Effect of pearl culture on N19 and Prismalin-14 genes expression in the pearl oyster Pinctada fucata
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摘要:
为探讨育珠对壳基质蛋白基因表达的影响，开展了合浦珠母贝(Pinctada fucata)N19和Prismalin-14基因在育珠贝和非育珠贝中的荧光定量表达研究。结果显示，N19和Prismalin-14在育珠贝与非育珠贝的闭壳肌、肝胰脏、性腺、肠、鳃等组织中均无表达，在外套膜均有表达；N19在珍珠囊表达，而Prismalin-14则不表达。N19与Prismalin-14在育珠贝外套膜的表达量均大于非育珠贝，表明育珠可能对某些壳基质蛋白的表达具有一定的促进作用。其中Prismalin-14在育珠贝外套膜的表达量最高(P＜0.01)，是非育珠贝外套膜Prismalin-14的1.23倍，是育珠贝外套膜N19的25.04倍，是非育珠贝外套膜N19的41.04倍，推测在珍珠贝生长过程中，对Prismalin-14的需求量可能比N19大。N19在育珠贝珍珠囊中表达量最高(P＜0.01)，是育珠贝N19外套膜的11.58倍，是非育珠贝外套膜的18.97倍，推测在珍珠形成的过程中，对N19的需求量可能比贝壳自身生长对N19的需求量大。
Abstract:To investigate the effect of pearl culture on the expressions of genes encoding shell matrix proteins, the relative expression levels of N19 and Prismalin-14 genes in the pearl-culturing oysters (PC) and non-pearl-culturing oysters (NPC) Pinctada fucata were investigated by using RT-FQ-PCR. The results show that the expressions of both N19 and Prismalin-14 are extremely weak or negative in muscle, liver, gonad, bowel or gill of PC and NPC, but positive in the mantle. The expression of N19 is obviously in pearl sac, while of Prismalin-14 is negative. The expressions of both N19 and Prismalin-14 in PC mantle are higher than that in NPC, which indicate pearl culture may promote expressions of some shell matrix protein genes. The relative expression level of Prismalin-14 is the highest (P < 0.01) in PC mantle, which is 1.23-fold greater than that of NPC mantle, 25.04-fold greater than N19 in PC mantle, 41.04-fold greater than N19 in NPC mantle, suggesting that pearl oysters may demand much more Prismalin-14 than N19 does. Meanwhile, the relative expression level of N19 is the highest in the pearl sac (P < 0.01), being 11.58-fold greater than that of the PC mantle, 18.97-fold greater than that of the NPC mantle, suggesting that pearl growth may demand much more N19 than shell growth does.
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Keywords:
- shell matrix protein /
- RT-FQ-PCR /
- gene expression /
- pearl culture
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盐度是与海水鱼类生长和繁育有着密切关系的外在环境因素之一，对海水鱼类的生长繁殖具有重要的影响，尤其在进行海水鱼类的人工繁殖和种苗培育时，盐度更是重要的环境因子。有关盐度对海水鱼类胚胎和早期仔鱼发育影响的研究国内外已见有不少文献报道，所涉及的研究种类有大西洋油鲱(Brevoortia tyrannus)[1]，黑鲷(Sparus macrocephalus)[2]、花鲈(Lateolabrax japonicus)[3]、NFDBF状黄姑鱼(Nibea miichthioides)[4]、梭鱼(Liza haematocheila)[5]、鲻(Mugil cephalus)[6]、大菱鲆(Scophthalmus maximus)[7]、赤点石斑鱼(Epinephelus akaara)[8]以及鲯GF6FA (Coryphaena hippurus)和遮目鱼(Chanos chanos)[8-9]等。
卵形鲳鲹(Trachinotus ovatus)，俗称黄腊鲳、黄腊鲹、卵鲹、短鳍鲳鲹、金鲳、红杉、红沙等[10]，隶属于鲈形目(Perciformes)鲹科(Carangidae)鲳鲹亚科(Trachinotinae)鲳鲹属，广泛分布于印度洋和太平洋的温暖水域，在中国东海、南海和黄海均有分布。卵形鲳鲹是海水养殖优质的种质资源，是近年来海湾深水网箱养殖的重要鱼类之一。近年来，国内外陆续开展了对卵形鲳鲹人工繁育技术的研究[11-12]，但尚未见有关盐度对该鱼早期发育影响的文献报道。文章研究观察了卵形鲳鲹受精卵在不同盐度中的沉浮性，测定其在不同盐度海水中的孵化率、初孵仔鱼的畸形率以及仔鱼在不投饵条件下的存活系数(survival activity index，SAI)，旨在为卵形鲳鲹的种苗生产提供参考依据，并为该种类的发育生物学研究积累基础资料。
1. 材料与方法
1.1 试验材料
试验用卵形鲳鲹于2008年4月取自南海水产研究所深圳试验基地，亲鱼自然产卵后立即用手抄网收集漂浮在水表面的受精卵运回实验室。选取一批由质量好的受精卵在适宜水温和盐度条件下孵化的仔鱼，挑选其中肉眼观察体形正常、活力好的个体用做不同盐度下SAI的观察试验。
1.2 盐度的配制及试验设计
试验用水为经沉淀及沙过滤的当地自然海水，温度为26.8±1.4 ℃，盐度28.2±0.8。
1.2.1 试验用水处理
供试海水均经过历时36 h以上的黑暗沉淀，再经沙池过滤及紫外线消毒。盐度试验所需高盐度海水用普通海水与加盐后的海水调配，低盐度海水用普通海水加淡水调配而成，用日产ATAGO型折光计测定海水盐度。
1.2.2 不同盐度对受精卵沉浮的影响
试验在盐度5.0~50.0范围内共设置10个盐度梯度组，每个盐度梯度为5，各设置3个平行，数据计算时取其平均值。用1 L烧杯作为试验容器，各放入100粒受精卵。试验开始时卵细胞还没有开始分裂，观察其在各种盐度海水中的沉浮状态。
1.2.3 不同盐度对胚胎发育的影响
设置10个海水盐度梯度(同1.2.2)，采用1 L烧杯做实验容器，取受精卵100个。试验过程中用空气压缩机连续微充气，室温培育(温度26.8±1.4 ℃)，待仔鱼破膜孵化后，观察仔鱼的孵化率和畸形率；孵化率和畸形率取3个平行组的平均值；孵化率为孵出成形的仔鱼与放入受精卵的比值。畸形仔鱼指油球异位或异数、尾部或脊柱弯曲的个体。
1.2.4 不同盐度下仔鱼SAI的测定
试验共设置8个盐度梯度组：10.0、15.0、20.0、25.0、30.0、35.0、40.0和45.0；实验容器采用1 L烧杯，各放入100尾初孵仔鱼，置于实验室内阴凉通风处(水温26.8±1.4 ℃)，试验期间不充气，不投喂，每天用玻璃吸管吸去死亡的仔鱼，记录存活的仔鱼尾数，一直到所有仔鱼全部死亡为止。仔鱼SAI计算公式如下：
$$ \mathrm{SAI}=\sum\limits_{i=1}^k\left(N-h_i\right) \times i / N $$ 式中N为试验开始时的仔鱼尾数，k为仔鱼全部死亡所经历的时间(天数)，hi为第i天仔鱼的累积死亡尾数。
1.3 相关生物学指标的确定
试验期间，定期观察并记录各试验胚胎组的发育情况。胚胎孵化时间(h: min)指从卵受精开始到约有50%以上鱼苗孵化出膜所经历的时间；孵化率(%)指全部孵出的仔鱼尾数与受精卵总数的比率×100；胚胎发育的适宜盐度范围指孵化率不低于50%的盐度范围[13]。
1.4 统计方法
应用Excel和SPSS统计软件进行分析，计算其平均值和标准差，并对变化趋势进行回归等相关分析。
2. 结果
2.1 不同盐度对卵形鲳鲹受精卵沉浮的影响
卵形鲳鲹受精卵圆形、透明、浮性、单油球，卵径为1.2 mm，油球径为0.16 mm，每1 g受精卵的数量约1 000~1 200粒。从观察结果可以看到，在相对静止的水环境条件下，卵形鲳鲹受精卵在盐度25.0以下时全部沉到烧杯的底部；当盐度在30.0时50%浮在中层，其余50%沉底；当盐度35.0以上时全部浮在水的表面(表 1)。
表 1 卵形鲳鲹受精卵在不同盐度下的沉浮情况Table 1. Buoyancy observation of T.ovatus fertilized eggs at different salinities盐度 salinity 5.0 10.0 15.0 20.0 25.0 30.0 35.0 40.0 45.0 50.0 状态 state 沉 沉 沉 沉 沉 半浮沉 浮 浮 浮 浮 2.2 不同盐度对卵形鲳鲹胚胎发育的影响
观察到在室温26.8±1.4 ℃，盐度15.0~45.0条件下，卵形鲳鲹受精卵经20 h左右孵化出仔鱼，盐度变化对孵化时间的影响不大。当盐度较低(5.0~10.0)时，胚盘于受精后4~6 h起呈现严重扩散和融合状，分裂球间界线模糊不清，胚胎在受精后6~8 h即发育到多细胞期至高囊胚期间死亡；在盐度最高(50.0)组，胚盘在受精后4~6 h开始出现收缩，分裂球界线模糊不清，而且随着盐度的升高胚盘加剧收缩，当发育到多细胞期至高囊胚期间形成死胚。试验结果显示，卵形鲳鲹胚胎在盐度15.0~45.0之间都能完成发育过程并孵化出仔鱼；盐度低于15.0或高于45.0时都无法孵化出仔鱼。总孵化率与盐度变化呈反抛物线形分布，其回归关系可用y=-0.0025x2+0.1409x-1.0557(R2=0.9607，P < 0.05)来表达，畸形率呈正抛物线形分布，其回归关系可为y=0.0023x2-0.1214x+1.8500(R2=0.9572，P < 0.05)，计算可得在微充气的试验条件下，卵形鲳鲹胚胎孵化的适盐范围为14.9~39.4，孵化率为50.4%~63.7%，畸形率在55.17%~63.72%。最适盐度为26.0~28.2，孵化率为91.2%~93.4%，畸形率为25.00%~26.60%(图 1)。
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图 1 盐度对卵形鲳鲹胚胎形成、总孵化率、畸形率的影响Figure 1. Effects of salinity on embryo formation, total hatching rate and abnormality of T.ovatus2.3 不同盐度下卵形鲳鲹仔鱼SAI的测定
卵形鲳鲹仔鱼从孵化后3日龄开始能够从环境中摄食，进入内源营养和外源营养混合期的生长发育阶段，在盐度25.0~30.0的试验范围内，SAI为44.19~47.44，仔鱼的活力较强(表 2)。盐度10.0时，SAI为3.17，仔鱼在开口或开口后1 d全部死亡；盐度15.0时，SAI为16.43，并在4日龄时存活率下降到70%以下；盐度35.0~40.0时，SAI为13.26~24.66，仔鱼的畸形率较高，活性较差；盐度达到45.0时，SAI仅为1.00，第2天均全部死亡。从表 2中所列的SAI可见，卵形鲳鲹早期仔鱼发育的最适盐度范围应在25.0~30.0之间。
表 2 盐度10.0~45.0条件和饥饿状态下卵形鲳鲹仔鱼成活率和生存活力指数Table 2. Survival rate and SAI of larval T.ovatus under starvation at salinity of 10.0~45.0盐度
salinity仔鱼不同天数的成活率/%
the survival rate of larval on different daysSAI 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 10.0 100 52 37 8 0 0 0 0 0 0 0 0 3.17 15.0 100 88 74 69 54 45 13 2 0 0 0 0 16.43 20.0 100 93 90 85 84 83 54 34 16 2 0 0 26.18 25.0 100 98 95 95 93 88 86 73 70 60 4 0 44.19 30.0 100 99 98 98 98 89 89 86 85 60 12 0 47.44 35.0 100 96 93 90 89 80 70 15 0 0 0 0 24.66 40.0 100 85 70 63 49 35 13 6 0 0 0 0 13.26 45.0 100 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1.00 3. 讨论
3.1 不同盐度对鱼类受精卵沉浮的影响
在不同盐度范围内，受精卵在水层中的分布情况有所不同。此试验中，卵形鲳鲹受精卵在盐度小于25.0时全部沉底；在盐度大于35.0时全部为浮性。花尾胡椒鲷(Plectorynchus cinctus)的受精卵在盐度小于26.47的海水中全部为沉性，在大于30.12的海水中则呈现为浮性[14]。在试验温度下，点带石斑鱼(E.malabaricus)受精卵的相对比重与盐度30或31的海水比重相当，大致界于1.020~1.021之间[15]。高体NFDA4 (Seriola dumerili)受精卵在盐度为30.0以下呈沉性；在盐度32.0以上的海水呈浮性[16]。黄鲷(Dentex tumifrons)在相对静止的环境条件下，其胚胎在盐度32.0以下的海水时全部都沉到容器底部；在盐度33.0时40%的胚胎浮在水体中层, 60%沉底；在34.0时90%的胚胎分布于水体中间，呈现悬浮状态，10%的胚胎浮在水体表面；在35.0时40%的胚胎呈悬浮状态，60%的胚胎浮在水体表面；在盐度36.0以上时胚胎全部浮在水的表面[17]。在26.8~29.5 ℃条件下，军曹鱼(Rachycentron canadum)受精卵在盐度26.0以下的海水中呈现完全沉性；在盐度29.0时呈现半沉浮状态，大多数的受精卵悬浮在水体的中间；在盐度32.0以上的海水中受精卵呈现完全浮性[18]。由此可见，鱼类卵子在不同盐度水中的沉浮状态具有种间差异。因此，在种苗繁育过程中，为了获得高的成活率，应根据不同鱼类受精卵的沉浮特性，调整好生产用水的盐度，使之处于悬浮状态，以避免因盐度过低，受精卵下沉堆积，胚胎无法摄取充足的溶氧。
3.2 不同盐度对鱼类胚胎和早期仔鱼发育的影响
鱼类卵的发育实际上受渗透压的调节。随着胚胎和仔鱼的发育，渗透调节的能力和过程都在变化。在早期胚胎发育过程中，渗透调节是有积极意义的，调节主要归因于细胞质膜的半渗透性和胚盘细胞的紧密连接[19]。盐度主要影响鱼类卵内渗透压的稳定性，在适盐范围内，卵内渗透压可通过自身调节保持在相对稳定的水平，故而有较高的孵化率。因此，海水鱼类的早期发育都有一定的适盐范围。外界水环境的高渗作用会促进鱼类胚胎发育的进程，缩短其孵化时间。但若海水的盐度过高、培育周期太短，则会影响鱼类胚胎发育的正常进行，结果造成孵出的仔鱼成活率低、对环境变化的耐受力差。低盐度条件下孵化率较低，低盐度影响了卵胚胎发育过程的能量消耗、利用规律和效率，使卵黄和油球内营养物质不能正常地转化为胚胎内组织的生长所需，从而破坏其正常的胚胎发育进程，导致孵化时间延长。根据受精卵的孵化时间、孵化率和畸形率等指标来判断，斜带石斑鱼(E.coioides)受精卵孵化的适宜盐度范围为15.0~45.0，以20.0~30.0为最适盐度[20]。高体NFDA4胚胎的最适发育盐度为32.0~35.0，当盐度低于30.0时，仔鱼的孵化率及成活率都呈现出明显的下降趋势[16]。赤点石斑鱼受精卵发育的适宜盐度为24.0~38.0，最适盐度为27.0~35.0，盐度高于35.0，孵化率随盐度的升高而降低、仔鱼畸形率随之升高[21-22]。与上述几种海水鱼类相比，卵形鲳鲹胚胎孵化的适盐范围与斜带石斑鱼相似，较赤点石斑鱼宽，但最适盐度范围比斜带石斑鱼窄，比赤点石斑鱼宽。这可以反映出卵形鲳鲹早期生活阶段的适盐性与一般海水鱼类大致相同。
3.3 SAI与仔鱼活力的关系及其应用
日本在海水鱼类种苗生产中，常用SAI来判断早期仔鱼的活力①。在不投饵的情况下，初孵仔鱼仅靠自身携带的卵黄营养可存活一定的时间。存活时间的长短受其卵黄营养物质的质量和数量影响[22]。在无投饵(饥饿)和静水的条件下，观察仔鱼的耐受能力及存活天数，SAI越大，表明仔鱼的活力越强，用于种苗生产时成活率则较高。根据对目前不少开展人工繁育的海水鱼类的观察，SAI小的仔鱼，往往在第3~4天就会死亡，应整批弃之不用。从不同盐度下仔鱼SAI的变化结果来看，卵形鲳鲹在适宜的盐度内，仔鱼的SAI较高，反之则低。这也表明盐度对仔鱼活力的影响程度，从中得出仔鱼存活的适盐范围②。卵形鲳鲹仔鱼在盐度为25.0和30.0的2个组仔鱼的SAI最高，分别为44.19和47.44；经深入观察，在这2组条件下，仔鱼发育及摄食正常，这与盐度对胚胎发育影响的范围几乎一致，这也表明适时调节培育用水的盐度，是种苗生产工艺流程中一个重要的环节。
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图 1 合浦珠母贝不同组织总RNA
a.育珠贝；b.非育珠贝；M.DNA分子质量标准DL2000；1~7. 鳃、性腺、肠、肝胰脏、外套膜、珍珠囊、闭壳肌；8~13.肝胰脏、外套膜、鳃、闭壳肌、性腺、肠
Figure 1. Total RNA extracted from P.fucata tissues
a. pearl-culturing oyster (PC); b. oyster without pearl-culture (NPC); M. DNA molecular weight marker (DL2000);1~7. gill, gonad, bowel, liver, mantle, pearl sac and muscle; 8~13. liver, bowel, gill, mantle, muscle and gonad
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图 2 合浦珠母贝N19、Prismalin-14基因的组织表达谱[育珠贝(a、b)与非育珠贝(c、d)]
M1~M2. DNA分子质量标准DL2000；M3~M4. DNA分子质量标准DL5000；B1~B4.空白对照；1~7(N19).珍珠囊、鳃、性腺、肠、肝胰脏、闭壳肌、外套膜；8~14(Prismalin-14).肝胰脏、肠、外套膜、鳃、珍珠囊、闭壳肌、性腺；15~20(N19).闭壳肌、性腺、鳃、肠、肝胰脏、外套膜；21~26(Prismalin-14).肝胰脏、肠、鳃、闭壳肌、外套膜、性腺
Figure 2. The expression of N19 and Prismalin-14 genes in different tissues of P.fucata [PC(a, b) and NPC(c, d)]
M1~M2. DNA molecular weight marker (DL2000);M3~M4. DNA molecular weight marker (DL5000);B1~B4. blank control group; lane 1~7 (N19): pearl sac, gill, gonad, bowel, liver, muscle and mantle; lane 8~14 (Prismalin-14). liver, bowel, mantle, gill, pearl sac, muscle and gonad; lane 15~20 (N19). muscle, gonad, gill, bowel, liver, and mantle; lane 21~26 (Prismalin-14).liver, bowel, gill, muscle, mantle and gonad
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图 3 育珠贝与非育珠贝不同组织N19和Prismalin-14的表达差异
Figure 3. Expression differences of N19 and Prismalin-14 genes in different tissues of P.fucata (PC and NPC)
表 1 引物序列
Table 1 Sequences of primers designed in this study
引物primer 引物序列(5′→3′)sequences PCR引物 N19-F CGGAATTCATGGTGTCCCATGCTCACAT primer for PCR N19-R CCCAAGCTTCTACGGCTTACAGCAACGGT Prismalin-14-F CGGAATTCATGCGATCTCTGCTAGTCCT Prismalin-14-R CCCAAGCTTTTAATCATCAAATCCGCCAT Real-Time FQ-PCR引物 N19-F-RT[16-17] TGGCAACAAAGCAGTCATAACCG primer for Real-Time FQ-PCR N19-R-RT[16-17] GGCGTCGTTGTAGCATTGAAGG Prismalin-14-F-RT[17] CAATGCGATCTCTGCTAGTCC Prismalin-14-R-RT[17] ATAGGAGAAACGCGGGAAATA 18S rRNA-F-RT TGTCTGCCCTATCAACTTTC 18S rRNA-R-RT TGTGGTAGCCGTTTCTCA 
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