菲(phenanthrene，PHE)是由3个苯环连接而成的多环芳烃类(PAHs)化合物，并存在与有致癌性相关的“K区”(即9，10双键)。苯并(b) 荧蒽[benzo(b)fluoranthene，BbF]是具有5个苯环的典型的PAHs化合物，致癌性仅次于苯并(a)芘。近年来随着海上石油和轮船运输业的发展以及工业、生活污水的大量排放，海洋环境中PAHs的污染日益加重，PHE和BbF在水体环境中的含量也越来越高。据报道珠江三角洲地区河流表层沉积物中w(PHE)高达1 460.61 ng · g^-1，w (BbF)达到828.50 ng · g^-1[1]；长江流域南京段沉积物中w(PHE)为16.78~64.11 ng · g^-1， w(BbF)为3.54~104.78 ng · g^-1[2]。PHE和BbF对水生生物具有很强的毒性，PHE对麦穗鱼(Pseudorasbora parva)的96 h半数致死质量浓度(LC₅₀)为0.22 mg ·L^-1[3]，CORREIA等^[4]发现在高浓度的PHE曝露条件下鲫(Sparus aurata)表现出昏睡、行为迟钝的现象；任加云等^[5]通过苯并(a) 芘和苯并(k)荧蒽对栉孔扇贝(Chlamys farrerri)染毒后检测到其脂质过氧化(LPO)损伤水平升高。由于这2种PAHs化合物与水底淤泥结合力较强，在水底淤泥中降解速度较慢，且含量呈不断增加的趋势，因此对水生生物有较大的潜在威胁。

超氧化物歧化酶(SOD)是生物体内抗氧化防御系统的重要酶之一，可清除生物体内的$\cdot \mathrm{O}_2^{-} $自由基，如果$\cdot \mathrm{O}_2^{-} $及时得到清除，· OH产生的可能性就极小，即机体受损伤的可能性不大。SOD清除$\cdot \mathrm{O}_2^{-} $的能力与其含量和活力有关，当生物体受到污染胁迫时往往会伴随着机体内抗氧化酶活力的上升或下降，因此，国际海洋监测委员会(ICES)于1994年颁布推荐的海洋污染早期生化监测指标中就有包括SOD在内的抗氧化防御系统；而丙二醛(MDA)是膜LPO的主要产物之一，其含量的高低可直接指示生物膜受氧化损伤的程度，是目前应用非常普遍的海洋污染生物监测指标。

贝类为滤食性生物，代谢率低，对污染物具有较强的累积作用，常被用作海洋环境污染的指示生物。近年来国内外学者多采用贝类研究重金属[汞(Hg)和镉(Cd)等]和有机污染物(三丁基锡等)对其酶活力的影响^[6-9]，但有关PHE和BbF对贝类外套膜中SOD活力和b (MDA)的影响尚未见报道。文章以翡翠贻贝(Perna viridis)为生物材料，通过观察单一PHE和BbF静态曝露和清水恢复条件下翡翠贻贝外套膜中SOD活力和b(MDA)的变化，探讨PAHs对翡翠贻贝的致毒机理，不仅可为贝类养殖的环境毒理学研究提供理论基础，同时可为海洋环境污染监测提供有益的参考资料。

1.   材料与方法

1.1   试验材料

从海南陵水新村港附近育苗场采购体色鲜艳、大小均匀和平均壳高为(5.0±0.5)cm、体质量为(15.6±2.9)g的翡翠贻贝为试验对象。试验容器采用底部半径0.4 m、高1.2 m、容积为600 L的玻璃钢圆筒。翡翠贻贝暂养7 d，日换水1/2，养殖密度为200~300 ind · m^-3，期间连续充气，并投喂螺旋藻粉。试验海水取自育苗场附近，经沉淀池沉淀和砂滤后待用，海水盐度34~36，pH 7.7~7.9，水温22~25 ℃。

PHE和BbF均为分析纯，购于美国Sigma公司。丙酮为分析纯，购于广州化学试剂公司，其他试剂均为分析纯。SOD和MDA和蛋白质测试试剂盒均购自南京建成生物工程研究所。

1.2   试验方法

1.2.1   质量浓度设置

首先用丙酮溶解PHE和BbF，各自配成1.0 g · L^-1的储备液。在预试验基础上设置此试验质量浓度，各设PHE和BbF 2.0 μg ·L^-1 、10.0 μg · L^-1 和50.0 μg · L^-1 3个处理组和1个丙酮对照组(丙酮体积比 < 0.01%)，每组放入35只翡翠贻贝，设2个平行试验组，每48 h完全更换试验溶液1次。昼夜充气，采用自然光照，每天定时投喂螺旋藻粉。

1.2.2   组织匀浆的制备

分别在PHE和BbF曝露的第1、第4、第8和第15天和清水恢复后第2及第7天从各处理组随机取5只贻贝个体，迅速解剖取出外套膜组织，用预冷的生理盐水漂洗去血液，再用滤纸吸去表面水分。准确称取外套膜0.4 g置匀浆器中，加预冷的Tris-HCl缓冲液(pH 7.5)1 mL，在1~4 ℃的冰水浴下匀浆，再用Tris-HCl定容到4 mL，然后于冷冻离心机(0~4 ℃，3 500 r ·min^-1)离心15 min，取上清液待测。

1.2.3   酶活测定

各指标测试方法均按试剂盒说明进行。SOD活力单位定义为每毫克组织蛋白在1 mL反应液中SOD抑制率达50%时所对应的SOD量为1个SOD活力单位[U · mg^-1(protein)]。b (MDA)定义为每毫克组织蛋白MDA的质量摩尔浓度[nmol · mg^-1(protein)]。蛋白含量采用考马斯亮兰法进行测定，以试剂盒中的蛋白标准液为标准蛋白。所有指标吸光值均用UV-7504单光束紫外可见分光光度计(江苏省常州市诺基仪器有限公司出品)测定。

1.3   数据处理

试验数据用统计学方法进行处理，结果均用平均值±标准差(X±SD)表示。用SPSS软件中单因素方差分析法分析曝露引起的差异，用最小显著差数法(LSD)比较组间数据，P < 0.05时即被认为差异显著，用Pearsom法作相关性检验。

2.   结果

2.1   PHE和BbF对SOD活力的影响

在PHE胁迫阶段，各处理组SOD活力呈先被诱导后被抑制的变化趋势，高浓度处理组(50.0 μg · L^-1)在第4天诱导率达到极大值，为102.6%(P < 0.01)，低和中浓度组(2.0 μg · L^-1和10.0 μg ·L^-1)SOD诱导率在随后的第8天也达到峰值，分别为59.9%和65.2%(P < 0.01)，在胁迫的第15天中、高浓度组SOD活力被显著抑制(P < 0.05)，抑制率分别为18.8%和42.8%(图 1)。清水释放后中、低浓度组SOD活力逐渐恢复至对照组水平(P＞0.05)，而高浓度组SOD与对照组仍有显著性差异(P < 0.05)。

图  1  PHE和BbF对翡翠贻贝外套膜SOD活力的影响

*. 表示相同胁迫时间段内处理组与对照组间生化影响的比较结果(P < 0.05)；2^*和7^*. 清水解毒阶段，后图同此

Figure  1.  Effects of phenanthrene and benzo(b)fluoranthene on SOD activity in P.viridis mantle

*. significant difference between treatment groups and the control(P < 0.05) within the same period; 2^* and 7^*.detoxification phase in clean water.The same case in the following figure.

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BbF胁迫第1天，各处理组SOD活力与对照无显著性差异(P＞0.05)；随着时间的延长，高浓度组SOD活力开始被诱导，并与对照组有显著性差异(P < 0.05)，经15 d胁迫后50 μg · L^-1组高出对照组54.3%。中、低浓度组在清水释放的第2天已与对照组无显著差异(P＞0.05)，第7天高浓度组也逐渐恢复至对照组水平(P＞0.05)。

2.2   PHE和BbF对LPO水平的影响

PHE暴露1 d后各处理组与对照组无显著性差异(P＞0.05)，而随胁迫时间的延长b (MDA)呈上升趋势，并在第15天胁迫结束时达到峰值，分别比对照组高出55.8%、81.6%和127.0%(P < 0.01)(图 2)。清水释放阶段各处理组b (MDA)有所降低，到第7天释放结束时中、低浓度组b (MDA)已与对照无显著性差异(P＞0.05)。

图  2  PHE和BbF对翡翠贻贝外套膜b(MDA)的影响

Figure  2.  Effects of phenanthrene and benzo (b) fluoranthene on MDA content in P.viridis mantle

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BbF胁迫第1天中、低浓度组b (MDA)显著高于对照组(P < 0.05)，随着时间的延长，中、高浓度组b (MDA)呈显著的上升趋势，而低浓度组只有轻微的上升，并在第4天和第8天时与对照组无显著性差异(P＞0.05)，第15天时各浓度组分别上升了21.0%、50.7%和93.4%。清水释放7 d后各处理组均恢复到对照组水平(P＞0.05)。

3.   讨论

3.1   2种PAHs对SOD活力的影响

水环境中PAHs对贝类的正常生理功能均存在不同程度的影响。在污染胁迫下贝类组织SOD活力可能会发生激活或抑制2种应激改变，但这些改变并不是最终的毒理效应，只是反映生物体暂时所处的一种状态。2种状态的出现取决于曝露的强度和时间，同时也取决于生物种类的敏感性。诱导效应可认为是生物体克服不良反应的一种适应性改变；而活力减弱则反映了生物体对环境压力十分敏感，并可能受到进一步的损伤。王淑红等^[10]发现荧蒽、PHE与芘3种PAHs混合曝露对菲律宾蛤仔(Ruditapes philippinaram)SOD活力影响为一个先诱导后抑制的动态变化过程。此试验中PHE胁迫下翡翠贻贝外套膜SOD活力变化呈先升高后降低的趋势，胁迫初期SOD活力的提高可能是贻贝对外界环境的一种应激和自我保护反应，通过调节SOD活力去适应逆境并再次建立活性氧产生与清除的平衡关系；随着曝露时间延长，活性氧自由基的产生超出SOD的清除能力，贝体外套膜SOD受抑程度超出自身的适应与保护能力，因此SOD活力降低。较PHE而言，贻贝外套膜SOD活力变化对BbF表现出较低的敏感性，表现在第15天胁迫结束时SOD活力在高浓度除胁迫下才被显著诱导，这可能是由于PHE和BbF因化学性质及结构的不同而引起贻贝对其生物响应的差异。

清洁海水中恢复7 d后，PHE处理的中、低浓度组和BbF胁处理过的各处理组SOD活力均恢复到正常水平，而PHE处理过的高浓度组SOD活力仍然显著低于对照组。表明BbF及轻度PHE胁迫带来的氧化压力可以逐渐恢复，但高浓度PHE给外套膜带来的氧化压力较大，已超出贻贝机体的自我恢复能力，其随着释放时间的延长能不能修复尚需进一步的研究。

3.2   2种PAHs对LPO水平的影响

当生物体受到不利因素胁迫时机体内会产生过量的$\cdot \mathrm{O}_2^{-} $、·OH和H₂O₂等分子，这些活性氧分子的大量产生会引发或加剧膜LPO作用，对膜系统造成严重伤害^[11-13]。此试验结果显示2种PAHs对翡翠贻贝高浓度或长时间胁迫时，外套膜细胞b (MDA)明显高于对照组，表明PHE和BbF胁迫对外套膜产生了一定的氧化压力，导致细胞膜LPO作用增强，可能会对细胞膜的正常功能产生不利影响。清水释放阶段2种PAHs胁迫下的外套膜b (MDA)逐渐降低至对照组水平，这是由于机体的抗氧化防御系统在发挥功能，消除多余的活性氧；同时也可能是体内富集的PAHs经代谢逐渐释放到清水中从而使其毒性作用降低。杨慧赞^[14]在对栉孔扇贝(Chlamys farreri)进行苯并(a)芘曝露15 d后转移到清水中暂养后发现其体内的BaP含量迅速下降，3 d便下降50%。

3.3   2种PAHs对氧化胁迫影响的差异性

氧自由基可造成细胞膜的LPO，致使b (MDA)升高，而SOD是清除氧自由基的关键性酶，因此，SOD活力与b (MDA)之间存在一定的相关性。张培玉等^[15]通过蒽对太平洋牡蛎(Crassostrea gigas)的胁迫研究发现SOD活力呈下降趋势，相应的其膜质过氧化程度则有不同程度的上升。聂芳红等^[16]利用2种二噁英对斑马鱼(Brachydanio rerio)染毒后得出，TCDD和PCB77分别能导致肝脏b (MDA)增加，SOD活力下降。此试验中PHE处理早期就对贻贝外套膜造成LPO作用，但SOD活力却仍然升高，这可能是由于PHE进入外套膜后，诱导了SOD基因的表达，产生一些SOD，但这种诱导作用较弱，而且持续时间较短。到了第15天时贻贝外套膜SOD活力被显著抑制，间接反映了机体清除自由基的能力降低，同时b(MDA)显著上升，间接说明了贻贝的机体细胞受到自由基的攻击，两者呈明显的负相关性。上述结果表明，PHE的重要毒理机制之一是引起贻贝的LPO作用，导致机体受到过多氧自由基的攻击，从而造成机体细胞相应的毒性反应。而在BbF胁迫下SOD活力与b (MDA)之间的相关性却不够显著，可能由于贻贝外套膜SOD基因对BbF的胁迫表达较慢，以致活力在第15天时才被显著诱导，但膜系统并没有随SOD活力的上升而免受损伤，其原因可能是翡翠贻贝受到的胁迫程度过重而使其自身修复系统难以发挥作用^[17]。

综上所述，单一PHE和BbF曝露下翡翠贻贝外套膜SOD活力和b (MDA)的变化，反映了贝体抗氧化防御系统对不同程度PAHs胁迫的响应。2种PAHs胁迫下贻贝受到的氧化胁迫程度均呈上升趋势。但PHE曝露4 d后翡翠贻贝外套膜SOD活力即明显被诱导，说明PHE带来的氧化压力明显高于BbF。由于海洋环境是一个多变体系，在不同季节以及翡翠贻贝不同的生长期、性别及组织中，PAHs对翡翠贻贝外套膜中SOD活力和b (MDA)的变化是否仍然遵循这一规律，还有待进一步研究。