双向电泳技术是由O′FARRELL′S于1975年首次建立，成功地分离约1 000个大肠杆菌(Escherichia coli)蛋白，并表明蛋白质谱不是稳定的，而是随环境而变化^[1]。蛋白质组学最早由WILKINS在1995年提出，用双向电泳和时间飞行质谱(MALDI-TOF)联用的方法对蛋白进行分离鉴定^[2]。差异蛋白质组学是由双向电泳技术发展而来，研究某种特定因素引起的样本本身或不同样本之间蛋白表达差异，鉴定筛选蛋白，并进一步研究编码该差异蛋白的基因，扩展对该基因功能的了解^[3]。在技术不断发展的过程中，双向凝胶电泳技术仍然是研究差异蛋白质组的的基础方法之一。目前，蛋白质组学在水产研究中的应用还较少，相关的技术手段仍处于摸索阶段^[4]。秦兆宇等^[5]初步建立了中国明对虾(Fenneropenaeus chinensis)肝胰腺蛋白双向电泳技术，极大拓宽了对虾的免疫生理研究途径。黄冰心等^[6]提取中国明对虾的血浆蛋白用SDS-PAGE进行分离，利用液相色谱-串联质谱系统进行质谱分析，鉴定了66个中国明对虾血浆蛋白质。YAO等^[7]则用双向凝胶电泳和质谱相结合的方法，研究中国明对虾注射海带多糖后血淋巴中AK(arginine kinase)蛋白的变化情况，并鉴定出中国明对虾AK蛋白分子量大小及等电点。WANG等^[8]也以血淋巴为样本研究了对虾白斑病毒感染的免疫应答。但目前国内外关于斑节对虾血淋巴的研究报道仍较少，在虾血淋巴研究方面，由于对虾等甲壳类动物血淋巴成分与哺乳动物有较大差异，其中高丰度蛋白中的血蓝蛋白为节肢动物和环节动物所特有。在双向电泳技术中，高丰度蛋白的存在易造成背景颜色深、蛋白点拖尾、遮盖低丰度蛋白点等问题，对虾血淋巴蛋白质组的研究造成阻碍。而普通的去除哺乳动物血浆中高丰度蛋白的相关试剂盒并不适用于甲壳动物血淋巴。如何更好地去除对虾血淋巴中的高丰度蛋白，研究低丰度蛋白点，优化血淋巴双向电泳图像，一直有待研究。

蛋白抽提和双向电泳技术(2-DE)是蛋白质组学研究的重要条件和关键技术。该研究通过去除斑节对虾(Penaeus monodo)血淋巴样品中高丰度蛋白，提取低丰度全蛋白，并对双向凝胶电泳部分环节进行优化，建立一种能有效显现斑节对虾血淋巴低丰度蛋白的双向凝胶电泳技术，为进一步研究探索斑节对虾血淋巴中低丰度蛋白的功能提供了有效的技术手段。

1.   材料与方法

1.1   试验材料与预处理

鲜活斑节对虾购于广州市海珠区新港西路，共10尾，平均体长(15.3±0.5)cm，在实验室水箱内加少量冰使水温降至12~14 ℃，充氧暂养数小时，使其处于休眠状态。用预先吸入0.5 mL抗凝剂(柠檬酸三钠19.3 mmol · L^-1，氯化钠239.8 mmol · L^-1，葡萄糖182.5 mmol · L^-1，EDTA-Na₂ 6.2 mmol · L^-1)的注射器分别从健康对虾第一腹节基部抽取血淋巴0.5 mL，混匀后4 ℃下800 g离心20 min，取血浆分装后于-80 ℃保存备用。

1.2   试剂与仪器

IPG干胶条(pH 3~10 NL/pH 3~10，7 cm/18 cm)、IPG Buffer(3~10 NL/3~10)、二硫苏糖醇(DTT)、硫脲(thiourea)和碘乙酰胺购于美国GE公司；CHAPS、十二烷基硫酸钠(SDS)和尿素(Urea)购于Sigma公司；30%丙烯酰胺混合液、四甲基乙二胺(TEMED)购于美国Bio-Rad公司；其他试剂均为国产分析纯。所有溶液均用Milli-Q水配制。等电聚焦电泳仪(Ettan IPGphor III)、垂直板电泳仪(Ettan DALTsix)和高分辨扫描仪(ImageScanner III，美国GE公司出品)；台式冷冻高速离心机(美国Hitachi公司出品)；超低温冰箱(Haier公司出品)。

1.3   样品高丰度蛋白的去除

分别向分装为1 mL · 试管^-1的血淋巴中加入9%、12%和15% PEG 6000，震荡混匀至完全溶解，冰上静置30 min；10 000 g，4 ℃离心10 min，取上清液。用TCA/丙酮法抽提得到干燥淡白粉末，-80 ℃保存。

1.4   样品的制备与定量

以1.3血淋巴上清液为材料，每管加1 mL上清液，3倍体积预冷TCA/丙酮(含0.7% β-巯基乙醇)，震荡混匀，-20 ℃悬重沉淀3 h以上，15 000 g，4 ℃离心1 h，弃上清。将上述样品分为2组，分别用2 mL预冷纯丙酮和预冷80%丙酮(含0.7% β-巯基乙醇)洗涤沉淀，-20 ℃悬重沉淀1 h；15 000 g，4 ℃，离心1 h，弃上清。重复洗涤步骤2~3次，15 000 g，4 ℃再次离心1 min，用10 μL枪头吸去残留液体，将沉淀放在通风橱中5~10 min，得干燥沉淀-80 ℃保存，或用裂解液(尿素7 mol · L^-1、硫脲2 mol · L^-1、CHAPS 2%、溴酚蓝0.001%、DTT 65 mmol · L^-1、IPG Buffer 3~10/3~10NL 5 μL · mL^-1)溶解后进行后续试验。所有步骤在冰上操作。采用GE公司2D Quant蛋白定量试剂盒测定蛋白溶液质量浓度。

1.5   SDS-PAGE电泳

用裂解液分别裂解9%、12%和15%的样品后，用2D Quant蛋白定量试剂盒测定每份蛋白溶液质量浓度，按每孔40 μg计算上样量。以5%的浓缩胶和12%分离胶进行SDS-PAGE电泳。

1.6   双向电泳

用裂解液裂解蛋白冻粉并定量，根据浓度进行上样，选择被动水化。将胶条至于上样盘中，盖好密封盖，室温过夜(大于12 h)。

参照IPGphor III等电聚焦系统使用指南进行第一向等电聚焦，具体见表 1。

表  1  不同方案等电聚焦程序

Table  1.  Immobiline DryStrip IEF program

升压方式 boost method	程序一 Program Ⅰ	程序二 Program Ⅱ	程序三 Program Ⅲ
线性升压 Stp	—	100 V，3 h	100 V，3 h
线性升压 Stp	250 V，30 min	250 V，1 h	250 V，1 h
快速升压 Grd	1 000 V，30 min	1 000 V，1 h	1 000 V，1 h
快速升压 Grd	5 000 V，2 h	5 000 V，3 h	8 000 V，3 h
线性升压 Stp	5 000 V，50 000 Vh	5 000 V，50 000 Vh	8 000 V，64 000 Vh r
线性升压 Stp	500 V，保持	500 V，保持	500 V，保持

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等电聚焦完毕后对胶条进行2步平衡，平衡液使用量参照GE公司双向电泳简易操作指南。7 cm胶条使用平衡液2.5~5 mL · 条^-1，18 cm胶条使用平衡液10 mL · 条^-1。将胶条置于含有1% DTT平衡缓冲液的水化槽中，于摇床平衡15 min；取出胶条后放入含有2.5%碘乙酰胺平衡缓冲液的水化槽中，再平衡15 min。

二向SDS-PAGE电泳采用12% SDS-PAGE混合溶液。将2步平衡后的IPG胶条移至凝胶上方，用0.5%的低熔点琼脂糖封胶。上下槽分别加入电泳缓冲液。起始电流为10 mA/gel，1 h后加大电流至38 mA/gel，直至溴酚蓝到凝胶边缘。

1.7   染色

1) 固定(10%冰乙酸+40%乙醇)，15 min，2次；2)敏化(30%乙醇+6.8%乙酸钠+0.2%硫代硫酸钠)，30 min；3)水洗5 min，3次；4)0.25%硝酸银银染，30 min；5)水洗1 min，2次；6)显色(2%碳酸钠+0.8 mL · L^-1甲醛溶液)，5 min，3次；7)终止(11.6 g · L^-1 EDTA)，10 min；8)水洗5 min，3次。

1.8   凝胶图像扫描与图谱分析

采用高分辨扫描仪对银染凝胶进行灰度扫描，扫描方式为透射，图谱保存为tif格式。采用PDQuest 8.0二维电泳图片分析软件对图谱进行分析。

2.   结果

2.1   不同PEG 6000浓度组去高丰度蛋白效果比较

样品定量后，每孔上样量为10 μL，SDS-PAGE见图 1。9%、12%和15%组中高丰度蛋白质量浓度较空白组都有所降低，且高丰度蛋白质量浓度依次降低。

图  1  9%、12%和15%组在SDS-PAGE中的分离效果

Figure  1.  9%, 12% and 15% PEG 6000 in protein extraction by SDS-PAGE map

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2.2   80%预冷丙酮处理样品对电泳图的影响

分别用方案1(纯预冷丙酮)和方案2(80%预冷丙酮)洗涤蛋白沉淀后，用程序Ⅰ进行第一向等电聚焦。通过双向凝胶电泳图显示，用方案1得到的电泳图(图 2-a)，横纹明显少于方案2得到的电泳图(图 2-b)。

图  2  不同体积分数丙酮洗涤蛋白分离效果

a. 方案1；b. 方案2

Figure  2.  Different TAC concentrations in protein extraction by 2-DE maps

a. Program 1;b. Program 2

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2.3   不同一向程序的电泳图谱

用15% PEG 6000样品上样7 cm pH 3~10 IPG胶条，上样量为100 μg。首先用GE推荐程序，即程序Ⅰ进行一向等电聚焦，聚焦情况不理想，不同蛋白分离情况较差，蛋白点横向拖尾现象较为严重(图 3-a)。用改进程序Ⅱ进行一向等电聚焦，与程序Ⅰ结果相比，聚焦情况明显改善，蛋白点图清晰(图 3-b)。

图  3  等电聚焦不同程序对蛋白分离效果的影响

a. 程序Ⅰ；b. 程序Ⅱ

Figure  3.  Different IPG programs in protein extraction by 2-DE maps

a. ProcedureⅠ; b. ProcedureⅡ

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2.4   不同pH范围的电泳图谱

首先对pH 3~10的IPG胶条用程序Ⅱ进行双向电泳，可以看出蛋白点堆积，尤其在pH 5~8部分分离效果不佳，且存在拖尾现象(图 4-a)。改用pH 3~10 NL的IPG胶条进行比对试验。在pH 5~8部分背景清晰度改善，蛋白点分辨度提高(图 4-b)。

图  4  不同IPG胶条对蛋白分离效果的影响

a. 7 cm pH 3~10；b. 7 cm pH 3~10 NL

Figure  4.  Different IPG strips in protein extraction by 2-DE maps

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2.5   不同长度范围IPG胶条的电泳图谱

先采用7 cm的IPG胶条进行双向电泳(图 5-a)，得到的电泳图点较为密集，对蛋白点切胶造成一定影响，低分度蛋白很难被分辨。之后采用18 cm的IPG胶条进行双向电泳(图 5-b)，蛋白点间距加大，点图清晰。

图  5  不同长度范围IPG胶条对蛋白分离效果的影响

a. 7 cm pH 3~10 NL；b. 18 cm pH 3~10 NL

Figure  5.  Different IPG lengths in protein extraction by 2-DE maps

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2.6   不同上样量双向电泳结果的比较

用18 cm pH 3~10 NL的IPG胶条，分别上样150 μg、300 μg和450 μg，得出的双向电泳图进行比较(图 6-a、b、c)。上样量为150 μg时蛋白点极少，300 μg和450 μg电泳图差别不大，因此，上样量可选择300 μg。

图  6  不同上样量对蛋白分离效果的影响

a. 18 cm pH 3~10，上样量150 μg；b. 18 cm pH 3~10，上样量300 μg；c. 18 cm pH 3~10，上样量450 μg

Figure  6.  Different sample loadings in protein extraction by 2-DE maps

a. 18 cm pH 3~10, sample 150 μg; b. 18 cm pH 3~10, sample 300 μg; c. 18 cm pH 3~10, sample 450 μg

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2.7   不同PEG 6000浓度组去高丰度蛋白的双向电泳图比较

综合上述优化方法，用80%丙酮洗涤蛋白样品，对18 cm pH 3~10 NL的IPG胶条上样300 μg，并在一向等电聚焦过程中3 h 100 V低压除盐程序，对PEG 6000 9%、12%和15%组血淋巴蛋白样品进一步进行双向电泳检测。通过PDQuest软件扫描，9% PEG 6000组有蛋白点687个，12% PEG 6000组有蛋白点626个，15% PEG 6000组有蛋白点429个。进一步对图 7-a、b、c中方框内蛋白点进行3D扫描，图像显示见图 7-d、e、f，低丰度蛋白质量浓度依次升高。

图  7  不同PEG 6000质量分数的斑节对虾血淋巴蛋白质2-DE图谱和3D图像显示

a.9%；b.12%；c.15%；d. 9% PEG 6000；e. 12% PEG 6000；f. 15% PEG 6000

Figure  7.  Different PEG 6000 concentrations of hemolymph proteome from P.monodon by 2-DE maps and 3D images

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3.   讨论

3.1   优化程序对蛋白样品除盐效果的影响

蛋白样品的制备是能否得到清晰的双向电泳图谱的关键步骤^[9]。斑节对虾血淋巴中含有微量无机盐成分^[10]，影响一向电泳的等电聚焦过程。试验基于ANDERSON^[11]、YASMIN和SHARMA^[12]的操作方法，用80%的预冷丙酮代替纯预冷丙酮对蛋白沉淀进行洗涤，能有效降低样品中的盐分，减少电泳图谱中的横条纹。由于极性强的有机溶剂丙酮能破坏蛋白质的水化层而使蛋白质沉淀^[13]，同时20%的水能有效溶解蛋白沉淀中的盐离子而不至于使蛋白溶解。样品盐分的去除有利于一向IEF聚焦，避免由于聚焦失败导致的蛋白点无法分离。根据双向电泳一向等电聚焦原理，增加100 V低压线性除盐，根据盐离子和蛋白的带电情况，在低压条件下首先去除带少量电荷的盐离子而对蛋白无明显影响。且除盐后的IPG胶条通过电流小，温度低，能保证高压过程聚焦的顺利进行。同时，上述2种除盐方法具有稳定性强、易操作、成本低廉等优势。一向等电聚焦(IEF)过程中对蛋白样品进行有效分离，以保证二向中识别更多的蛋白点。

3.2   不同pH范围电泳图谱的效果比较

合适的pH范围能有效地分离蛋白质^[14]，清晰的点图能为后续试验提供基本保障。试验首先用pH为3~10的IPG胶条分析了斑节对虾血淋巴中低丰度蛋白的分布情况，从2-DE图谱中可以看出对虾肌肉蛋白质等电点主要集中在pH 4~8部分。刘志远等^[15]尝试用pH 4~7和pH 5~8的IPG胶条进行了对比试验，其中pH 4~7的胶条得到的图谱效果更佳，但无法避免部分低丰度蛋白被掩盖。SOMBOONWIWAT等^[16]也在用2-DE研究哈氏弧菌(Vibrio harveyi)感染斑节对虾的试验中，同时对pH 3~10和pH 4~7的IPG胶条效果进行了比较，pH 4~7的图像更清晰，但与pH 3~10的图像相比存在漏点情况。MOLLOY等^[17]在早期试验中也证实了这种情况。笔者试验选用pH 3~10 NL的胶条，两端pH 3~5和pH 8~10部分被压缩，pH 5~8部分呈线性关系，整体呈非线性关系。利用pH 3~10 NL的IPG胶条能有效分离低丰度蛋白的同时，避免靠近酸性端和碱性端胶条两头的蛋白点的丢失，从而达到良好的分离效果。

3.3   不同长度范围IPG胶条的效果比较

试验首先选择长度为7 cm的IPG胶条进行分析，可以得到较为清晰的图谱。但由于受长度限制，蛋白点密集部分分辨度不够，且蛋白点过于密集对后续切胶的操作会造成一定影响，使不同蛋白点不能单独分离。在优化试验中，改用长度为18 cm的IPG胶条，蛋白分辨度显著提高，蛋白点点距加大，获得更为清晰的图谱。

3.4   不同上样量双向电泳结果的比较

合适的蛋白上样量直接决定了2-DE图谱的质量，上样量过大，有利于低丰度蛋白的检测，但过量部分会影响等电聚焦，使等电荷的蛋白无法较好地聚集而造成蛋白点水平拖尾，且银染染色时高丰度蛋白会掩盖其周围的一些蛋白点；上样量过小时，虽然可以得到较为清晰的图谱，但总蛋白点数会大大减少，且一些丰度相对低的蛋白不能被检测，可能会错过许多有研究价值的蛋白^[18]。GE手册中的推荐上样量为150 μg，但试验结果证明，按推荐上样量进行试验得到的图谱点数比预期偏少。武阳等^[19]也在华溪蟹(Sinopotamon sp.)主要组织蛋白质双向电泳技术体系的建立试验中证实了这一结果。上样量为150 μg时因上样量太少造成蛋白点极少；300 μg和450 μg电泳图谱结果相似，但上样量为450 μg时出现蛋白点水平拖尾现象，因此上样量选择300 μg。

3.5   不同PEG 6000浓度组去高丰度蛋白的双向电泳图比较

相同上样量条件下，9%、12%和15% PEG 6000组高丰度蛋白总量依次减少，其中15%组高丰度蛋白明显减少(图 1)。VIIKARI^[20]早先利用质量分数为12%的PEG 6000沉降人血浆中的高密度脂蛋白和低密度脂蛋白取得良好效果。王宝杰^[21]也在关于中国明对虾血淋巴蛋白质组学的初步研究中对固定化金属亲和层析法(IMAC)、PEG 6000沉淀法和超速离心法去除血淋巴中高丰度蛋白效果进行了比较，认为超速离心法和9% PEG 6000去除高丰度蛋白效果较好。该试验结果也验证了不同质量分数PEG 6000去除血淋巴高丰度蛋白的效果。综合上述优化步骤，9%、12%和15% PEG 6000组高丰度蛋白总量依次减少，低丰度蛋白点数及质量浓度相对增加(图 7)。但由于相同上样量情况下，15%组总蛋白点数明显低于其他2组，表明试验过程中也不适宜无限制提高PEG 6000质量分数来去除高丰度蛋白。笔者试验采用质量分数为15% PEG 6000来去除斑节对虾血淋巴中高丰度蛋白，优化双向电泳各步骤及试验条件，得到分辨率较高的2-DE图谱，为斑节对虾低丰度蛋白的研究提供了条件。

4.   结论

试验通过优化斑节对虾血淋巴双向电泳技术，得到一套经济快速的试验方法。用15% PEG 6000能更快捷有效地去除血淋巴中的高丰度蛋白，增加低丰度蛋白的点数及质量浓度；利用预冷的80%丙酮进行二次洗涤洗涤，一向电泳过程中设置100 V低压除盐，能更有效地去除蛋白样品中的盐分；采用18 cm，pH 3~10 NL的中型胶条，能更好地显示低丰度蛋白点的分布；被动水化上样300 μg结合硝酸银染色方法，能有效提高双向电泳图谱中蛋白点的分离度和分辨率。该试验对斑节对虾血淋巴双向电泳技术进行优化，减少了高丰度蛋白对试验的影响，提高了低丰度蛋白的点数及质量浓度。为斑节对虾及其他甲壳动物血淋巴蛋白质组学相关后续研究提供可重复和稳定的试验方法。