Optimation of two-dimensional electrophoresis (2-DE) technique in low abundance hemolymph proteome of Penaeus monodon
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摘要:
文章探索并优化了斑节对虾(Penaeus monodon)血淋巴双向电泳技术体系，对斑节对虾血淋巴总蛋白抽提方法进行优化，减小高丰度蛋白的影响；对双向电泳过程各步骤，如IPG胶条pH范围的选择、等电聚焦程序、上样量等进行了优化，得到高分辨率的2-DE图谱，用PDQuest软件进行了初步分析。结果表明，用PEG 6000能更快捷有效地去除血淋巴中的高丰度蛋白，增加低丰度蛋白的点数及浓度；在抽提蛋白过程中，利用预冷的80%丙酮洗涤，在一向电泳过程中设置100 V低压除盐，能更有效地去除蛋白中的盐分；采用18 cm、pH 3~10 NL的中型胶条，能更好地显示低丰度蛋白点的分布；被动水化上样300 μg结合硝酸银染色方法，能有效提高双向电泳图谱中蛋白点的分离度和分辨率。该试验为斑节对虾及其他甲壳动物血淋巴蛋白质组学相关研究提供了稳定可重复的研究方法。
Abstract:We optimized the two-dimensional electmphoresis technique for analyzing hemolymph in Penaeus monodon. To obtain high resolution 2-DE patterns, we examined the protein extraction, IPG-strip length, separation scope of IPG strip, sample loading amount and focusing condition by PDQuest software. Results indicate that PEG 6000 removed high abundance protein in haemolymph faster and more effectively, and increased the concentration of low abundance protein. The protein preparation with 80% TCA-acetone extraction treatment in isoelectric focusing was effective. The optimum 2-DE patterns in the proteins of Penaeus monodon were successfully separated by using pH 3~10 NL IPG strips with 18 cm length and 300 μg protein sample. The study provides stable and replicable method for relevant studies on hemolymph proteame of P.monodon and other similar crustaceans.
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Keywords:
- Penaeus monodon /
- haemolymph /
- low abundance protein /
- proteomics
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鱼类线粒体DNA(mtDNA)具有结构简单、进化速率快、群体内变异大、严格母系遗传等特点，已成为种内、种间近缘群体间遗传分化关系研究的理想材料[1]。线粒体DNA中D-loop区(或称控制区)是线粒体上一段非编码区，受进化压力小、进化速率快、遗传变异程度高，是探讨近缘种间和种内或个体间遗传变异的良好指标[2-3]。目前，基于对线粒体DNA D-loop区序列多态性的研究和D-loop区结构的研究报道较多[4-8]。
泥鳅(Misgurnus anguillicaudatus)隶属于鲤形目、鳅科、花鳅亚科、泥鳅属，已成为具有一定经济价值的养殖对象，养殖规模越来越大，泥鳅种质的选择成为一项工作内容。目前已有应用同工酶、RAPD及SSR等技术分析泥鳅的种群遗传结构的报道[9-12]，而基于mtDNA D-loop序列多态性的研究未见报道。该研究测定了怀远、范县、舒城和池州4个泥鳅地理群体的mtDNA控制区基因片段的核苷酸序列，分析了控制区结构及群体遗传多样性，探讨了泥鳅种群的遗传结构、遗传多样性，以期为今后泥鳅遗传选育工作提供参考。
1. 材料与方法
1.1 样本采集
研究所用泥鳅样本于2010年4月采自安徽怀远(简写为HY，下同)、安徽舒城(SC)、河南范县(FX)和安徽池州(CZ)4个地方，均为野生群体。分别随机采集活体解剖，取肌肉1~2 g于95%酒精中浸泡，在-20 ℃保存备用。分析所用样本信息见表 1。
表 1 泥鳅样本数量、体长与体质量Table 1. Number, length and weight of M.anguillicaudatus群体population 数量/尾number 体长/cm length 体质量/g weight 怀远Huaiyuan(HY) 9 12.56±2.14 15.43±5.43 范县Fanxian(FX) 9 11.78±1.34 13.98±5.31 舒城Shucheng(SC) 9 11.63±1.52 14.45±4.36 池州Chizhou(CZ) 9 12.63±3.26 16.86±6.29 1.2 基因组DNA提取
基因组DNA的提取采用常规酚-氯仿[13]抽提法提取。
1.3 PCR扩增和测序
拟扩增D-loop基因全序列，PCR扩增所用引物序列为DL1(5′-ACCCCTGGCTCCCAAAGC-3′)和DL2(5′-ATCTTAGCATCTTCAGTG-3′)[14]分别位于脯氨酸和苯丙氨酸的tRNA上。PCR采用100 ng的DNA为模板，反应体系为50 μL，其中预混料(premix) 25 μL，灭菌双蒸水18 μL，上、下游引物各2 μL(10 μm·L-1)，DNA模板3 μL。扩增条件为94 ℃，预变性5 min，接着35个循环(94 ℃ 45 s，51 ℃ 45 s，72 ℃ 60 s)，最后72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。扩增产物经1.5% TAE琼脂糖凝胶电泳分离，EB染色，凝胶成像系统拍照。PCR产物直接由上海生工生物技术公司回收、纯化、双向测序，测序引物与PCR扩增引物相同。
1.4 数据处理与分析
测得的DNA序列用ClustalX 1.81对序列进行比对，并通过Seaview 4软件进行编辑并辅以人工核查；对比GenBank中登录号为EU 697122的泥鳅线粒体DNA全序列，找到控制区的起点和终点。并以CSB-F和CSB1的起点分别作为终止序列区、中央保守区和保守序列区的分界线。在识别的保守序列中，兼并密码子的代号分别为W=A或T，R=A或G，M=A或C，Y=C或T和K=G或T。
用DnaSP 5.1软件计算多肽位点数(s)、单倍型数(n)、单倍型多样性指数(h)、核苷酸多样性指数(π)等；用Mega 4.1软件统计DNA序列的碱基组成，用Kimura双参数遗传距离(Kimura 2-parameter distance，K2-P)模型计算4个群体内和群体间的平均遗传距离，采用K2-P距离矩阵，用邻接法(NJ)构建分子系统树，系统树中节点的自举置信水平应用自引导法(bootstrap analysis，BP)重复检测，设置为1 000次重复；用DnaSP软件计算遗传分化指数(F-statistics，Fst)和基因交流值(Nm)，利用Arlequin 3.1软件根据群体间的Fst进行方差分析(AMOVA)。
2. 结果与分析
2.1 线粒体DNA控制区序列与变异情况
对36尾泥鳅线粒体控制区进行双向测序，通过人工拼接和序列比对分析，获得的序列与泥鳅(Genbank登录号EU 697122)的线粒体D-loop区序列在NCBI中比对后，结果表明主体部分相似度高达98%，证实所获得的序列即为泥鳅线粒体D-loop区段序列。
去除引物和部分端序列得到的36尾泥鳅线粒体DNA控制区序列(918~920 bp)，共检测到32种单倍型，每个群体都有各自的单倍型，变异位点63个(包括7个插入/缺失位点和56个多态性位点)，多肽位点中包含30个简约信息位点和26个单碱基突变位点。2碱基单一信息位点22个，占所有位点的2.40%；2碱基简约信息位点28个，占所有位点的3.05%；3碱基单一信息位点3个，占所有位点的0.33%；3碱基简约信息位点3个，占所有位点的0.33%。所有多肽信息位点中转换32个，颠换19个，转换与颠换同时存在的位点5个。平均转颠换比(Ts/Tv)为1.68，转换大于颠换，这个结果与其他一些脊椎动物的数值相类似[15]。控制区序列中碱基A、T、G和C平均含量分别为34.1%、31.7%、14.3%和19.9%。A+T含量(65.8%)明显高于G+C含量(34.2%)，碱基组成具有明显的偏倚性，这与其他鱼类的线粒体控制区碱基组成情况类似[16]。4个群体内平均K2-P为0.004~0.012，群体间的遗传距离为0.011~0.016(表 2)。此结果表明，4个群体间的平均遗传距离略高于群体内。
表 2 4个泥鳅群体内(对角线)与群体间的平均K2-P遗传距离Table 2. Average genetic distance within (diagonal) and among 4 M.anguillicaudatus populations based on Kimura 2-parameter model群体population HY FX SC CZ 怀远Huaiyuan(HY) 0.008 范县Fanxian(FX) 0.011 0.006 舒城Shucheng(SC) 0.011 0.014 0.004 池州Chizhou(CZ) 0.016 0.014 0.015 0.012 2.2 D-loop结构分析
参考刘焕章[17]在亚科识别出的各功能单位和给出的保守序列的普遍形式和不同区域的划分标志，笔者识别了泥鳅D-loop区的3个区域和其中的一些保守序列。
2.2.1 终止序列区(extended termination associated sequences, ETAS)
终止序列区是控制区中变异最大的区域，包含了与DNA复制终止相关的序列(termination associated sequences，TAS)。不同的物种中TAS的变异较大，但其主体的核心序列是TACAT和其反向互补序列ATGTA。该研究成功识别了泥鳅的终止序列区，全长236 bp(nt：1~236)，序列为TACATATTATGCATAATWWTACATT。
2.2.2 中央保守区(cental domain, CD)
中央保守区被认为是控制区中最为保守的区域。该研究在泥鳅中识别出了几个序列，近5′端识别了被认为是区分终止区和中央保守区标志的CSB-F，全长325 bp(nt：237~561)，其序列是ATGTAGTAAGAAACCACCACCAACCAGT。紧接其后的是CSB-E和CSB-D，序列分别为TCAGGGACAATAATTGT-GGGGGT和TATTACTGGCATYTGGTTCCTATTTCA- GG。
2.2.3 保守序列区(conserved sequence block, CSB)
保守区包含有重链的复制起始点、重链和轻链的启动子及3个保守序列CSB1、CSB2和CSB3。保守序列区全长358 bp(nt：562~918)，其中CSB1是区分保守序列区和中央保守区的标志，变异最大且不易被识别，该研究通过一保守片段GACATA帮助识别了泥鳅的CSB1，其序列为GAWTGAATGWTGGAAAGACATAAT。CSB2和CSB3序列较为保守，容易被识别，其序列分别为CAA-ACCCCCCTACCCCC和CCTTGTCAAACCCCGAAACCAA。
2.3 群体遗传多样性和遗传分化
4个群体间遗传多样性差异不显著，所有36个序列的单倍型多样性(Hd)和核苷酸多样性(Pi)分别为0.992和0.012，平均核苷酸差异数(K)为10.698(表 3)。从核苷酸多样性看，池州群体最高(0.012)，说明4个群体中，池州群体的遗传多样性最丰富。
表 3 4个泥鳅群体内遗传多样性参数Table 3. arameters of genetic diversity within 4 M.anguillicaudatus populations群体population 样本数number of samples 单倍型数number of haplotypes 单倍型多样性haplotype diversity (Hd) 多态位点数polymorphic loci (s) 平均核苷酸差异数average number of pairwise difference (K) 核苷酸多样性nucleotide diversity (Pi) 怀远Huaiyuan(HY) 9 8 0.972 23 8.028 0.009 范县Fanxian(FX) 9 8 0.972 22 6.611 0.007 舒城Shucheng(SC) 9 7 0.917 14 3.278 0.004 池州Chizhou(CZ) 9 9 1.000 37 11.306 0.012 合计total 36 32 0.992 56 10.698 0.012 利用DNASP软件估算4个群体间的Fst和Nm(表 4)。结果显示，4个群体间的Fst大，Nm较小，群体分化明显。舒城和范县群体间有最高的Fst(0.663)和最低的Nm(0.130)，怀远和范县群体间有最低的Fst(0.338)和最高的Nm(0.490)。分子变异分析(AMOVA)的结果见表 5。群体内个体间的变异是变异的主要来源(61.02%)，38.98%的变异发生在群体间(Fst=0.389 8)，群体间具有较高的遗传分化，遗传变异主要来自群体内部。
表 4 4个泥鳅群体间的遗传分化指数Fst(对角线下方)和基因交流值Nm(对角线上方)Table 4. Genetic differentiation Fst value (below diagonal) and gene flow Nm value (above diagonal) among 4 M.anguillicaudatus populations群体population HY FX SC CZ 怀远Huaiyuan(HY) 0.490 0.274 0.468 范县Fanxian(FX) 0.338 0.127 0.470 舒城Shucheng(SC) 0.477 0.663 0.238 池州Chizhou(CZ) 0.348 0.347 0.512 表 5 4个泥鳅群体的AMOVA分析Table 5. AMOVA analysis of 4 M.anguillicaudatus populations变异来源source of variation 自由度df 方差总和sum of squares 变异组分variance components 变异百分比/% percentage of variation 群体间among populations 3 97.809 3.137 38.980 群体内个体间within populations 32 157.110 4.910 61.020 总计total 35 254.917 8.046 - 2.4 个体间亲缘关系聚类分析
以32尾泥鳅个体的D-loop序列构建NJ分子进化树见图 1。系统发育树显示4个群体可以分为2个谱系(lineage)和多个支系。这2个谱系的单系支持率均未超过50%，表明泥鳅线粒体控制区的变异水平不大，群体之间并未发生显著的遗传分化。范县群体独自为一个谱系，其余3个群体为一谱系且相互交叉。
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图 1 基于线粒体控制区序列变异构建的4个泥鳅群体邻接树节点处数值为1 000次bootstrap检验的支持率Figure 1. Neighbor-joining tree based on sequence variation of mtDNA control region of 4 M.anguillicaudatus populations Numbers at the nodes indicate bootstrap values with 1 000 replicate3. 讨论
3.1 泥鳅线粒体控制区结构组成特点
线粒体DNA控制区为非编码区，因此会有缺失、插入、串联重复等变化。研究得到泥鳅线粒体DNA控制区长度为918~920 bp，同其他鱼类基本相似，并没有大的缺失、插入、串联重复等现象。
线粒体DNA控制区其主要功能与线粒体DNA的复制、终止、转录相关。通过比对其他鱼类笔者成功识别了泥鳅线粒体DNA控制区上的主要的功能单元，如终止序列区和保守相关序列，其中变异最大的终止序列区富含A和T，A+T的含量高达73.6%。而中央保守区富含GC，含量(39.5%)较终止区(26.5%)高，这种现象可能是中央保守区最为保守的原因之一。
D-loop区又称控制区，是mtDNA的复制起点，也是变化最复杂、最快的区域，近年来成为mtDNA研究的热点。控制区分为终止序列区、中央保守区和保守序列区3个部分[18-19]。哺乳动物的D-loop区B、C、D、E和F保守序列已被识别，从LEE等[20]在鱼类中识别了CSB-D后，LIU等[14]、张燕等[21]和唐琼英等[22]又分别在鲤形目、鲿科鱼类和沙鳅亚科鱼类中识别了CSB-D、CSB-E和CSB-F 3个保守序列。在泥鳅的控制区中含有ETAS、CSB-D、CSB-E、CSB-F、CSB-1、CSB-2和CSB-3，其中CSB-F和CSB-1的起点分别是区分终止序列区和中央保守区、中央保守区和保守序列区的标志。在容易发生变异的终止序列区，发现泥鳅的终止序列区长度为236 bp，包含了6个保守的TAS(TACAT)和4个与TAS互补序列(ATGTA)，推测两者可形成发卡结构[18]。CSB-1是与线粒体DNA复制相关的重要保守序列，在哺乳动物中高度保守[23-25]，其一般形式为ATT-AATTAATG-T-GCAGGACATA。但在鱼类中变异很大，其中GACATA序列框最为保守，可以帮助识别。如(Rhodeus sinensis)[17]、大口胭脂鱼(Ictiobus cyprinellus)[26]、沙鳅亚科鱼类(Botiinae)[22]的CSB-1序列分别为TT-ATTATTGAA-GACATA、AATCGCCCAGGACATT和AGRTKAATGMTWRAAWGACATA-MCC-AYAAGA。同样在泥鳅中也发现此保守序列框。另外，泥鳅的CSB-2和CSB-3序列非常保守，同其他鱼类基本一致。
3.2 泥鳅的遗传多样性
遗传多样性是物种长期生存和进化的前提，也是物种进化潜能的保证。研究测定36尾泥鳅D-loop区的918~920 bp序列，共检测出变异位点数63个，单倍型32种，单倍型多样性和核苷酸多样性分别为0.992和0.012。高于青海湖裸鲤(Gymnocypris przewalskii)(π=0.006 7+0.001 56)[27]、长薄鳅(Leptobotia elongata)(0.004 50)[28]、浪白鱼(Anabarilius grahami)(0.004 34)[29]、小口白甲鱼(Onychostoma lini)(0.005 75)[30]、长江铜鱼(Coreius heterodon)(0.002 18)[7]等种群，稍低于齐口裂腹鱼(Schizothorax prenanti)(0.019)[31]，说明目前这4个泥鳅种群D-loop序列存在丰富的多样性。4个群体中池州群体隶属于长江支流，其π最高(0.012)，种群遗传多样性较其他几个种群丰富。种群遗传距离的大小，能够间接反映种群遗传相似度大小，池州群体K2-P遗传距离最大(0.012)，池州群体个体间存在较大的遗传差异，表明池州群体具有较丰富的遗传多样性，进一步说明长江池州江段的泥鳅多样性较丰富。由此可以考虑把此江段的泥鳅引到怀远地区，作为后备良种。从控制区的变异看，4个群体间的K2-P遗传距离为0.011~0.016，高于群体内(平均为0.007)。分子变异分析(AMOVA)结果也显示，大部分变异分布在种群内(61.02%)，存在于种群间变异较少(38.98%)。说明群体间遗传分化大，基因交流较为匮乏。彼此都有各自的独立基因库，可能是长期地理隔离的结果。
3.3 泥鳅的遗传分化分析
Fst表示2个种群间的遗传分化程度。数值在0到1的范围内，Fst越大，表明2个种群的分化程度越高。而Nm则表示种群间的基因交流程度。Nm > 1表明2个种群间有基因交流。Nm < 1则可能预示着隔离的产生。4个群体具有较小的Nm(0.127~0.490)，几乎没有基因交流，有明显的遗传分化(表 4)。
以NJ构建的系统发育树显示，4个群体泥鳅相互交叉聚为2个谱系和多个支系，其中范县群体独自构成一谱系，其余3个群体构成另一谱系且群体间相互交叉。怀远和舒城个体在同一谱系，遗传距离相对较近，原因可能是淮河(怀远群体)和淮河之流的淠河(舒城群体)存在着微弱的基因交流。范县群体独成1支，与其他3个群体距离较远，可能是黄河(范县群体)与长江、淮河地理位置原因，导致地理隔离，形成独立的基因库。CZ6、CZ7与怀远群体和舒城群体存在交叉，可能因为长江池州江段部分支系与淮河支系水体是流通的。
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图 1 9%、12%和15%组在SDS-PAGE中的分离效果
Figure 1. 9%, 12% and 15% PEG 6000 in protein extraction by SDS-PAGE map
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图 2 不同体积分数丙酮洗涤蛋白分离效果
a. 方案1；b. 方案2
Figure 2. Different TAC concentrations in protein extraction by 2-DE maps
a. Program 1;b. Program 2
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图 3 等电聚焦不同程序对蛋白分离效果的影响
a. 程序Ⅰ；b. 程序Ⅱ
Figure 3. Different IPG programs in protein extraction by 2-DE maps
a. ProcedureⅠ; b. ProcedureⅡ
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图 4 不同IPG胶条对蛋白分离效果的影响
a. 7 cm pH 3~10；b. 7 cm pH 3~10 NL
Figure 4. Different IPG strips in protein extraction by 2-DE maps
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图 5 不同长度范围IPG胶条对蛋白分离效果的影响
a. 7 cm pH 3~10 NL；b. 18 cm pH 3~10 NL
Figure 5. Different IPG lengths in protein extraction by 2-DE maps
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图 6 不同上样量对蛋白分离效果的影响
a. 18 cm pH 3~10，上样量150 μg；b. 18 cm pH 3~10，上样量300 μg；c. 18 cm pH 3~10，上样量450 μg
Figure 6. Different sample loadings in protein extraction by 2-DE maps
a. 18 cm pH 3~10, sample 150 μg; b. 18 cm pH 3~10, sample 300 μg; c. 18 cm pH 3~10, sample 450 μg
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图 7 不同PEG 6000质量分数的斑节对虾血淋巴蛋白质2-DE图谱和3D图像显示
a.9%；b.12%；c.15%；d. 9% PEG 6000；e. 12% PEG 6000；f. 15% PEG 6000
Figure 7. Different PEG 6000 concentrations of hemolymph proteome from P.monodon by 2-DE maps and 3D images
表 1 不同方案等电聚焦程序
Table 1 Immobiline DryStrip IEF program
升压方式
boost method程序一
Program Ⅰ程序二
Program Ⅱ程序三
Program Ⅲ线性升压 Stp — 100 V，3 h 100 V，3 h 线性升压 Stp 250 V，30 min 250 V，1 h 250 V，1 h 快速升压 Grd 1 000 V，30 min 1 000 V，1 h 1 000 V，1 h 快速升压 Grd 5 000 V，2 h 5 000 V，3 h 8 000 V，3 h 线性升压 Stp 5 000 V，50 000 Vh 5 000 V，50 000 Vh 8 000 V，64 000 Vh r 线性升压 Stp 500 V，保持 500 V，保持 500 V，保持 
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