黄颡鱼(Pelteobagrus fulvidraco)是中国常见淡水经济养殖鱼类，鱼粉是其配合饲料的主要蛋白原料。随着鱼粉价格的不断攀升，为降低饲料成本，配方师大量使用植物蛋白源——豆粕、菜粕和棉粕等替代鱼粉。植物蛋白源存在一些抗营养因子，不能很好地被水产动物消化利用。目前，通过在配合饲料中添加酶制剂，成为提高水产动物对饲料营养成分消化吸收的有效途径之一^[1]。随着饲料行业的不断发展，饲用复合酶制剂的研制与应用越来越受到广泛关注。

复合酶制剂是由多种可以分解饲料营养分子链的生物活性物质组成，可最大限度地提高饲料营养成分的消化分解，解除饲料中多种抗营养因子，补充内源性消化酶分泌的不足，提高动物对营养成分的消化吸收，促进动物生长和提高饲料效率^[2]。目前研究较多的酶制剂有蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶、果胶酶、纤维素酶、木聚糖酶和植酸酶等^[3]。生产中饲用酶制剂一般以复合酶制剂为主，根据底物种类结合动物消化道内环境的不同来进行酶制剂的配比。在草鱼(Ctenopharyngodon idellus)^[4-5]、鲤(Cyprinus carpio)^[6]、彭泽鲫(Carassius auratus)^[7]、大口黑鲈(Largemouth bass)^[8]和尼罗罗非鱼(Oreochromis niloticus)^[9]等水产动物中已有部分研究报道。韩庆和夏维福^[10]报道饲料(配合料中蛋白源主要是鱼粉，用量高达40%)中添加溢多酶-898A (其主要成分为木聚糖酶、纤维素酶和蛋白酶等)可促进黄颡鱼的生长，降低饵料系数，提高养殖效益。尚未见其对黄颡鱼血清生化指标及免疫指标影响的报道。因此，笔者团队研制出一种以蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶和果胶酶为主的水产用复合酶制剂，探讨其在低鱼粉配合料中对黄颡鱼生长性能、血清生化和免疫指标的影响，以为其在水产饲料中的应用提供理论依据。

1.   材料与方法

1.1   试验饲料

以鱼粉、豆粕、菜粕、棉粕和大豆浓缩蛋白为蛋白源，玉米淀粉作为糖源，鱼油和豆油为脂肪源，配制基础饲料，并作为对照饲料(记为G0组)。在基础饲料中分别添加100 mg·kg^-1、200 mg·kg^-1和400 mg·kg^-1的复合酶制剂配成3种试验饲料，分别记为G100、G200和G400组。基础饲料配方及营养组成见表 1。所有饲料原料经粉碎后过40目筛混合，加入鱼油、豆油和水，混匀后用SLX-80型双螺杆挤压机制成直径为2.0 mm的颗粒饲料，55 ℃下烘干，自然冷却后放入密封袋中，置于-20 ℃冰箱中保存备用。

表  1  饲料配方及营养水平(风干基础)

Table  1.  Feed formula and nutritional level (air dry basis) %

原料 ingredient	质量分数 content	原料 ingredient	质量分数 content
鱼粉fish meal	5	多维vitamin premix1	0.3
豆粕 soybean meal	25	多矿 mineral premix2	0.5
菜粕  rapeseed meal	25	氯化胆碱(50%)  choline chloride	0.5
棉粕 cottonseed meal	25	赖氨酸lysine	0.7
大豆浓缩蛋白 soy protein concentrate	9	赖氨酸 lysine	0.7
玉米淀粉 corn starch	2	包膜VC  coated vitamin C	0.1
鱼油 fish oil	1.7	甜菜碱(98%) betaine	0.5
豆油 soybean oil	1.7	羧甲基纤维素钠  cm-cellulose-Na	2
		总计 total	100
营养水平 nutrient level
水分 moisture	7.0	粗脂肪  crude lipid	5.0
粗蛋白 crude protein	40.6	灰分 ash	7.5
注：1.由广州飞禧特水产科技有限公司提供。维生素预混料配方(g·kg-1预混料)：VA 320×104 IU；VD 160×104 IU；VE 16；VK 3；VB1 4；VB2 8；VB6 4.8；VB12 16 mg；烟酸28；泛酸钙16；叶酸1.28；生物素64 mg；肌醇40。2.由广州飞禧特水产科技有限公司提供。矿物质预混料配方(g·kg-1预混料)：钙230；钾36；镁9；铁10；锌8；锰1.9；铜1.5；钴250 mg；碘32 mg；硒50 mg Note：1.Provided by the Fishtech Fisheries Science & Technology Co.，Ltd..One kilogram of vitamin premix contains：VA 320×104 IU；VD 160×104 IU；VE 16 g；VK 4 g；VB1 4 g；VB2 8 g；VB6 4.8 g；VB12 16 mg；nicotinic acid 28 g；calcium pantothenate 16 g；folic acid 1.28 g；biotin 64 mg；inositol 40 g. 2.Provided by the Fishtech Fisheries Science & Technology Co.，Ltd..one kilogram of mineral premix contains：Ca 230 g；K 36 g；Mg 9 g；Fe 10 g；Zn 8 g；Mn 1.9 g；Co 250 mg；I 32 mg；Se 50 mg.

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1.2   试验鱼及饲养管理

黄颡鱼购自广东省清远市黄沙渔业基地，养殖试验在 广东省农业科学院畜牧研究所水产研究室的室内循环水养殖系统中进行。将购买的黄颡鱼在室内循环水养殖系统中驯养2周，期间投喂商品饲料(天邦黄颡鱼0号料)。试验开始时随机挑选健康、活泼、体质量约为(2.48±0.05)g的黄颡鱼450尾，随机分为4组，每组设3个重复，每个重复30尾鱼。每天投喂自配试验饲料2次，分别为9：00和16:30，投饲量为体质量的4%~6%。饲养周期为8周，每天记录投饲量、死亡情况、水温。光照为自然光源，全天24 h不间断曝气，水温为28~32 ℃，pH为7.3~8.0，ρ(溶解氧)＞5mg·L^-1，ρ(亚硝酸) < 0.01 mg·L^-1，ρ(氨氮) < 0.15 mg·L^-1。

1.3   样品采集与制备

饲养试验结束时，禁食12 h，称质量，统计成活率，计算增重率、特定生长率、摄食量和饲料系数。每个重复随机取5尾鱼，用1 mL无菌注射器于尾静脉取血，合并置于离心管中，静置3~4 h后，离心(4 ℃，5 000 r·min^-1，15 min)，分装血清于－80 ℃冰箱保存备用。另取5尾鱼用于全鱼体成分的测定。

1.4   指标测定与方法

1.4.1   常规营养成分分析

饲料和全鱼水分质量分数采用105 ℃烘箱干燥法(GB/T 6435-1986)测定，粗蛋白质质量分数采用凯氏定氮法(GB/T 6432-1994)测定，粗脂肪质量分数采用乙醚抽提法(GB/T 6433-1994)测定，灰分质量分数采用550 ℃灼烧法(GB/T 6438-1992)测定。

1.4.2   血清生理生化指标的测定

血清总胆固醇(CHO)、甘油三酯(TG)、葡萄糖(GLU)和尿素浓度采用日立7600全自动生化分析仪检测(广州金域医学检验中心)。谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)、溶菌酶(LZM)、超氧化物歧化酶(SOD)活性和丙二醛(MDA)采用南京建成生物工程研究所的试剂盒进行测定，具体测定方法参照试剂盒说明书进行。组织蛋白质浓度(TP)按考马斯亮蓝法测定，以牛血清总蛋白作标准曲线。

2.   结果与分析

2.1   对黄颡鱼生长和饲料利用的影响

试验组黄颡鱼的增重率、特定生长率和摄食量随着复合酶制剂添加量的增加有升高的趋势(表 2)，其中G400组增重率和特定生长率分别比对照组显著提高了15.4%和7.5%(P < 0.05)，摄食量提高了20.3%(P < 0.05)。各组黄颡鱼的饲料系数与对照组比差异不显著(P>0.05)。

表  2  复合酶制剂对黄颡鱼生长性能和饲料利用的影响

Table  2.  Effects of complete enzyme preparation on growth performance and feed utlization of yellow catfish

指标 index	G0	G100	G200	G400
初始体质量/g  IBW	2.54±0.11	2.44±0.02	2.35±0.09	2.54±0.17
末终体质量/g  FBW	11.33±0.67b	11.44±0.38b	10.99±0.34b	12.69±0.57a
增重率/%  WGR	346.35±35.92b	368.82±11.09ab	367.85±24.93ab	399.85±22.10a
特定生长率/%· d-1  SGR	2.67±0.14b	2.76±0.04ab	2.75±0.10ab	2.87±0.08a
摄食量/g·尾-1  FI	26.31±2.34b	29.08±1.36ab	25.93±1.04b	31.65±1.92a
饲料系数  FCR	3.00±0.21	3.23±0.15	3.01±0.23	3.12±0.14
注: 同行数据不同小写字母表示差异显著(P < 0.05)，下表同此 Note：Different superscripts in the same row indicate significant difference(P＜0.05).The same case in the following tables.

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2.2   对黄颡鱼全鱼体成分的影响

饲料中添加复合酶制剂对黄颡鱼体组成粗蛋白、粗脂肪、水分和灰分质量分数无显著影响(P>0.05)(表 3)。

表  3  复合酶制剂对黄颡鱼全鱼体成分的影响(干质量)

Table  3.  Effects of complete enzyme preparation on body composition of yellow catfish (dry weight) %

指标 index	G0	G100	G200	G400
粗蛋白质 CP	53.53±2.68	55.02±0.59	52.07±1.55	54.54±1.49
粗脂肪 EE	23.26±3.27	24.52±1.85	24.80±0.78	23.13±1.25
灰分 ash	13.05±0.36	12.96±0.33	13.05±0.42	12.83±0.15
水分 moisture	75.95±0.93	75.45±0.63	74.96±0.33	76.32±0.47

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2.3   对黄颡鱼血清生化指标的影响

随着复合酶制剂水平的增加，黄颡鱼血清CHO、TG和GLU浓度升高，但组间差异不显著(P>0.05)。血清尿素浓度随复合酶制剂的添加逐渐降低，其中G100和G400组显著低于对照组。血清ALT和AST活力随复合酶制剂的添加有升高的趋势，其中ALT活力以G400组最高，显著高于对照组(P < 0.05)，AST活力以G200组最高，显著高于对照组和G100组(表 4)。

表  4  复合酶制剂对黄颡鱼血清生化指标的影响

Table  4.  Effects of complete enzyme preparation on serum biochemical indices of yellow catfish

指标 index	G0	G100	G200	G400
c(胆固醇)/mmol·L-1  CHO	2.74±0.11	2.74±0.06	2.81±0.11	2.80±0.08
c(甘油三酯)/mmol·L-1  TG	3.32±0.41	3.48±0.46	4.32±0.37	3.55±0.36
c(血糖)/mmol·L-1  GLU	7.77±0.16	8.55±1.26	9.45±1.01	9.40±1.12
c(尿素)/mmol·L-1  UREA	0.90±0.10a	0.61±0.18b	0.88±0.14a	0.43±0.06b
谷丙转氨酶/ U·L-1  ALT	6.96±0.95b	9.33±2.15ab	8.66±1.79ab	10.61±0.87a
谷草转氨酶/ U·L-1  AST	46.54±0.70b	44.94±2.13b	54.19±4.10a	48.93±3.24ab

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2.4   对黄颡鱼血清免疫指标的影响

各组黄颡鱼血清的TP质量浓度以G200组最高，显著高于对照组(P < 0.05)。血清LZM活力随复合酶制剂水平的增加先升后降，其中G100和G200组显著高于对照组和G400组(P < 0.05)。各组黄颡鱼血清SOD活力和MDA质量摩尔浓度均无显著性差异(P>0.05)(表 5)。

表  5  复合酶制剂对黄颡鱼血清免疫指标的影响

Table  5.  Effects of complete enzyme preparation on serum immune indices of yellow catfish

指标 index	G0	G100	G200	G400
ρ(总蛋白)/mg·mL-1  TP	23.53±1.08b	25.48±1.22ab	26.85±1.79a	25.70±1.56ab
溶菌酶/U·L-1  LZM	0.11±0.02b	0.17±0.01a	0.16±0.01a	0.12±0.01b
超氧化物歧化酶/U·mL-1  SOD	0.73±0.05	0.60±0.11	0.60±0.03	0.68±0.06
b(丙二醛)/nmol·mL-1  MDA	4.11±0.16	4.07±0.05	4.07±0.24	4.26±0.16

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3.   讨论

3.1   复合酶制剂对生长性能及饲料效率的影响

该试验结果显示，试验组黄颡鱼的增重率分别比对照组的提高6.5%、6.2%和15.4%，特定生长率分别提高3.4%、3.0%和7.5%，说明该复合酶制剂对黄颡鱼的生长有一定的促进作用，其中添加量为400 mg·kg^-1时黄颡鱼的增重效果最明显，这与韩庆和夏维福^[10]的促生长结果基本一致。此试验条件下试验组黄颡鱼的饲料系数与对照组比均无显著性差异，但是摄食量提高，其中添加400 mg·kg^-1组摄食量显著高于对照组，其变化规律与增重率和特定生长率的一致，所以该复合酶制剂可能是通过提高鱼的摄食量来促进鱼体生长。这与王纪亭等^{[4, 6]}等用复合酶制剂对草鱼、鲤的研究和黄峰等^[11]用单一酶木聚糖酶对异育银鲫(C.auratus gibelio)的研究结果不一致。这些学者报道酶制剂通过改善饲料养分消化吸收，提高饲料效率，从而促进鱼体的生长，可能跟试验鱼种类和食性不同有关。另外也有研究表明，在肉食性鱼暗纹东方鲀(Takifugu obscurus)的低鱼粉料中添加复合酶(淀粉酶、纤维素分解酶和蛋白酶)可提高其对饲料的消化率，究其原因是酶制剂破坏了植物性饲料的细胞壁和促进内源酶的分泌^[12]，而该试验在偏肉食性鱼黄颡鱼低鱼粉料中用酶主要为蛋白酶、淀粉酶和脂肪酶等，这几种酶可能是通过补充内源酶的不足^[13]或在体外加工过程中发生了作用^[14]，导致黄颡鱼对饲料的消化力增强进而提高其摄食量来促进生长。这与木聚糖酶、非淀粉多糖酶及纤维素酶等通过解除饲料中抗营养因子提高鱼对饲料的表观消化率和饲料效率、促进鱼体生长机理稍有不同。

3.2   复合酶制剂对血清生化指标的影响

笔者试验结果发现，添加复合酶制剂使黄颡鱼甘油三酯(TG)和葡萄糖(GLU)浓度升高，说明复合酶制剂对黄颡鱼的脂肪和糖类代谢产生了积极的影响，能够促进脂肪和能量代谢。另外，随着复合酶制剂的添加，黄颡鱼血清尿素浓度显著降低，谷丙转氨酶(ALT)活性也明显升高，这与肉鸡^[15]和雏鹅^[16]的研究结果一致。ALT活性升高，表明体内氨基酸合成代谢加强；尿素浓度降低，表明体内蛋白质分解代谢减少。非淀粉多糖酶能显著降低奥尼罗非鱼(Orechromis niloticus×O.aureus)血清尿素水平，促进奥尼罗非鱼蛋白质沉积^[17]。综合分析黄颡鱼的血清生化指标，说明该复合酶制剂对黄颡鱼蛋白质、脂肪和糖类营养代谢产生了积极的影响，能够促进蛋白质和脂肪的合成，提高蛋白质和脂肪在黄颡鱼体内的沉积，从而增加黄颡鱼的增重率。

3.3   复合酶制剂对血清总蛋白含量和溶菌酶活力的影响

血清总蛋白(TP)是在肝脏和网状内皮系统的浆细胞内合成，其质量浓度的提高表明动物对营养物质吸收加强。复合酶中的蛋白酶能够促进动物对氨基酸的吸收，其自身也可在动物胃肠道中形成生物免疫活性肽直接吸收入血，进而增强动物的免疫力。该试验结果表明，复合酶制剂能明显提高黄颡鱼的总蛋白质量浓度，其中添加量为200 mg·kg^-1时总蛋白质量浓度显著高于对照组。这与凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)^[18]的研究结果相似。鱼类是比较低等的脊椎动物，其特异性免疫机制还很不完善，因此，非特异性免疫在鱼类免疫防御中发挥着重要作用^[19]。溶菌酶(LZM)是吞噬细胞杀菌的物质基础，广泛分布于鱼体许多组织和体液中，它主要针对革兰氏阳性菌发挥作用，LZM活力越大，其溶解细菌的能力越强^[20]。该试验结果发现，饲料中添加100~200 mg·kg^-1复合酶制剂时黄颡鱼血清LZM活性显著升高，说明复合酶制剂能提高黄颡鱼的体液免疫因子，进而提高黄颡鱼的非特异性免疫功能。这与钟国防等^[9]和谢骏等^[21]对奥尼罗非鱼的研究和黄峰等^[11]对异育银鲫的研究结果一致。

3.4   复合酶制剂对血清超氧化物歧化酶和丙二醛的影响

超氧化物歧化酶(SOD)广泛存在于动物体各组织中，属于金属酶，是一种活性氧清除剂，在防止生物大分子氧化损伤方面具有重要作用。它可以将超氧阴离子(O₂^-)歧化为过氧化氢(H₂O₂)和氧气(O₂)，从而避免自由基对机体造成的氧化损伤^[22]。丙二醛(MDA)是脂质过氧化反应的典型产物，其水平高低能间接反映机体过氧化损伤程度。通常将SOD和MDA测定相互配合，共同评价机体抗氧化能力强弱。钟国防等^[9]和谢骏等^[21]研究发现，复合酶能显著提高奥尼罗非鱼SOD，黄峰等^[11]的研究结果表明，添加外源木聚糖酶能显著提高异育银鲫血清SOD活性，与黄燕华等^[15]在对虾中的研究一致。而该试验结果显示，添加复合酶制剂对黄颡鱼血清SOD活性和MDA水平浓度均无显著性差异，说明该酶制剂对黄颡鱼的抗氧化能力没有影响，可能是因为各研究者所用试验鱼虾的食性不同所致，具体机理有待进一步研究。