阿维菌素类药物(avermectins)属于大环内酯类药物，由链霉菌产生，对动植物的寄生线虫和节肢动物均有高效的驱杀作用。阿维菌素作为一类广谱高效的抗寄生虫药物，目前广泛应用于水产养殖。文献报道阿维菌素用于治疗青鱼、草鱼、鲤、鲫等养殖鱼类因中华鳋、锚头鳋、三代虫、指环虫、鱼鲺等寄生虫引起的摄食不旺、浮头、弄水病等病症，同时能防治养殖鱼类的细菌性败血症^[1-3]。按世界卫生组织(WHO)五级分级标准，虽然阿维菌素属于微生物源农药，但仍属高毒化合物。此类药物会在生物体内富集，经过食物链传递而影响到人类安全。因此，生物组织中此类药物的残留不容忽视，欧盟、美国、日本等国均制定了阿维菌素类药物的最高残留限量。目前，有关水产品中阿维菌素类药物的残留检测方法、消除规律研究较少^[4-13]，在很大程度上制约着此类药物在水产养殖中的安全应用。鲈(Lateolabrax japonicus)在养殖过程中发生寄生虫类的病害较少，但发病后治疗难度很大。对于此类由寄生虫引起的病害，一般以防治为主，每隔一段时间用阿维菌素药物播洒鱼池一次。因此，文章选用鲈为研究对象，模拟实际养殖中给药方式下鲈鱼中阿维菌素的残留及消除规律。

1.   材料与方法

1.1   试验用鱼

试验用健康鲈鱼共计100尾，平均体质量250 g，饲养于福建省水产研究所水产养殖实验基地。试验前对鲈鱼进行暂养，保持水温(22±2)℃，pH 8.0，盐度30，正常充气并投喂空白配合饲料，日饲量不超过初始体质量的3%，14 d后挑选体色活力均正常者进行给药试验。

1.2   试剂与仪器

标准品阿维菌素购自Dr公司(纯度>92%)。试验用的阿维菌素药物购自无锡市中意生物技术有限公司，商品名混虫安，质量浓度为4 mg·mL^-1。乙腈、甲酸、正己烷均为色谱纯；无水硫酸钠、乙酸铵均为化学纯；水为Milli-Q制备的超纯水；无水硫酸钠固相萃取柱(5 g，6 mL)；碱性氧化铝固相萃取柱(500 mg，3 mL)。Accela TSQ Quantum Access液相色谱串联四级杆质谱联用仪(美国Thermo Fisher公司出品)；AB204-E型电子分析天平、PL203型电子分析天平(Mettler Toledo公司出品)；离心机(北京时代北利离心机有限公司出品)；MS3型旋涡混合器(德国IKA公司出品)；氮吹仪(广州智真生物科技有限公司出品)；旋转蒸发仪(上海申生科技有限公司出品)。

1.3   试验设计

1.3.1   毒性试验

以自然状态为对照，以规格型号为1 m³的水泥池为试验用池，采用等比间距法，设置若干质量浓度梯度组。在参考文献的基础上^[14-16]，采用半静态停食试验法开展阿维菌素对鲈鱼的急性毒性试验。试验用健康鲈鱼平均体质量250 g，试验水温(22±2)℃。每种药物质量浓度梯度各放鲈鱼10尾，持续浸泡96 h。试验期间每隔12 h观察受试对象的活动情况，及时取出死亡个体，每24 h记录一次死亡数。根据阿维菌素对鲈鱼的急性毒性试验结果，采用改良的寇氏法计算96 h的半致死质量浓度(LC₅₀)为16.13 ng·mL^-1。

1.3.2   试验分组、给药与采样

试验组分为给药组和对照组，每池约为70尾鱼。结合实际养殖过程中的用药情况，采用0.25倍LC₅₀为投药质量浓度，即指导用药量，此质量浓度为4 ng·mL^-1，浸浴72 h，72 h后彻底换水。于给药后的第0.5、第1.5、第2.5、第4.5、第7.0、第10.5、第23.5、第44.5、第47.5、第58.5、第72.0、第82.5、第95.5、第175、第240、第312、第408、第528和第744小时采集肌肉，每个采样点采集3尾鲈鱼，采集后的全部样品于-20 ℃冰箱中冷冻保存，待整个给药试验结束后进行药物分析。

1.4   标准溶液配制

1.4.1   储备液

准确称取阿维菌素标准品10.0 mg，在棕色容量瓶中用乙腈定容至100 mL。该溶液质量浓度为100 μg·mL^-1，于-18 ℃下避光保存，有效期6个月。

1.4.2   标准中间溶液

准确移取阿维菌素标准储备液100 μL于10 mL容量瓶，用乙腈稀释成1 μg·mL^-1的标准中间溶液，于4 ℃下避光保存，有效期为1个月。

1.4.3   混合标准工作曲线工作液

准确吸取一定量的阿维菌素标准中间溶液，用空白样品提取液稀释成相应的标准工作液，使用时现配现用。

1.5   样品前处理

称取(5±0.05)g试样于50 mL塑料离心管中，加入5 g无水硫酸钠，涡旋30 s。加入15 mL乙腈，涡旋1 min，超声5 min，3 500 r·min^-1下离心6 min，再用10 mL乙腈重复提取离心1次。合并上清液至100 mL塑料离心管，提取液过无水硫酸钠固相萃取柱，所有流出液40 ℃旋转蒸发至干。用5 mL乙腈分2次洗涤旋转蒸发瓶，并将洗涤液转入预先用4 mL乙腈活化好的碱性氧化铝固相萃取柱，并用6 mL乙腈洗涤碱性氧化铝固相萃取柱，收集全部流出液。流出液在50 ℃下氮吹至干，加入1.0 mL初始流动相，过0.22 μm滤膜后供液相色谱-串联质谱测定。

1.6   色谱条件

色谱柱为Hypersil Gold C₁₈(50 mm×2.1 mm，1.9 μm)；流动相为10 mmol·L^-1乙酸铵-0.1 %甲酸水溶液+乙腈，梯度洗脱(表 1)；柱温为35 ℃；流速为0.20 mL·min^-1；进样量为15 μL。

表  1  HPLC流动相梯度洗脱程序

Table  1  HPLC gradient elution program of mobile phase

时间/min time	10 mmol·L-1乙酸铵-0.1%甲酸水溶液 10 mmol·L-1ammonium acetate-0.1% formic acid in water	乙腈 acetonitrile
0	40.0	60.0
3.0	10.0	90.0
6.3	10.0	90.0
6.5	60.0	40.0
11.5	60.0	40.0

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1.7   质谱条件

电喷雾离子源，正离子模式；喷雾电压为3 200 V；鞘气压力为2×10⁵ Pa，辅气压力为1.3×10⁴ Pa，离子传输毛细管温度360 ℃；选择反应监测(SRM)；母离子、子离子和碰撞能量见表 2，Q1半峰宽为0.7 Da，Q3半峰宽为0.7 Da，碰撞气压力为氩气，0.199 5 Pa。

表  2  选择反应监测母离子、子离子和碰撞能量

Table  2  Optimized SRM parameters for the analytes

化合物 compound	母离子/(m/z) parent ion	子离子/(m/z) product ions	碰撞能量/eV collision energy
阿维菌素	890.3	304.9* 567.0	26 13
注*. 定量碎片离子 Note：*.quantitative ion

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2.   结果与讨论

2.1   色谱及质谱条件优化

阿维菌素属于极性较弱的化合物，在C₁₈色谱柱上的保留较强，因此流动相中有机相比例需要较高。阿维菌素在ESI源下以加合峰的形式出现，一般与流动相中的钠(Na⁺)和氨(NH₄⁺)结合，形成加钠峰或加氨峰。选择加钠峰作为母离子，得到的碎片峰信息不稳定；而选择加氨峰作为母离子，可以得到稳定且丰富的碎片离子。因此，在流动相中加入微量甲酸和乙酸铵，可以抑制加钠峰，促进加氨峰的响应值。以注射泵直接进样将1.0 μg·mL^-1的阿维菌素标准品注入质谱离子源中，以分子离子峰为母离子对离子源参数进行优化，如喷雾电压、鞘气压力、辅气压力、离子传输毛细管温度、碰撞能量。

2.2   样品基质效应的消除

LC-MS/MS中的基质效应由分析物的共同流出组分影响电喷雾接口的离子化效率所致，表现为离子增强或抑制^[17]。基质效应主要来源于生物样品的内源性组分，内源性组分是指生物样品中存在的有机或无机成分^[17]，经前处理后存在于提取液中。因此采用流动相为基底的标准溶液(组1)，与采用空白样品提取液为基底的标准溶液(组2)进行比较，考察基质效应。两者比值(RA)等于或接近100时表明不存在基质效应的影响；RA小于100时表明存在离子抑制作用；RA大于100时表明存在离子增强作用。笔者试验RA大于100，基质对阿维菌素存在增强作用(表 3)。为了消除基质效应，试验采用提取后添加法，即空白样品提取液配制标准曲线法。

表  3  不同条件下基质效用计算结果>(n=3)

Table  3  Calculation results of matrix effect under different conditions

化合物 compound	峰面积peak area		基质效应/% RA
	组1 No.1	组2 No.2
阿维菌素 avermectin	248 036.87	291 777.03	118

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2.3   样品前处理条件的优化

阿维菌素是一类脂溶性的药物，一般溶于有机溶剂。试验比较了乙腈、乙酸乙酯和甲醇对阿维菌素的提取效果。试验结果表明乙酸乙酯和乙腈的提取效果较好，但乙酸乙酯沉淀蛋白效果较差，不利于后续的净化，所以最终选用乙腈作为提取剂。

由于水产品中含有大量水溶液，当提取液采用乙腈时，乙腈水溶液在减压旋转时易引起爆沸现象，会导致回收率偏低及不稳定结果。因此，试验采用450 ℃灼烧后的无水硫酸钠粉末及无水硫酸钠固相萃取柱作为除水剂，有效地防止了爆沸现象。

为了有效地除去提取液中的杂质，比较了碱性氧化铝固相萃取柱及C₁₈固相萃取柱的净化效果，两者净化效果相当。但C₁₈固相萃取柱的净化步骤较为繁琐，因此采用碱性氧化铝固相萃取柱进一步净化提取液。

2.4   标准曲线、线性范围、检出限和定量限

样品空白提取液由空白样品制备，用该提取液将标准液稀释成5 ng·mL^-1、10 ng·mL^-1、50 ng·mL^-1、100 ng·mL^-1、150 ng·mL^-1、200 ng·mL^-1和300 ng·mL^-1溶液，以各组分质量浓度与其色谱峰面积进行线性回归，呈良好线性关系；线性回归方程y=-14 335.1+5 168.6x，相关系数R²=0.999 0。以3倍信噪比(S/N)计算，检出限为0.5 μg·kg^-1；以10倍信噪比(S/N)计算，定量限为1.0 μg·kg^-1；标准品图谱见图 1。

图  1  阿维菌素选择离子流图(100 ng·mL^-1)

Fig. 1  SRM chromatograms for 100 ng·mL^-1 avermectin standard

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2.5   方法准确度及精密度

以阴性鲈鱼为研究对象，进行标准添加试验，研究在2 μg·kg^-1、20 μg·kg^-1和50 μg·kg^-1加标水平下测定结果的准确度及精密度。每个浓度水平做6个平行试验，批内加标平均回收率分别为78.6%、91.1%和94.4%，相对标准偏差分别为9.22%、6.03%和3.75%。18 d内在2 μg·kg^-1、20 μg·kg^-1和50 μg·kg^-1加标水平下进行6次标准添加试验，批间加标平均回收率分别为82.7%、85.7%和90.6%，方法的批间相对标准偏差为7.44%、8.93%和6.06%。

2.6   药浴后阿维菌素药物残留及消除规律

结合指导用药量及毒性试验，得出实际生产的药浴质量浓度为4 ng·mL^-1，鲈鱼在此质量浓度下根据实际生产的情况持续药浴72 h。用阿维菌素溶液药浴72 h后进行消除试验。按照设计的时间点采集鲈鱼的肌肉组织，采用己建立的测定鲈鱼肌肉组织中阿维菌素残留量的方法处理样品，并经高效液相色谱-串联质谱法测定。试验结果表明，鲈鱼肌肉中的阿维菌素质量分数在停止给药22 d后低于检测限，其药时曲线图见图 2。

图  2  鲈鱼肌肉的药-时曲线

Fig. 2  Concentration-time curve of perch muscle

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肌肉是鱼类最重要的可食组织，也是食品安全管理者和消费者共同关注的重点，因此应重点监测肌肉中药物残留的含量。水温20~24 ℃范围内，pH为8.0，盐度30，正常充气情况下鲈鱼在质量浓度为4 ng·mL^-1的阿维菌素的海水中持续药浴72 h。随药浴时间的延长，鲈鱼肌肉组织中的阿维菌素质量分数逐步增加，在药浴结束时达到峰值，质量分数为8.767 μg·kg^-1，更换不含阿维菌素药物的海水后，随消除试验的进行，阿维菌素在鲈鱼体内的残留量逐渐下降，第528小时(即第22天)降低至检测限以下(图 2)。

2.7   临床休药期的确定

休药期也叫消除期，是根据药物允许残留量及药物在食用组织中消除规律而确定。水生动物的休药期随着种属差异、生理差异、给药途径、制剂形式、给药剂量、温度、盐度、pH的不同而有差异^[18-19]。所有影响因素中水温影响最大。试验结果表明，药物的代谢强度在一定温度范围内与水温成正比，水温越高，代谢速度越快^[20]。日本肯定列表中规定阿维菌素在鳗科类肌肉中的最高残留限量为50 μg·kg^-1，但目前中国水产品无此药物最高残留限量标准。出于食用安全考虑，以无残留法作为最终休药期制定的标准。因此，在笔者试验条件下鲈鱼单次药浴72 h后的临床休药期为22 d。

3.   结论

作为一类广谱、高效的杀虫剂，阿维菌素目前广泛应用于鱼类病害的治疗和预防，然而目前关于此类药物在水产品中的药代动力学及残留规律研究较少。文章建立了阿维菌素在鲈鱼组织中的残留检测方法，模拟实际养殖过程中的给药方式，研究在药浴条件下阿维菌素在鲈鱼组织中的富集和消除规律，并确定了在此条件下的临床休药期，有利于健全水产品中此类药残监控体系。