01
5	23	265.14±29.00	13.99

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表  4  不同成熟等级间钓获深度t检验的P值

Table  4.  P value of t-test of catch depth among maturity stages

成熟等级/m maturity stage	2	3	4	5
1	0.93	0.97	0.96	0.72
2		0.93	0.94	0.59
3			0.97	0.48
4				0.40

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欧式距离代表两者间的差异程度，值越大代表其间差异性越大。聚类分析结果显示，2期和3期间的欧式距离为1，距离最近，归为类A；1期和4期间距离为5，距离次近，归为类B；5期独为类C。进一步聚类结果为，类A与类B距离为16，先归为一类，而后再与类C归为一类，距离为25(图 7)。

图  7  成熟等级聚类分析

Figure  7.  Cluster analysis of maturity stage

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3.   讨论

3.1   金枪鱼性腺切片特异性

石蜡切片的操作步骤因不同组织的差异性而略有不同，主要体现在具体步骤时间长短与温度高低的调整，其对切片的效果有重大影响^[19]。笔者通过自身大眼金枪鱼和黄鳍金枪鱼的实践经验，将金枪鱼性腺切片的特异性进行简述。切片的第一步通常为固定^[19-20]，而性腺样本由观察员带回时已采用10%甲醛溶液固定，二次固定耗时长且不必要，如确需二次固定，建议使用Bouin氏液为组织着上黄色^[25]，便于后期切片时观察。脱水时一般建议高浓度乙醇中浸泡时间为0.5 h，防止脱水过度组织硬化^[19-20]，但金枪鱼实验中发现在95%的乙醇溶液中浸泡约12 h方可达到良好的脱水效果。浸蜡时的温度选择在不同文献中不统一且跨度较大^[19-20]，实验中发现采用高于石蜡熔点1~2 ℃的温度浸蜡更适合金枪鱼性腺组织。贴片时常选用蛋白甘油作为粘片剂^{[19, 21]}，而实验表明不使用任何粘片剂亦可达到良好的黏附效果，且不会在染色时染红载玻片而影响观察^[19]。

3.2   繁殖生物学结果比较

性腺指数有多种计算方法^{[10, 22, 26]}，不同方法的性腺指数值大小相差较大，不具有可比性。由于渔船上颠簸，体质量的测量常不准确，所以该研究采用一种由生长方程转化来的利用叉长立方计算的方法^[22]。朱国平等^[13]采用与该研究相同的方法分析印度洋中西部大眼金枪鱼的性腺指数，雌性为1.1~3.5，因为海域与时间均与该研究不同，所以结论相差较大。管卫兵等^[11]分析东太平洋相同季节大眼金枪鱼的情况，指数为0.07~8.99，均值为2.17，与该研究结果相近。对大眼金枪鱼和黄鳍金枪鱼的研究发现，性腺指数有随叉长增长而增大的现象^{[8, 11]}，与该研究结论一致，但由于两者间并没有明确的函数关系，目前原因尚不知晓。性腺指数随叉长增长而增大，可以理解为性腺生长速率快于体质量增长速率，应该为鱼体成熟时性腺快速生长，而体质量增长高峰期已过造成的影响。

大眼金枪鱼50%成熟长度在不同海域明显不同，大西洋中部为110 cm^[10]，澳大利亚珊瑚海为102.4 cm^[27]，东太平洋为135 cm^[9]。而SUN等^[4]对1997年~1999年中西部太平洋的数据分析显示，雌性的50%成熟长度仅为102.85 cm。由于其对卵巢发育阶段的分类和鉴定成熟的标准与该研究均有较大不同，且采样年份与水域亦相差较远，所以结论差距较大。由于此海域近年相关研究的缺乏，且南太平洋大眼金枪鱼为一个种群^[15]，该研究与东太平洋2010年之前的研究^{[5, 8]}做比较，50%成熟长度较接近但仍小于135 cm左右的结果。排除采样上的偏差与水域不同的影响，初次性成熟长度的减小与太平洋大眼金枪鱼的过度捕捞^[1]导致2010年后资源进一步衰退有重要关联，这种现象在其他出现衰退迹象的渔业中常有发现^[28-30]。

大眼金枪鱼怀卵数估算的研究较少，SUN等^[4]的评估结果为(0.84~8.56)×10⁶粒，远大于该研究的估计数目，即使成熟卵细胞鉴定方式不同会带来影响，仍可体现近年来大眼金枪鱼资源的衰退趋势。而在相对繁殖力方面，中西太平洋NIKAIDO等^[17]的估算结果为31粒· g^-1，东太平洋SCHAEFER等^[5]的为24粒· g^-1。该研究结果与NIKAIDO等的相差较大，是多年来资源衰退和之前成熟卵细胞鉴定方式与现在不同带来的影响。该研究的结果与SCHAEFER等近年的研究相近，相对繁殖力略低于他的结果，应该为使用加工后质量，小于渔获体质量造成的误差。且加工后质量一般只精确到千克，也有一定影响。另外，因为整个性腺不易携带，观察员只取一段带回，所以数据中只有整个性腺的新鲜质量和取回样品的固定后质量，无法计算固定对质量变化的影响，亦会为怀卵数估算带来一定误差。目前的结果表明，总体上大眼金枪鱼的相对繁殖力显著低于黄鳍金枪鱼(相对繁殖力为67粒· g^-1)^[7]和南方蓝鳍金枪鱼(相对繁殖力为57粒· g^-1)^[18]。

大眼金枪鱼因叉长不同，栖息深度有显著不同^[31-32]，这种现象在黄鳍金枪鱼^[33-34]和长鳍金枪鱼(T.alalunga)^[35-36]中均有发现。该研究显示，不同叉长组中，成熟等级的组成明显不同，叉长小的渔获成熟等级低，叉长大的成熟等级高。因此，该研究同时对成熟等级与钓获深度之间的关系作了探索，聚类分析结果显示，2期与3期为一类，1期与4期为一类，5期独为一类。1期与4期的结果与预期不同，它们虽归为一类，但欧氏距离明显比2期与3期间的大，应该是受1期样本数较少带来的误差影响。而5期与其他4期的钓获深度均有不小差距，因为5期为各期中变化最显著的阶段，性腺从发育最成熟的4期快速退至尚未成熟的2期，因此5期总体特征与其他成熟等级相比均不同。若不论样本量少而误差较大的1期，成熟等级2期与3期差距最小，与4期、5期的距离逐渐增大。说明大眼金枪鱼的钓获深度随性腺发育、成熟等级增大而逐渐变化，但此结果还无法直接证明两者的关联。t检验结果显示各成熟等级间钓获深度无显著性差异，原因可能是样本数目过少，无法排除偶然误差的影响。