Effect of ammonia-N stress on non-specific immunity of tilapia (Oreochromis niloticus×O.areus)
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摘要:
将奥尼罗非鱼(Oreochromis niloticus×O.areus)幼鱼暴露于不同质量浓度(0、2.5 mg · L-1、5 mg · L-1、10 mg · L-1和20 mg · L-1)的氨氮溶液中，于第0、第12、第24、第48和第72小时测定其非特异性免疫相关指标。结果表明，试验幼鱼经氨氮胁迫后各试验组血清溶菌酶活力随着胁迫时间的延长下降显著(P < 0.05)。氨氮胁迫明显影响鱼肝脏总抗氧化能力(T-AOC)及相关抗氧化酶活力。与对照组相比，随胁迫时间增加各试验组肝脏T-AOC及总超氧化物歧化酶(T-SOD)活力均先下降后上升(P < 0.05)。过氧化氢酶(CAT)及谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)活力变化还与胁迫溶液浓度相关。低浓度组(2.5 mg · L-1和5 mg · L-1)，CAT活力在胁迫24 h后显著下降(P < 0.05)；高浓度组(10 mg · L-1和20 mg · L-1)，CAT活力却出现先升高后降低的变化。除最高浓度组，各试验组GSH-Px活力表现为诱导效应(P < 0.05)。试验条件下氨氮胁迫对罗非鱼非特异性免疫产生明显影响，且随浓度增加及时间延长影响程度加大。
Abstract:The juveniles of tilapia (Oreochromis niloticus×O.Areus) were exposed to ammonia-N (0, 2.5 mg · L-1, 5 mg · L-1, 10 mg · L-1 and 20 mg · L-1) for 0, 12 h, 24 h, 48 h and 72 h to evaluate the effect of ammonia-N stress on their non-specific immunity. Results show that the activity of serum lysozyme decreased significantly with extension of stress time (P < 0.05). The total antioxidant capacity (T-AOC) and activity of antioxidase in liver were significantly affected. The activity of T-AOC and total superoxide dismutase (T-SOD) of fish exposed to ammonia-N were initially decreasing then increasing(P < 0.05). Activities of catalase (CAT) and glutathione peroxidase (GSH-Px) were correlated with concentrations of ammonia-N. Fish exposed to lower concentrations (2.5 mg · L-1, 5 mg · L-1) showed decreasing CAT activity within 24 h (P < 0.05), while those exposed to higher concentrations (10 mg · L-1, 20 mg · L-1) showed initially increasing then decreasing activity of CAT. Except for the highest concentration groups, fish exposed to ammonia-N showed induction activity of GSH-Px (P < 0.05). Under the experimental conditions, non-specific immunity of tilapia was affected by ammonia-N stress, and the impact was increasing with increasing concentration and extension of time.
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海蜇(Rhopilema esculentum)是中国传统渔业生产的主要大型经济水母，因其独特的营养成分、特殊的口感及较高的药用价值而深受广大消费者的青睐。医学研究表明，海蜇可以治疗高血压、支气管炎、淋巴结核、哮喘、矽肺等疾病[1-2]。近年来，海蜇产品也渐为西方国家所接受，美国Auburn大学的研究小组报道，海蜇的胶原质对实验鼠抗原引起的关节炎有一定的抑制作用[3-7]。在中国，海蜇是重要的水产加工制品之一，而明矾是其加工过程中不可或缺的脱水剂，同时在鱼糜制品、即食鱼皮等产品加工过程中也偶有添加，主要起到护色、抗氧化和凝固等作用。明矾遇水呈酸性，而蛋白质的等电点皆偏酸性，蛋白质在等电点时颗粒之间静电斥力最小，溶解度也小，使海蜇保持凝固状态而具有一定的厚度，从而增加了海蜇产品的弹性。明矾的加入在一定程度上可以明显提高产品的品质，但会引起Al的残留，加入过多的明矾会造成Al残留量偏高。而Al在人体内不断累积会引起神经系统的病变，干扰人的思维、意识和记忆功能，严重者可能痴呆。1988年世界卫生组织正式确定Al为食品污染物，并对其使用及残留状况加以严格控制，提出Al的PTWI值(每人每周每千克体质量摄入量)为7 mg · kg-1[10]。目前，中国只对面制品及部分水产品中Al(明矾)的允许限量作了规定，面制品的卫生标准为100 mg · kg-1，水产行业标准中《盐渍海蜇皮和盐渍海蜇头》规定明矾在海蜇中的质量分数为不得大于2.2%[11]。
目前，Al的常用测定方法有乙二胺四乙酸(EDTA)滴定法[12]、铬天青S-分光光度法[13]、原子吸收分光光度法(atomic absorption spectrometry，AAS)[14]、电感耦合等离子体发射光谱法(inductively coupled plasma optical emission spectrometer，ICP-OES)和电感耦合等离子体质谱法(inductively coupled plasma mass spectrometry，ICP-MS)。随着仪器分析测定金属元素含量技术的长足进步，如原子吸收光谱法、原子荧光法以及电感耦合等离子体质谱等的报道较多[15]。在中国，适于检测海蜇中明矾，并具有法律意义的方法有《SC/T 3210-2001盐渍海蜇皮和盐渍海蜇头》，另外，通用的金属检测方法有原子吸收分光光度法、ICP-OES法、ICP-MS法等。这些方法的前处理、检测原理和检测的灵敏度各不相同，检测的结果差异较大，让海蜇产品生产厂家无所适从，令消费者迷惑。然而，这些方法之间的差异比较仍未见有报道，因此，有必要仔细对比这些方法的优缺点，为生产厂家、消费者和执法部门提供参考依据。
1. 材料与方法
1.1 材料与试剂
市售即食海蜇。
明矾、高氯酸、EDTA、氢氧化钠、铝标准贮备液、金属铝、氨水、盐酸、乙酸钠、冰乙酸、六次甲基四胺、二甲酚橙、氧化锌、铬天青S、溴化十六烷基三甲胺、抗坏血酸、浓硝酸和高纯氩气等均为国产分析纯，Al标准为国家标准样品GSB 04-1713-2004，标准值为1 000 μg · mL-1。实验用水在原子吸收光谱法中为去离子水，其他为蒸馏水。
1.2 仪器设备
Varian240Z原子吸收光谱仪(东南化学仪器有限公司出品)；AKKU-DRIVEⓇ TITRATION 20/50mL电子滴定仪(德国Hirschmann)；SPECTRONICⓇ GENESYSTM5分光光度计(Thermo Electron & Fisher Scientific；Thermo Fisher Scientific)；Ney VULCANTM 3-550A程控高温炉(Vulcan，USA)；CEM MARS微波消解仪(CEM)；Millipore超纯水系统(密理博中国有限公司出品)。
1.3 方法
水煮滴定法(boiled-titration method，BTM)，参考水产行业标准SC/T 3210-2001《盐渍海蜇皮和盐渍海蜇头》的方法。
酸煮滴定法(acid boiled-titration method，ABTM)，参考EDTA滴定的方法[15]。用5.0 mL高氯酸溶液(0.6 mol · L-1)代替样品滤液进行空白试验。每个处理做3个平行。
比色法(colorimetric method，CM)，参考GB 5009.182-2003的方法，样品处理方法略有改动。称取粉碎均匀的试样1.0~2.0 g于瓷坩埚中，用玻璃棒捻碎，然后用电炉炭化。炭化后移入550 ℃马弗炉中灰化3 h成白色灰烬，冷却后加入浓度为1 : 1的盐酸1 mL，蒸馏水2 mL，加热至沸，冷却后过滤，滤液用容量瓶定容至100 mL。比色操作与GB 5009.182-2003的方法相同，于640 nm波长处测其吸光度，绘制标准曲线比较定量。
原子吸收光谱法，参考张志胜等人原子吸收的方法[14]，方法略有改动。
1.4 数据统计方法
所得数据采用ANOVA和Duncan氏多重比较分析法进行统计分析，显著性水平设置为P < 0.05。
2. 结果分析
2.1 前处理方法的比较
4种方法前处理的现象详见表 1。水煮滴定法采用煮沸的方法释放海蜇中的Al离子，在酸性条件下Al离子与乙二胺四乙酸二钠反应形成稳定的络合物，用锌标准溶液滴定多余的EDTA溶液，计算样品中明矾的质量分数。试验过程中发现，水煮时提取液剧烈沸腾，出现大量泡沫，煮沸6 min后，液体呈白色半透明混浊。过滤后残渣明显，仍存较多的固形物，造成提取不完全。酸煮滴定法原理与水煮滴定法基本一致，主要采用高氯酸代替水溶液进行煮沸。煮沸时出现的泡沫明显少于水煮处理样品，处理完毕后液体呈暗黄色混浊，过滤快速，残渣不明显，表明海蜇已被完全溶解。比色法主要原理是Al离子在缓冲液体系里与络天青S及有机表面活性剂，如溴化十六烷基三甲基铵(CTAB)，十六烷基三甲基溴化铵(CPB)和聚乙二醇辛基苯基醚(OP)等，反应可形成蓝色的多元络合物，于特定波长处吸光值与Al离子质量分数成正比，可计算出Al质量分数。GB 5009.182-2003中采用湿法消化耗时长耗酸多，且消解液中残留的高氯酸对铬天青S显色影响很大，显色不稳定，影响定量。而该研究采用马福炉灰化的方法处理样品，改善了显色的稳定性。原子吸收光谱法则是利用原子吸收光度计针对元素特征，金属原子在气态时可以吸收一定波长的光辐射，使原子中外层的电子从基态跃迁到激发态的现象而建立的，而吸收辐射的强度可作为定量的依据。该法主要适用样品中微量及痕量组分分析，但海蜇中人为添加的明矾质量分数较高，采用原子吸收法测定时需要高倍数的稀释增加了操作的误差，影响了测量的准确性。
表 1 4种方法的前处理现象差异Table 1. Different pretreatment phenomena of 4 methods方法
methods样品处理量/g
sample weight前处理用时/min time 实验现象
experimental phenomena水煮滴定法BTM 10 6 煮沸后液体白色混浊，残渣明显，过滤速度慢。 酸煮滴定法ABTM 10 6 煮沸后液体浅黄色混浊，残渣较少，过滤速度快。 比色法CM 1 180 灰化后有少量黑色残留物，比色过程必须于30 min内完成。 原子吸收光谱法AASM 0.5 15 强酸煮沸或微波消解处理，消解完全，无可见颗粒。 2.2 检测结果比较
从表 2结果分析得出，水煮样品滤液的Al质量分数为223.06 mg · kg-1，用原子吸收光谱法验证水煮样品滤液及残渣中Al质量分数，测得滤液质量分数分别为262.36和323.68 mg · kg-1。可见还有相当大的一部分Al残留在滤渣中，水煮滴定法未能有效提取样品的Al，导致残渣中的Al未被测出。酸煮滴定法测得的Al质量分数与原子吸收光谱法测得的结果相近，但也明显高于水煮滴定法所测结果。马福炉-铬天青S分光光度法所测的Al质量分数为410.50 mg · kg-1。用原子吸收光谱法样品处理时必须将酸液赶尽，否则会影响试验结果，产生干扰，该法灵敏度较高，但仪器较昂贵。从比较得出，水煮滴定法所得结果误差较大，而酸煮滴定法和原子吸收光谱法的误差较少，可信度较高。
表 2 4种方法的测定结果比较Table 2. Result comparison of 4 determination methods方法
methodsw(Al)
/mg·kg-1w (明矾)/%
alum content水煮滴定法BTM 223.06±9.33a 0.42±0.017a 酸煮滴定法ABTM 470.03±8.54c 0.86±0.015c 比色法CM 410.50±19.30b 0.76±0.034b 原子吸收光谱法AASM 473.80±4.01c 0.85±0.007c 注：表中的值为平均值±SD(n=3)；同一列中具不同字母标记的数值表示差异显著(P＜0.05)。后表同此。
Note: Values (expressed as Mean±SD, n=3) with different letters in the same column are significantly different from one other (P＜0.055).The same case in the following table.2.3 检测方法的准确度和精密度
通过加标回收试验验证此方法的准确性。采用酸煮滴定法和水煮滴定法，在10 g海蜇样品中分别加入质量浓度为100 μg · mL-1Al标准液1、2、3、4和5 mL，相当于明矾加标量的0.18%、0.36%、0.54%、0.71%和0.89%。而比色法中海蜇样品处理量1.0 g，原子吸收光谱法的样品处理量为0.5 g，经单位转化后加标量与酸煮滴定法及水煮滴定法一致。由表 3比较数据分析得出，水煮滴定法的测定结果与其他3种方法存在差异明显，但其回收率与其他方法无明显差异，分析其原因可能是加标后，Al离子与海蜇结合较少，用水即可提取出来，而海蜇本身的含Al量未能检测出来。酸煮滴定法、比色法和原子吸收光谱法回收率在103.81%~107.60%，平均回收率为104.70%，符合分析要求。
表 3 4种方法的加标回收比较Table 3. Comparison of recovery of 4 determination methods加标量/mg·kg-1
added0 100 200 300 400 500 平均回收率/%
average recovery水煮滴定法BTM 223.06±9.33a 334.60±6.07a 455.42±6.47a 561.64±3.72a 675.83±3.01a 801.97±2.33a 102.51±2.61 酸煮滴定法ABTM 470.03±8.54c 582.89±8.77c 707.70±6.45c 805.95±6.88d 867.03±5.48c 973.25±5.79b 107.60±2.64 比色法CM 410.50±19.30b 527.36±4.67b 639.80±3.29b 747.19±3.71b 852.35±2.79b 965.47±3.07b 104.89±0.99 原子吸收光谱法AASM 473.80±4.01c 617.10±12.14d 684.70±7.40c 784.40±2.94c 923.60±4.38d 1001.60±2.90c 103.81±2.70 2.4 检测方法的检测限比较
根据检测限定义确定4种方法的检测限[16]。各方法的检测限比较见表 4。经比较得出水煮滴定法的检测限约为50 mg · kg-1，折合约0.1%的明矾量，酸煮滴定法的检测限比其低44%，约为0.05%的明矾。原子吸收光谱法和比色法的检测限较低，酸煮滴定法的检测限可以满足限量标准的要求，水煮滴定法的检测限最高。
表 4 4种方法的检测限Table 4. Comparison of determination limit of 4 determination methods方法
methodsw(Al)
/mg·kg-1w (明矾)/%
alum content水煮滴定法BTM 50.00 0.09 酸煮滴定法ABTM 28.00 0.05 比色法CM 5.00 0.01 原子吸收光谱法AASM 10.00 0.02 3. 讨论
3.1 方法的可操作性
酸煮滴定法和水煮滴定法样品处理方法原理一致，比较简便和容易操作，从试验现象可以看到，酸煮滴定法样品处理得比较完全，而水煮滴定法的样品处理后仍然有大量残渣，从而引起精确度降低，其检测结果数值明显低于其他3种方法。酸煮滴定法的数据稳定性好，试验重现性好。另外将比色法中样品处理的方法改为马福炉灰化法，从而避免Cl离子会对比色试验的干扰，定量更加精确，但样品处理时间太长，操作步骤也较多。原子吸收光谱法的样品处理为微波消解法，处理比较简便及完全，但因原子吸收光谱法适用于微量及痕量组分分析，对于高浓度样品检测准确性反而欠佳。
3.2 各种方法的优缺点
经过上述试验分析比较得出，4种检测方法产生检测结果的差异主要是各种前处理方法对Al元素的提取回收效率差异引起的。采用水煮提取时，海蜇组织没有被有效地分解，检测发现其处理残渣仍可检测出Al含量，但在加标回收率试验中，水煮法亦可达到较高的回收率，表明该法只将游离的Al离子提取出来，而与海蜇组织结合的Al离子则没有被很好地提取出来，导致检测结果偏小。酸煮法处理在强酸性条件下可将海蜇组织有效分解，然后采用较为成熟的滴定法，可稳定检测出海蜇中的含Al量。比色法和原子吸收分光光度法所采用的都是完全消化的处理方法，更能有效提取Al离子，所检测的结果与酸煮滴定法基本一致。ICP-OES法和ICP-MS法虽然操作简便，灵敏度和准确度高，但所使用的仪器价格昂贵，一般的质检机构都不具备。另外，由于Al是高温元素，原子吸收光谱法中原子化温度较高，测定干扰大，对石墨管的要求也较高，容易产生记忆效应。
3.3 方法的准确性分析
有学者认为如果海蜇本身含Al量很高，外加的无机Al只占其中的小部分，采用完全消化的方法检测出的是全部Al元素的含量，这样会引起对海蜇产业不公正的判断。此试验检测过未经加工的新海蜇中Al元素含量，结果发现其中Al元素含量极少(μg)，与外加的Al元素(mg)相差较大，可见海蜇产品中的Al元素来源主要为加工过程添加产生。因此，采用完全消化的方法处理样品，检出海蜇产品中的Al离子，可作为海蜇产品后期加工添加明矾量的评价指标。综上所述，酸煮滴定法操作简便、耗时短、准确、重现性更好、花费少、样品处理完全，结果精确度符合检测精度要求等，适用于生产工厂和检测机构日常检测任务。
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表 1 氨氮胁迫对奥尼罗非鱼血清中溶菌酶质量浓度的影响
Table 1 Effect of ammonia-N stress on concentration of lysozyme in serum of tilapia (O.niloticus×O.areus)
μg·mL-1 组别group 时间/h time 0 12 24 48 72 C0 3.23±0.14 3.03±0.21 3.11±0.09 3.26±0.23 3.14±0.13 C1 3.23±0.14a 2.85±0.38a 2.31±0.20b 2.38±0.17b 2.18±0.17b C2 3.23±0.14a 2.99±0.11ab 2.76±0.23b 2.24±0.18c 1.97±0.11c C3 3.23±0.14a 2.18±0.12b 2.01±0.17b 1.62±0.05c 1.62±0.09c C4 3.23±0.14a 2.70±0.19b 1.87±0.14c 1.67±0.06c 1.60±0.16c 注：表中同行字母表示同一剂量不同暴露时间点之间的比较，相邻字母表示差异显著(P < 0.05)；后表同此Note：Values with neighboring letters letters in the same row are significantly different from one another (P < 0.05). The same case in the following tables. 
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表 2 氨氮胁迫对奥尼罗非鱼肝脏总抗氧化能力的影响
Table 2 Effect of ammonia-N stress on T-AOC capacity in liver of tilapia (O.niloticus×O.areus)
U·mg-1 组别group 时间/h time 0 12 24 48 72 C0 3.38±0.65 3.31±0.26 3.58±0.32 3.44±0.22 3.59±0.31 C1 3.38±0.65a 2.75±0.18b 0.66±0.10c 0.90±0.10c 2.53±0.28b C2 3.38±0.65a 1.20±0.30c 0.60±0.09c 0.77±0.09c 2.46±0.38b C3 3.38±0.65a 1.16±0.31c 0.30±0.02d 0.27±0.03d 1.86±0.24b C4 3.38±0.65a 1.32±0.29b 0.29±0.04c 0.59±0.09c 1.62±0.32b
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表 3 氨氮胁迫对奥尼罗非鱼肝脏总超氧化物歧化酶活力的影响
Table 3 Effect of ammonia-N stress on T-SOD activity in liver of tilapia (O.niloticus×O.areus)
U·mg-1 组别group 时间/h time 0 12 24 48 72 C0 30.37±2.37 31.54±3.12 29.97±2.01 32.03±3.09 33.12±2.07 C1 30.37±2.37b 18.86±2.04c 15.27±2.37cd 11.02±1.49d 38.41±6.79a C2 30.37±2.37b 12.35±1.45c 15.01±2.24c 12.93±0.87c 53.42±4.61a C3 30.37±2.37b 20.61±3.51c 13.91±1.31d 10.50±1.37d 53.59±4.20a C4 30.37±2.37b 35.08±2.89b 13.24±1.54c 12.31±1.33c 43.74±6.78a
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表 4 氨氮胁迫对奥尼罗非鱼肝脏过氧化氢酶活力的影响
Table 4 Effect of ammonia-N stress on CAT activity in liver of tilapia (O.niloticus×O.areus)
U·mg-1 组别group 时间/h time 0 12 24 48 72 C0 3.42±0.31 3.25±0.28 3.04±0.49 3.13±0.33 3.38±0.29 C1 3.42±0.31a 3.68±0.45a 2.67±0.32b 2.16±0.17b 2.55±0.07b C2 3.42±0.31a 2.85±0.27b 2.72±0.19b 2.16±0.20c 2.22±0.12c C3 3.42±0.31b 4.45±0.38a 2.37±0.23c 2.17±0.04c 2.04±0.17c C4 3.42±0.31b 4.30±0.54a 2.43±0.25c 1.87±0.14c 2.07±0.13c
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表 5 氨氮胁迫对奥尼罗非鱼肝脏谷胱甘肽-过氧化物酶活力的影响
Table 5 Effect of ammonia-N stress on GSH-Px activity in liver of tilapia (O.niloticus×O.areus)
U·mg-1 组别group 时间/h time 0 12 24 48 72 C0 4.21±0.81 4.10±0.62 4.56±0.57 3.98±0.49 4.31±0.56 C1 4.21±0.81b 4.77±0.29b 6.68±0.43a 6.73±0.63a 7.81±0.81a C2 4.21±0.81b 4.08±0.46b 4.96±0.60b 5.65±1.37ab 7.27±1.20a C3 4.21±0.81c 4.38±0.48bc 5.65±0.80b 5.38±0.93bc 8.62±0.55a C4 4.21±0.81bc 4.79±0.58ab 5.37±0.46a 4.19±0.29bc 3.50±0.27c
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