Real-time quantitative PCR for detection of Streptococcus agalactiae from tilapia tissue
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摘要:
为建立一种罗非鱼组织内无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)的定量检测方法，以无乳链球菌cfb基因为靶标建立了TaqMan荧光探针实时定量PCR方法，并对该方法的特异性、敏感性及实用性进行了验证。应用建立的方法检测无乳链球菌标准菌株和阳性菌株均为阳性，阴性对照菌株均为阴性；无乳链球菌基因组DNA最低检测质量浓度为3.42×10-7 ng · μL-1，每个反应体系检测下限低于10个细胞；人工感染罗非鱼肝、脾、中肠和肾组织样品无乳链球菌检测结果均为阳性，组织样品每微克DNA可检测到无乳链球菌细胞数量分别为2.95×103个、2.45×107个、2.34×103个和4.54×104个，对照组为阴性。结果表明建立的罗非鱼组织内无乳链球菌实时荧光定量PCR检测方法具有准确性高、特异性和敏感性强等特点，可对罗非鱼组织内无乳链球菌进行快速定量检测，可用于罗非鱼无乳链球菌病的监测与预防。
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关键词:
- 罗非鱼 /
- 无乳链球菌 /
- 实时荧光定量PCR /
- TaqMan荧光探针
Abstract:By designing primers and probe based on the conserved region of cfb gene of Streptococcus agalactiae isolated from tilapia, we developed a real-time fluorescent PCR assay for detection of S.agalactiae from tilapia tissue and verified the specificity, sensitivity and practicability of the assay. The standard and positive strains of S.agalactiae were positive, and all negative controls were negative. The minimum detectable concentration of S.agalactiae genome DNA was 3.42×10-7 ng · μL-1, and the detection limit of the assay was less than 10 cells per reaction system. The genome DNA samples of midgut, liver, spleen and kidney which were collected from tilapia artificially infected with S.agalactiae were tested by real-time PCR and were positive. The quantities of S.agalactiae detected in per μg DNA of tissue samples were 2.95×103 cells, 2.45×107 cells, 2.34×103 cells and 4.54×104 cells, respectively, and the controls were negative. The results show that the real-time quantitative PCR assay which we developed was accurate, specific and sensitive, and could detect S.agalactiae from various tilapia tissues rapidly. The method can be used for surveillance and prevention of S.agalactiae disease of tilapia.
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Keywords:
- tilapia /
- Streptococcus agalactiae /
- real-time quantitative PCR /
- TaqMan probe
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中国是罗非鱼养殖量最大的国家，2004年开始年产量均占世界总产量40%以上[1]。链球菌病是罗非鱼养殖最主要的疾病之一，每年给世界罗非鱼养殖业造成巨额的经济损失[2-3]。2001年链球菌病在中国罗非鱼养殖区域零星暴发，造成个别养殖场5%~15%的累积死亡率[4]。2009年~2011年链球菌病大规模暴发流行，95%以上的罗非鱼养殖场均有不同程度的发病，累积死亡率可达30%~80%[2, 5]。罗非鱼链球菌病流行病学研究表明近几年中国罗非鱼链球菌病的优势流行菌种为无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)[5]。无乳链球菌被称为B群链球菌(group B Streptococcus，GBS)[6]，也是新生儿、孕妇、免疫抑制人群疾病及奶牛乳房炎的重要病原[7-8]。全基因组比对分析结果显示中国罗非鱼源无乳链球菌分离株与美国人源无乳链球菌分离株具有较近的亲缘关系[9]。
对罗非鱼链球菌病流行病学和无乳链球菌感染机制研究，是有效预防该病发生与流行的重要方法。传统病原检测一般先从组织内进行细菌分离培养再鉴定，存在操作繁琐、检测周期长以及检测结果不稳定等问题。另外，在感染初期或细菌与机体达到某种平衡处于抑制生长的稳态情况下组织中细菌数量少，细菌分离有可能为假阴性。分子生物学检测技术具有特异、敏感、快速等特点，且检测结果准确稳定。王均等[10]建立的双重PCR检测方法可快速准确检测出罗非鱼肝和肾组织内无乳链球菌，最小模板检出量为7.632×10-2 ng · μL-1。黎炯等[11]建立的双重PCR可快速鉴别无乳链球菌和海豚链球菌(S.iniae)，最低基因组检测量分别为3.2×10-3 ng · μL-1和3.0×10-2 ng · μL-1，但未进行组织样品检测验证。无乳链球菌实时荧光定量PCR检测方法的研究主要集中于人和奶牛，如BERGERON等[12]建立的荧光定量PCR可快速准确对产妇直肠和产道擦拭样品进行检测；GOLDEN等[13]建立的荧光定量PCR可检测新生儿血液中无乳链球菌，最低检测值约为100个拷贝；MAHMMOD等[14]通过荧光定量PCR检测牛奶中无乳链球菌以确诊奶牛乳腺是否感染无乳链球菌。目前，普通PCR检测方法只能对无乳链球菌进行定性检测，不能对组织内无乳链球菌准确定量；而荧光定量PCR检测多为诊断性研究，检测样品多为培养物、血液或牛奶等，少见对组织样品特别是内脏组织检测。因此，该研究拟建立一种罗非鱼组织内无乳链球菌实时荧光定量PCR检测方法，为进一步研究无乳链球菌的组织分布与组织嗜性奠定基础。
1. 材料与方法
1.1 材料
体质量25~35 g的吉富罗非鱼(Oreochromis niloticus)购自国家级罗非鱼良种场(南宁)。罗非鱼无乳链球菌菌株YM001，由笔者实验室保存，无乳链球菌标准菌株ATCC27956、海豚链球菌标准菌株ATCC29178、停乳链球菌(S.dysgalactiae)标准菌株NCTC4335、副乳房链球菌(S.parauberis)标准菌株MCCCA01039和格氏链球菌(S.gordonii)标准菌株MCCCA07812均购自中国微生物菌种保藏中心。
1.2 引物和探针
无乳链球菌特异性引物和探针见表 1。参考江凌晓等[15]报道序列，根据GenBank中无乳链球菌特异性基因cfb序列(GeneID 3686873)设计，扩增片段大小为113 bp，引物由宝生物工程(大连)有限公司合成。
表 1 引物与探针序列Table 1. Sequences of primers and probe引物/探针primer/probe 序列sequence(5′→3′) cfb-F(5′→3′) forward CGGTTAATgAGGCTATTACTAGTG cfb-R(5′→3′) reverse ATCTGTTAAGGCTTCTACACGAC cfb-P(5′→3′) probe FAM-TTCATTGCGTGCCAACCCTGAGACA-Eclipse 1.3 罗非鱼无乳链球菌模板DNA的制备
菌株YM001接种于胰胨大豆蛋白胨液体培养基(TSB)培养24 h，测定光密度(OD600)使用PBS将菌液浓度调为1×109个· mL-1。取调整浓度后的菌液1 mL，10 000 r · min-1离心1 min弃上清，加入180 μL缓冲液(20 mmol · L-1 Tris，pH 8.0；2 mmol · L-1 Na2-EDTA；1.2% Triton；质量浓度为20 mg · mL-1的溶菌酶)，37 ℃处理40 min后按照细菌基因组DNA提取试剂盒(天根)说明书提取DNA，加入RNA酶37 ℃作用30 min，核酸蛋白分析仪测定DNA质量浓度和纯度，1.5%琼脂糖凝胶电泳拍照观察，-20 ℃冰箱保存备用。
1.4 罗非鱼无乳链球菌实时荧光定量PCR扩增
按照Real Time PCR/TaqMan®探针检测试剂盒(宝生物)说明书方法进行PCR扩增，反应体系为Premix Ex Taq 25.0 μL、Forward Primer 1.0 μL、Reverse Primer 1.0 μL、TaqMan® Probe 2.0 μL、ROX Reference Dye II 0.5 μL、DNA模板4.0 μL、灭菌蒸馏水16.5 μL，总计50 μL；反应程序为95 ℃ 20 s；95 ℃ 3 s，60 ℃ 30 s，40个循环。每次试验均包括空白对照(模板DNA由ddH2O代替)。PCR产物送至宝生物工程(大连)有限公司测序。
1.5 特异性试验
以无乳链球菌标准菌株ATCC27956及试验菌株YM001、海豚链球菌标准菌株ATCC29178、停乳链球菌标准菌株NCTC4335、副乳房链球菌标准菌株MCCCA01039和格氏链球菌标准菌株MCCCA07812基因组DNA为模板，按上述反应体系和反应条件进行实时荧光定量PCR扩增检测方法的特异性。各菌株基因组DNA的提取方法同1.3。
1.6 灵敏度测定及标准曲线的建立
对109个· mL-1无乳链球菌DNA样品做l0倍系列稀释，共稀释8个浓度(10-1~10-8)，分别相当于108~101个· mL-1无乳链球菌DNA样品，采用建立的方法进行PCR扩增，测定能检测到核酸扩增条带的最低模板浓度并建立标准曲线。
1.7 罗非鱼组织内无乳链球菌检测
取20尾试验罗非鱼分为A、B两组，每组10尾，试验前暂养2 d。使用自制灌胃器对A组试验鱼经口灌胃PBS重悬无乳链球菌YM001菌液，1.5×107个· 尾-1，B组灌胃PBS溶液。灌胃6 h后分别采集A组和B组试验鱼的肝、中肠、脾和肾，-80 ℃保存备用。采集中肠时用PBS冲洗3次后取2 cm保存。将-80 ℃保存样品置于液氮预冷的研钵中，快速研磨成粉末状，加入溶菌酶溶液处理后，按宝生物工程(大连)有限公司组织DNA抽提试剂盒说明书进行试验鱼组织DNA的抽提。核酸蛋白分析仪测定DNA质量浓度及OD260/280，将各组织样品的DNA质量浓度均调整为0.2 μg · μL-1，按照建立的荧光定量PCR检测方法对各样品进行扩增，根据扩增Cт值和公式计算无乳链球菌数量。计算公式为0.8Cт=m[log(Q)]+b，其中Cт为样品的阈值循环数，m为标准曲线斜率-2.057，Q为上样检测到无乳链球菌数量，b为标准曲线的Y轴截距32.677。然后根据公式A=Q/(0.2×4)计算组织样品每微克DNA可检测到无乳链球菌数量，其中A为组织样品每微克DNA可检测到无乳链球菌数量，Q为上样检测到无乳链球菌数量，0.2为检测DNA质量浓度(μg · μL-1)，4为上样量(μL)。
2. 结果
2.1 实时荧光定量PCR特异性试验
PCR扩增产物序列分析表明扩增产物与cfb基因目标序列100%一致。利用建立的实时荧光定量PCR方法对无乳链球菌标准菌株ATCC27956及试验菌株YM001、海豚链球菌标准菌株ATCC29178、停乳链球菌标准菌株NCTC4335、副乳房链球菌标准菌株MCCCA01039和格氏链球菌标准菌株MCCCA07812的基因组DNA进行扩增。经过40个循环，扩增曲线(图 1)和扩增产物电泳结果显示(图 2)，无乳链球菌标准菌株和试验菌株YM001基因组DNA有特异性扩增，其他4种细菌样品和空白对照扩增均为阴性，表明建立的实时荧光定量PCR具有良好的特异性。
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图 1 荧光定量PCR特异性试验扩增曲线A和B分别为无乳链球菌标准菌株ATCC27956和试验菌株YM001基因组DNA扩增曲线Figure 1. Amplification curve of real-time PCR specific testA and B represent amplification curves of standard strain ATCC27956 and test strain YM001 of S.agalactiae![]()
图 2 无乳链球菌荧光定量PCR特异性扩增结果1. ATCC27956(S.agalactiae)；2. YM001(S. agalactiae)；3~6. 分别为ATCC29178(S.iniae)，NCTC4335 (S.dysgalactiae)，MCCCA01039 (S.parauberis)，MCCCA07812 (S.gordonii)；7. 空白对照；M.DNA分子量标记Figure 2. Real-time PCR of specificity for S.agalactiaeLanes 1~7. ATCC27956(S.agalactiae), YM001(S.agalactiae), ATCC29178(S.iniae), NCTC4335 (S.dysgalactiae), MCCCA01039 (S.parauberis), MCCCA07812 (S.gordonii) and blank control, respectively; M. DNA Marker(DL 2000)2.2 实时荧光定量PCR的灵敏度试验及标准曲线
109个· mL-1无乳链球菌YM001提取的基因组DNA样品质量浓度为34.2 ng · μL-1，OD260/280为1.92。梯度稀释后不同稀释浓度无乳链球菌基因组DNA扩增曲线见图 3，从左到右依次为相当于108~101个无乳链球菌的基因组DNA样品扩增曲线。实时荧光定量PCR扩增曲线和扩增产物电泳(图 4)结果显示，浓度大于10个· mL-1无乳链球菌的基因组DNA样品(包括10)PCR扩增全部为阳性，即该实时荧光定量PCR方法检测下限每个反应体系低于10个细胞。
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图 3 荧光定量PCR灵敏度试验扩增曲线从左向右依次为10-1~10-8倍稀释样品扩增曲线Figure 3. Amplification curves of real-time PCR sensitivity testThe curves from left to right are amplification curves of the 10-1~10-8 times diluted samples![]()
图 4 无乳链球菌荧光定量PCR灵敏度扩增结果1~8分别为10-1~10-8倍稀释样品扩增产物；M. DNA分子量标记(DL 2000)Figure 4. Real-time PCR of sensitivity for S.agalactiaeLanes 1~8. amplification products of the 10-1~10-8 times diluted samples; M. DNA Marker(DL 2000)以基因组DNA模板来源样品量即无乳链球菌的菌体数量为横坐标，以PCR反应过程中样品扩增达到域值水平所经历的循环数(Ct)为纵坐标制作无乳链球菌实时荧光定量PCR检测标准曲线(图 5)，标准曲线的回归系数为0.991。
2.3 罗非鱼组织内无乳链球菌实时荧光定量PCR检测
对分别口服灌胃无乳链球菌YM001和PBS的A组和B组试验鱼灌胃后6 h的肝、中肠、脾和肾组织的基因组DNA进行实时荧光定量PCR检测，A组样品均出现扩增，而B组和空白对照均未有扩增出现。结果显示，A组试验鱼肝、脾、中肠和肾组织样品的每微克DNA可检测到无乳链球菌数量分别为2.95×103个、2.45×107个、2.34×103个和4.54×104个。各组织每微克DNA检测到无乳链球菌数lg值与组织的对应关系见图 6，图中纵坐标为组织样品每微克DNA可检测到无乳链球菌数量的lg，横坐标为采样组织。
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图 6 罗非鱼组织内无乳链球菌荧光定量PCR检测Figure 6. Real time PCR detection of S.agalactiae from the tissues of tilapia3. 讨论
链球菌病是目前罗非鱼养殖危害最为严重的病害之一，每年给世界和中国罗非鱼养殖造成巨额的经济损失。鱼源致病菌多为条件性致病菌，快速准确地对病原进行鉴定对鱼类疾病的预防与控制具有重要作用。研究表明近几年中国罗非鱼链球菌病流行菌种主要为无乳链球菌。毒力因子相关基因是致病性细菌的特有基因，相对于细菌16S rRNA基因菌种间特异性更强，已被用于多种水生动物致病菌的快速检测[16-18]。cfb基因是无乳链球菌特有的毒力基因，编码的CAMP因子被作为临床诊断和鉴别无乳链球菌的一个重要指标[11, 19]。王均等[10]和黎炯等[11]根据cfb基因分别建立了罗非鱼无乳链球菌PCR快速检测方法，证实该基因对其他水产动物常见病原菌具有特异性。
实时荧光定量PCR是在PCR定性技术的基础上发展起来的核酸定量技术，可对目的DNA模板进行定量监测，而且相对普通PCR具有灵敏度高、特异性和可靠性更强，具实时性和准确性等特点[20-21]。该研究建立的荧光定量PCR技术，对无乳链球菌样品可进行特异性扩增，而对与其亲缘关系较近的海豚链球菌、停乳链球菌、副乳房链球菌和格氏链球菌扩增均为阴性。王均等[10]和黎炯等[11]建立的PCR快速检测方法可检测无乳链球菌基因组DNA的最低质量浓度分别为3.2×10-3 ng · μL-1和7.632×10-2 ng · μL-1。该研究对109个无乳链球菌基因组DNA样品进行10-8倍稀释，质量浓度为3.42×10-7 ng · μL-1，仍可产生特异性扩增，Ct为31。结果表明该研究建立的罗非鱼无乳链球菌实时荧光定量PCR检测方法检测下限为每个反应体系低于10个，其敏感性远高于以上2种检测方法。通常通过构建重组质粒制备定量标准品，该标准品使用方便，定量准确，但制备过程较复杂，一般包括目的片段获取、目的片段与载体连接、感受态转化、阳性克隆鉴定、重组质粒抽提与定量等多个步骤[22]。该研究认为对于基因组供体较难计数的样品，必须选择该方法，但对于细菌等可进行准确计数的单细胞生物，可先对细菌进行定量，再抽提基因组DNA作为标准品，相对质粒标准品制备更简便。
目前，无乳链球菌实时荧光定量PCR检测方法的研究，主要集中于人和奶牛，检测样品主要为培养物[12]、血液[13]或牛奶[14]等，且多为诊断性研究，少见对组织样品特别是内脏组织检测。该研究应用建立的方法对口服灌胃无乳链球菌感染的罗非鱼4种组织基因组DNA进行检测，结果表明该方法可对抽提的罗非鱼组织基因组DNA中混有的无乳链球菌基因组DNA进行定性和定量检测。结果显示口服灌胃无乳链球菌感染6 h，脾组织中检测到无乳链球菌的量最高，这可能与脾是鱼类重要的免疫器官有关[23]。为了比较不同组织相同量基因组DNA中混有无乳链球菌基因组DNA的差异，该研究将抽提的各组织基因组DNA质量浓度均调整为0.2 μg · μL-1，如需检测相同质量不同组织中无乳链球菌的数量差异，可对组织称量后提取基因组DNA检测。综上所述，该研究建立的实时荧光定量PCR检测方法具有高度的特异性和敏感性，可对罗非鱼组织中的无乳链球菌进行定量检测，适用于罗非鱼无乳链球菌感染发病的实时监控，也为进一步研究无乳链球菌的组织分布与组织嗜性奠定基础。
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图 1 荧光定量PCR特异性试验扩增曲线
A和B分别为无乳链球菌标准菌株ATCC27956和试验菌株YM001基因组DNA扩增曲线
Figure 1. Amplification curve of real-time PCR specific test
A and B represent amplification curves of standard strain ATCC27956 and test strain YM001 of S.agalactiae
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图 2 无乳链球菌荧光定量PCR特异性扩增结果
1. ATCC27956(S.agalactiae)；2. YM001(S. agalactiae)；3~6. 分别为ATCC29178(S.iniae)，NCTC4335 (S.dysgalactiae)，MCCCA01039 (S.parauberis)，MCCCA07812 (S.gordonii)；7. 空白对照；M.DNA分子量标记
Figure 2. Real-time PCR of specificity for S.agalactiae
Lanes 1~7. ATCC27956(S.agalactiae), YM001(S.agalactiae), ATCC29178(S.iniae), NCTC4335 (S.dysgalactiae), MCCCA01039 (S.parauberis), MCCCA07812 (S.gordonii) and blank control, respectively; M. DNA Marker(DL 2000)
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图 3 荧光定量PCR灵敏度试验扩增曲线
从左向右依次为10-1~10-8倍稀释样品扩增曲线
Figure 3. Amplification curves of real-time PCR sensitivity test
The curves from left to right are amplification curves of the 10-1~10-8 times diluted samples
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图 4 无乳链球菌荧光定量PCR灵敏度扩增结果
1~8分别为10-1~10-8倍稀释样品扩增产物；M. DNA分子量标记(DL 2000)
Figure 4. Real-time PCR of sensitivity for S.agalactiae
Lanes 1~8. amplification products of the 10-1~10-8 times diluted samples; M. DNA Marker(DL 2000)
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图 6 罗非鱼组织内无乳链球菌荧光定量PCR检测
Figure 6. Real time PCR detection of S.agalactiae from the tissues of tilapia
表 1 引物与探针序列
Table 1 Sequences of primers and probe
引物/探针primer/probe 序列sequence(5′→3′) cfb-F(5′→3′) forward CGGTTAATgAGGCTATTACTAGTG cfb-R(5′→3′) reverse ATCTGTTAAGGCTTCTACACGAC cfb-P(5′→3′) probe FAM-TTCATTGCGTGCCAACCCTGAGACA-Eclipse 
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