Influence of water cooking condition on morphology and protein loss of body wall from sea cucumber (Stichopus monotuberculatus)
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摘要:
研究了花刺参(Stichopus monotuberculatus)体壁在不同水煮温度(50 ℃、60 ℃、70 ℃、80 ℃和90 ℃)和时间(10 min、20 min和30 min)条件下的失重率、蛋白溶失率、横截面形态结构、新鲜体壁含水量和最大转变温度的变化。结果显示，新鲜花刺参体壁含水量约为93.67%；随着温度和时间的递增，体壁水煮于50~60 ℃开始收缩失重，失重率逐渐升高；从70~80 ℃开始蛋白溶失率逐渐升高；新鲜体壁最大转变温度为73.5 ℃，与海参体壁收缩和蛋白溶失发生温度相一致。采用扫描电子显微镜观察体壁横截面形态结构发现，体壁胶原纤维网络密度从70 ℃开始显著升高，并出现空洞。因此，花刺参的水煮条件应为70 ℃加热20~30 min，或80 ℃加热不超过10 min。
Abstract:We investigated the weight loss, rate of protein loss and cross-sectional morphology of Stichopus monotuberculatus at different temperatures (50 ℃, 60 ℃, 70 ℃, 80 ℃ and 90 ℃) for 10 min, 20 min and 30 min, respectively. Results show that the water content of fresh body wall was about 93.67 %; with the increase of temperature and time, the weight loss beginning at 50~60 ℃ increased gradually; the loss of protein increased steadily, starting from 70~80 ℃. Then the maximum transition temperature of fresh body wall was observed at 73.5 ℃, consistent with the beginning temperatures of weight and protein loss. At last, the cross-sectional morphology of body wall was observed by scanning electron microscope, where the density of collagen fibers network in body wall had increased significantly since 70 ℃ with hollow generating simultaneously. Thus, the cooking condition should be 70 ℃ for 20~30 min, or 80 ℃ within 10 min.
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Keywords:
- Stichopus monotuberculatus /
- cooking /
- body wall /
- morphology /
- weight loss /
- protein loss
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海参属棘皮动物门，海参纲，现发现全球约有海参1 400多种，其中经济海参50多种，具有较高的食用和药用价值[1]。海参具有抗血管增生、抗凝血、抗高血压、消炎、抗菌、抗氧化、抗血栓形成、抗肿瘤活性和促进伤口愈合的功能[2]。
体壁是海参的主要食用部位，除了营养价值，其口感也是海参食品价值中不可缺的重要因素。肉品口感与其组成成分、组织结构以及加热过程中纤维(肌纤维和胶原纤维)形态变化相关[3-4]。海参体壁组成成分中粗蛋白含量可达到干质量的83%，其主要为不溶性胶原纤维，肌纤维含量极少[5-8]。可见，海参体壁组织结构和口感与其胶原纤维的形态密切相关。海参体壁胶原纤维在加热中，逐渐发生聚集、收缩、变性、逐步凝胶化，最终形成可溶性的明胶，致使体壁相应地发生收缩、结构蛋白溶失，以至组织结构空泡化。体壁胶原纤维形态和组织结构的变化造成体壁口感的相应变化[7-10]。因此，研究海参体壁组织结构变化与加热温度和时间的关系有助于加工优质口感的海参体壁，从而指导海参食品的加工。
中国是海参养殖大国，其品种主要为北方温带种仿刺参(Apostichopus japonicus)，有关海参水煮加热过程中体壁形态结构变化的研究仅见于仿刺参[6-8]。尽管热带种海参在人工育苗、养殖和放流的研究与应用方面具有一定基础，但其食品加工的研究还鲜见报道[11-13]。然而，热带海参与仿刺参体壁结构和热稳定性的不同决定加工方式的差异。热带海参花刺参(Stichopus monotuberculatus)隶属于海参纲，刺参科，刺参属，零星分布于中国热带海域，其肉质厚嫩，是重要的经济海参品种之一[14]。对花刺参人工育苗中产卵、受精、胚胎发育、幼体发育和稚参生长的研究将推动其增养殖业的发展[15]。文章开展花刺参体壁水煮加热过程中形态结构和蛋白溶失变化研究，旨在优化花刺参体壁水煮加工条件，为获得较佳口感的花刺参产品提供科学依据。
1. 材料与方法
1.1 材料
花刺参活体成参由北海正渔生物技术有限公司提供，平均体质量(103.4±13.8)g，用盛有1/3海水塑料袋打包放入加冰泡沫箱运至实验室，于循环海水水族箱中暂养，水温26~28 ℃。BCA蛋白定量试剂盒购自生工生物工程股份有限公司。花刺参体壁酶促溶性胶原蛋白(pepsin solubilized collagens，PSC)由笔者实验室前期实验提取得到。
1.2 实验方法
1.2.1 取样、称质量和水煮
将鲜活海参体壁剪成约10 mm×10 mm×10 mm样品，精确称质量并记录为IW(initial weight)。将样品分别于不同温度和时间条件下的蒸馏水中水煮，温度设定分别为50 ℃、60 ℃、70 ℃、80 ℃和90 ℃，时间为10 min、20 min和30 min，蒸馏水体积为20~30 mL。水煮结束后，将样品精确称质量并记录为FW(final weight)。样品失重率(%)=(IW-FW)÷IW×100。另取新活海参体壁冻干，记录冻干前后质量IW和FW，干质量质量分数(%)=FW÷IW×100。
1.2.2 体壁蛋白溶失率测定
蒸馏水经样品水煮后，定容于50 mL容量瓶，摇匀，用于测定蛋白质量分数。溶液中蛋白质量分数分别以牛血清蛋白(BSA)和花刺参体壁PSC作标准品，采用BCA法测定[16]。体壁蛋白溶失率(%)=蛋白质量分数测定值×50÷样品质量÷干质量质量分数×100。
1.2.3 体壁热稳定性测定
新鲜海参冻干体壁最大转变温度(maximum transition temperature，Tm)参照MORENO等[17]并改进，通过Netzsch DSC 204F1示差扫描量热仪(differential scanning calorimeter，DSC)测定。取体壁冻干样品5 mg于铝盘、密封，测定样品Tm。DSC测试系统条件：平衡温度10 ℃，平衡时间5 min，升温范围10~80 ℃，升温速度1 ℃ · min-1。DSC测定15~80 ℃间的焓值变化，Excel 2010作温谱图，Tm由温谱图得出。
1.2.4 体壁组织微观形态结构观察
采用扫描电子显微镜(scanning electron microscope，SEM)观察海参体壁横截面组织结构[18]。将水煮过的体壁样品于冻干机冻干后，整齐割断，于离子溅射仪中离子溅射喷金将切割平面镀金。SEM于20 kV加速电压下100倍率观察镀金的切割平面。SEM图片采用Adobe Photoshop CS6处理，切割平面中胶原纤维的横切面面积计算采用软件Leica Qwin V3。由于SEM图片中纤维的横切面呈白色，而纤维间空隙颜色较暗，因此纤维横切面的RGB值大于127，故计算RGB值在128~255的面积比值即可反映纤维密度。
1.3 数据处理
实验数据均为3次平行测定，以“平均值±标准差”(X±SD)表示。运用单因素方差分析(ANOVA) 对数据进行统计分析，以及LSD test检验比较组间数据均值差异。采用SPSS 19.0软件进行数据统计分析。
2. 结果
2.1 不同温度和时间水煮对失重率与蛋白溶失率的影响
2.1.1 失重率
新鲜样品含水量为93.67%，即干质量的质量分数为6.33%；50 ℃下失重率不随时间而变化，而从60 ℃开始，失重率随着温度和时间递增而逐渐升高；当体壁在70 ℃加热超过20 min或80 ℃以上加热超过10 min，失重率即可达到恒定的最大值(83% ~88%)(表 1)。60 ℃加热时间对失重率的影响最大(极差最大)，表明致使花刺参体壁开始收缩失重的温度为50~60 ℃。
表 1 不同温度和时间下花刺参体壁失重率Table 1. Weight loss of body wall at different temperatures and time during cooking温度/℃
temperaturet/min 失重率/%
rate of weight loss50 10 10.25±1.15a 20 12.85±1.72a 30 15.35±2.22a 60 10 27.75±2.22b 20 47.89±2.13c 30 56.91±1.76cd 70 10 66.05±2.70de 20 79.51±2.73f 30 80.40±2.16f 80 10 83.31±2.66f 20 84.60±1.26f 30 87.19±2.60f 90 10 84.37±2.23f 20 86.38±1.36f 30 86.05±2.06f 新鲜体壁fresh body wall 含水量 93.67±0.86g 注：数值由“平均值±标准差”表示，数值右上角不同字母表示差异显著(P＜0.05)，下表同此
Note：Data are expressed as X±SD of three determinations，and values with different superscript letters are significantly different from one another (P＜0.05). The same case in the following tables.2.1.2 蛋白溶失率
2种标准品BSA和PSC测定蛋白溶失率在温度和时间下的变化规律一致(表 2)。随着温度和时间的递增，蛋白溶失率逐渐升高。50~70 ℃蛋白溶失率较低，且不随时间而变化，而80 ℃加热蛋白溶失率开始显著升高(P＜0.05)，时间对蛋白溶失率的影响最大(极差最大)，表明致使花刺参体壁蛋白开始溶失的温度发生在70~80 ℃。
表 2 不同温度和时间下花刺参体壁蛋白溶失率Table 2. Protein loss of body wall at different temperatures and time during cooking温度/℃
temperaturet/min 蛋白溶失率/% 标准品BSA
rate of protein loss BSA as standard蛋白溶失率/% 标准品PSC
rate of protein loss PSC as standard50 10 0.09±0.03a 0.28±0.03a 20 0.12±0.03a 0.41±0.07a 30 0.14±0.02a 0.47±0.05a 60 10 0.18±0.04ab 1.74±0.12b 20 0.19±0.03ab 2.75±0.08c 30 0.20±0.02ab 2.82±0.08c 70 10 0.33±0.09b 5.65±0.10d 20 0.49±0.08bc 6.89±0.09d 30 0.52±0.07bc 7.15±0.11d 80 10 0.82±0.07d 7.78±0.11d 20 1.95±0.08e 13.10±0.06ef 30 2.51±0.08f 16.67±0.11f 90 10 1.77±0.09e 11.89±0.11e 20 2.56±0.10f 15.91±0.06f 30 2.72±0.08f 17.84±0.09f 2.2 热稳定性测定
花刺参新鲜体壁冻干后的DSC热谱曲线见图 1。随着温度的升高，其吸收热焓值增加，温度升高到73.5 ℃时热焓值达最大，热焓值随着温度的继续上升而降低。由图谱得到花刺参新鲜体壁冻干样品的Tm为73.5 ℃。
2.3 不同温度和时间水煮对组织微观形态结构的影响
新鲜和水煮的花刺参体壁横截面表层形态结构放大100倍见图 2。经不同温度和时间水煮处理的花刺参体壁组织形态差异明显。新鲜体壁纤维稀疏，既有结成稀疏的条块状，又有纤维丝状(图 2-*)。随着温度和时间的递增，体壁纤维逐渐收缩，纤维间空隙逐渐缩小，纤维网络变得密集(图 2-a~e)。采用Leica Qwin V3计算体壁横截面中胶原纤维被切割的部分(collagen fibers′ cross-sectional area，CFCA)占切割总面积(whole cross-sectional area，WCA)的比值可直观反映体壁纤维网络收缩的密集程度(表 3)。花刺参体壁经水煮后，体壁均收缩，纤维网络变得密集。60 ℃开始CFCA/WCA比值随时间而变化，其中70~90 ℃水煮的CFCA/WCA比值较50 ~60 ℃的差异显著(P＜0.05)，而80 ~90 ℃水煮时间对CFCA/WCA比值的影响最大(极差最大)，表明体壁收缩温度始于50 ~60 ℃，且80 ~90 ℃体壁显著收缩，同时逐渐出现大的空洞。
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图 2 不同温度和时间下花刺参体壁横截面形态*.新鲜体壁；a~e.水煮温度分别为50 ℃、60 ℃、70 ℃、80 ℃、90 ℃；行1. SEM原图，放大倍数=100倍，比例尺=250 μm；行2.行1原图中纤维被切割的部分用蓝色替代；列10 min.水煮时间10 min；列20 min. 水煮时间20 min；列30 min. 水煮时间30 minFigure 2. Cross-section morphology of body wall at different temperatures and time during cooking*. fresh body wall; a~e. cooking at 50 ℃, 60 ℃, 70 ℃, 80 ℃ and 90 ℃, respectively; Line 1. SEM photographs, magnification: 100, scale bar=250 μm; Line 2. cross-section of fibers in photographs of Line 1 is replaced by blue colors in Line 2;column 10 min. cooking for 10 min; column 20 min.cooking for 20 min; column 30 min. cooking for 30 min表 3 不同温度和时间下花刺参体壁纤维横截面与总横截面积比Table 3. Ratio of CFCA to WCA at different temperatures and time during cooking温度/℃
temperaturet/min CFCA/WCA比值/%
ratio of CFCA to WCA新鲜体壁fresh body wall 4.84±0.18a 50 10 12.59±1.34b 20 13.00±1.91b 30 13.05±1.79b 60 10 13.35±1.69b 20 14.96±2.26b 30 16.69±2.35bc 70 10 15.67±2.39bc 20 16.91±1.42bc 30 18.08±1.88c 80 10 17.68±1.32c 20 18.64±1.97c 30 21.76±1.63cd 90 10 19.89±2.42c 20 20.80±1.58cd 30 24.28±2.39d 3. 讨论
食物口感是人的口、牙、舌对食物流变学特征的综合主观感觉，流变学参数反映到食物口感表现为硬度、弹性、柔嫩性、凝聚性和黏着性[3, 19-20]。
由于海参体壁主要组成为胶原纤维，其口感与胶原纤维的形态密切相关[10]。鲜活海参体壁微观结构中，胶原纤维较细长、纤维间空隙较大、分布均匀。胶原纤维在加热熟化过程中随着能量的吸收、形态结构的变化，最终将影响体壁口感[7-9]。
3.1 体壁水煮失重和蛋白溶失
新鲜海参体壁水煮过程中随着热量的吸收，胶原纤维逐渐收缩至一定程度，其间空隙的水分因纤维的收缩而排出，体现为体壁整体收缩、体壁失重。伴随着体壁硬度增加，弹性减小且黏性增大[7-8]。研究结果显示花刺参体壁收缩失重的温度开始于50~60 ℃，表明体壁收缩需超过最低水煮温度；而温度越高，其达到最大失重率的时间越短，证明海参体壁收缩为吸能过程，能量吸收速率决定收缩所需时间。此外，花刺参失重后达到最低质量(12% ~17%)比冻干样品干质量质量分数(6.33%)略高，表明纤维间水分无法因体壁完全收缩而彻底排除。
随着水煮热量的进一步吸收，收缩胶原纤维中交联结构逐渐消失，胶原蛋白发生变性，使得纤维凝胶化，最终溶失[9]。流变学特征也发生相应变化，硬度逐渐降低，弹性逐渐升高，以及黏性持续增大[7-8]。该实验显示花刺参体壁蛋白溶失临界温度为70~80 ℃，随着温度和时间的递增，其蛋白溶失率逐渐升高。尽管如此，体壁收缩后的质量未变(表 1)，因为体壁局部溶失后的空洞(图 2)出现复吸水。因此，为保证花刺参体壁较低营养物质流失，其水煮温度不宜超过70 ℃，或者80 ℃水煮不超过10 min。
不同海参水煮之后的失重和蛋白溶失存在差别。刺参(S.japonicus)70 ℃和100 ℃水煮15 min后失重率分别为39.24%和64.72%，而70 ℃水煮24 h后为78.19%，均低于花刺参的失重率[6-8]，这可能与2种海参体壁结构差异有关。鲜活花刺参的CFCA/WCA值为(4.84±0.18)%，而鲜活刺参的可达到(24.36±0.68)%(数据未发表)，刺参体壁纤维网络更为密集。蛋白质溶失方面，刺参在50 ℃、70 ℃和100 ℃水煮15 min后的胶原蛋白溶失率分别为3.43%、7.28%和13.29%，相比花刺参，刺参在较低温度即开始溶失[6]。
3.2 体壁热稳定性
海参体壁主要组成蛋白为胶原蛋白，因此新鲜体壁的Tm主要由其胶原蛋白的Tm决定。胶原蛋白内部α肽链间通过氢键形成稳定的三螺旋结构，随着温度升高，氢键逐渐被破坏，直至α肽链散开成自由线性肽[21-22]。温度升至Tm时，即50%的胶原蛋白因α肽链从三螺旋结构中散开而变性，因此，体壁热稳定性可以变性温度Tm值定量表达。
体壁胶原蛋白的热稳定性决定其胶原蛋白收缩和变性温度，从而决定了体壁加热收缩和蛋白溶失时所需的热量，即加热温度和时间。通常海洋动物胶原蛋白收缩温度低于变性温度20 ~25 ℃，此值不因物种差异而不同[23-25]。实验结果表明，花刺参显著收缩失重开始于50 ~60 ℃，而蛋白溶失率升高温度发生在70 ~80 ℃，与花刺参体壁Tm值结果相一致。相比而言，温带种仿刺参体壁的Tm值为57 ℃，其蛋白质的溶失在50 ~70 ℃即开始[7]。可见热稳定性是决定海参体壁水煮加热过程中形态和成分变化的主要原因，不同海参种因体壁蛋白热稳定性差别，其相应的加工方法也应适当调整。
3.3 体壁组织微观形态结构
SEM是研究微观世界表观形态的重要研究手段，能很好地分析肉品横切面立体形态[18, 26]。有关SEM下海参体壁横切面的微观形态研究尚未开展，采用SEM比较研究不同水煮条件下海参体壁横切面组织结构的形态，能够更直观地认识其质构及口感的差异。通过SEM，不同处理条件下的花刺参体壁横截面形态能够直观呈现。由于硬度是由单位体积内分子量大小决定，胶原纤维具有可形变性，故体壁硬度和弹性与其胶原纤维含量及网络结构相关，即胶原纤维网络越密集，硬度越大，而弹性越低[7-8, 27-29]。该实验中温度超过70 ℃时，CFCA/WCA比值开始显著上升，表明胶原纤维网络密集度随着温度和时间的递增而升高。而由于花刺参胶原纤维的分子量由纤维直径决定，CFCA/WCA比值能够间接反映体壁的硬度。可见，根据不同水煮条件下体壁组织结构特征分析，花刺参体壁水煮过程中，随着体壁的收缩，纤维网络的密集化，硬度升高，而弹性降低。此外，尽管胶原纤维在80 ~90 ℃时收缩，纤维网络变得密集，但是其中空洞的出现，表明此温度下水煮，海参体壁胶原纤维已出现凝胶化与溶失。
通常，新鲜海参体壁经水煮后黏性增加，其口感不易为人所接受，而在保证低黏性和适当柔嫩性的较佳口感前提下，海参体壁的硬度和弹性越大给人的感觉越好[10, 30]。可见当海参体壁水煮加热至整体收缩，且胶原纤维交联结构还未消失时，具有较佳的口感，胶原蛋白变性溶失最少。研究发现，由于剌参体壁于50 ℃加热15 min时，体壁不收缩，体壁剧烈热收缩时的条件是70 ℃加热15 min，致使硬度增大，弹性减小；而此温度下持续加热超过1 h，相反其硬度减小，弹性增加，但黏性持续增加[7-8]。对于海参新鲜体壁，加热温度超过其胶原蛋白的收缩度时才会发生热收缩，且加热时间过长将导致体壁凝胶化和黏性增加而影响口感。因此，花刺参最佳的水煮温度和时间为70 ℃加热20~30 min，或80 ℃以上加热不超过10 min。
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图 2 不同温度和时间下花刺参体壁横截面形态
*.新鲜体壁；a~e.水煮温度分别为50 ℃、60 ℃、70 ℃、80 ℃、90 ℃；行1. SEM原图，放大倍数=100倍，比例尺=250 μm；行2.行1原图中纤维被切割的部分用蓝色替代；列10 min.水煮时间10 min；列20 min. 水煮时间20 min；列30 min. 水煮时间30 min
Figure 2. Cross-section morphology of body wall at different temperatures and time during cooking
*. fresh body wall; a~e. cooking at 50 ℃, 60 ℃, 70 ℃, 80 ℃ and 90 ℃, respectively; Line 1. SEM photographs, magnification: 100, scale bar=250 μm; Line 2. cross-section of fibers in photographs of Line 1 is replaced by blue colors in Line 2;column 10 min. cooking for 10 min; column 20 min.cooking for 20 min; column 30 min. cooking for 30 min
表 1 不同温度和时间下花刺参体壁失重率
Table 1 Weight loss of body wall at different temperatures and time during cooking
温度/℃
temperaturet/min 失重率/%
rate of weight loss50 10 10.25±1.15a 20 12.85±1.72a 30 15.35±2.22a 60 10 27.75±2.22b 20 47.89±2.13c 30 56.91±1.76cd 70 10 66.05±2.70de 20 79.51±2.73f 30 80.40±2.16f 80 10 83.31±2.66f 20 84.60±1.26f 30 87.19±2.60f 90 10 84.37±2.23f 20 86.38±1.36f 30 86.05±2.06f 新鲜体壁fresh body wall 含水量 93.67±0.86g 注：数值由“平均值±标准差”表示，数值右上角不同字母表示差异显著(P＜0.05)，下表同此
Note：Data are expressed as X±SD of three determinations，and values with different superscript letters are significantly different from one another (P＜0.05). The same case in the following tables.
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表 2 不同温度和时间下花刺参体壁蛋白溶失率
Table 2 Protein loss of body wall at different temperatures and time during cooking
温度/℃
temperaturet/min 蛋白溶失率/% 标准品BSA
rate of protein loss BSA as standard蛋白溶失率/% 标准品PSC
rate of protein loss PSC as standard50 10 0.09±0.03a 0.28±0.03a 20 0.12±0.03a 0.41±0.07a 30 0.14±0.02a 0.47±0.05a 60 10 0.18±0.04ab 1.74±0.12b 20 0.19±0.03ab 2.75±0.08c 30 0.20±0.02ab 2.82±0.08c 70 10 0.33±0.09b 5.65±0.10d 20 0.49±0.08bc 6.89±0.09d 30 0.52±0.07bc 7.15±0.11d 80 10 0.82±0.07d 7.78±0.11d 20 1.95±0.08e 13.10±0.06ef 30 2.51±0.08f 16.67±0.11f 90 10 1.77±0.09e 11.89±0.11e 20 2.56±0.10f 15.91±0.06f 30 2.72±0.08f 17.84±0.09f
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表 3 不同温度和时间下花刺参体壁纤维横截面与总横截面积比
Table 3 Ratio of CFCA to WCA at different temperatures and time during cooking
温度/℃
temperaturet/min CFCA/WCA比值/%
ratio of CFCA to WCA新鲜体壁fresh body wall 4.84±0.18a 50 10 12.59±1.34b 20 13.00±1.91b 30 13.05±1.79b 60 10 13.35±1.69b 20 14.96±2.26b 30 16.69±2.35bc 70 10 15.67±2.39bc 20 16.91±1.42bc 30 18.08±1.88c 80 10 17.68±1.32c 20 18.64±1.97c 30 21.76±1.63cd 90 10 19.89±2.42c 20 20.80±1.58cd 30 24.28±2.39d
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