Effect of pearl culture on N19 and Prismalin-14 genes expression in the pearl oyster Pinctada fucata
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摘要:
为探讨育珠对壳基质蛋白基因表达的影响，开展了合浦珠母贝(Pinctada fucata)N19和Prismalin-14基因在育珠贝和非育珠贝中的荧光定量表达研究。结果显示，N19和Prismalin-14在育珠贝与非育珠贝的闭壳肌、肝胰脏、性腺、肠、鳃等组织中均无表达，在外套膜均有表达；N19在珍珠囊表达，而Prismalin-14则不表达。N19与Prismalin-14在育珠贝外套膜的表达量均大于非育珠贝，表明育珠可能对某些壳基质蛋白的表达具有一定的促进作用。其中Prismalin-14在育珠贝外套膜的表达量最高(P＜0.01)，是非育珠贝外套膜Prismalin-14的1.23倍，是育珠贝外套膜N19的25.04倍，是非育珠贝外套膜N19的41.04倍，推测在珍珠贝生长过程中，对Prismalin-14的需求量可能比N19大。N19在育珠贝珍珠囊中表达量最高(P＜0.01)，是育珠贝N19外套膜的11.58倍，是非育珠贝外套膜的18.97倍，推测在珍珠形成的过程中，对N19的需求量可能比贝壳自身生长对N19的需求量大。
Abstract:To investigate the effect of pearl culture on the expressions of genes encoding shell matrix proteins, the relative expression levels of N19 and Prismalin-14 genes in the pearl-culturing oysters (PC) and non-pearl-culturing oysters (NPC) Pinctada fucata were investigated by using RT-FQ-PCR. The results show that the expressions of both N19 and Prismalin-14 are extremely weak or negative in muscle, liver, gonad, bowel or gill of PC and NPC, but positive in the mantle. The expression of N19 is obviously in pearl sac, while of Prismalin-14 is negative. The expressions of both N19 and Prismalin-14 in PC mantle are higher than that in NPC, which indicate pearl culture may promote expressions of some shell matrix protein genes. The relative expression level of Prismalin-14 is the highest (P < 0.01) in PC mantle, which is 1.23-fold greater than that of NPC mantle, 25.04-fold greater than N19 in PC mantle, 41.04-fold greater than N19 in NPC mantle, suggesting that pearl oysters may demand much more Prismalin-14 than N19 does. Meanwhile, the relative expression level of N19 is the highest in the pearl sac (P < 0.01), being 11.58-fold greater than that of the PC mantle, 18.97-fold greater than that of the NPC mantle, suggesting that pearl growth may demand much more N19 than shell growth does.
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Keywords:
- shell matrix protein /
- RT-FQ-PCR /
- gene expression /
- pearl culture
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人工培育珍珠，是指用人为的方法将外套膜制成细胞小片后，与珠核一起移植到母贝体内。经过一段时间的生长，被移植的外套膜细胞小片的外侧上皮细胞逐渐生长形成有许多细胞质突起的星状或多角形细胞。这些细胞沿着珠核的表面移动并进行增殖，逐步将珠核包裹起来，进而形成珍珠囊[1]。珍珠和贝壳的珍珠层在结构上是相似的[2]，都是由外套膜或外套膜形成的珍珠囊分泌的壳基质蛋白诱导碳酸钙结晶而成，可通过壳基质蛋白基因的表达研究探讨珍珠的成因与质量的影响因素。目前，国内对珍珠培育的研究主要集中在育珠性状分析[3-4]、插核技术改良[5-6]方面，而珍珠养殖与贝壳形成相关的壳基质蛋白基因表达之间相互作用的研究很少见。
YANO等[7]在合浦珠母贝(Pinctada fucata)贝壳珍珠层中获得一种分子量约为19 kDa的碱性蛋白，并命名为N19。体外碳酸钙结晶试验表明，N19具有抑制碳酸钙结晶沉降的功能，推测其作为负调节因素参与生物矿化，与贝壳珍珠层形成有关。张立娟等[8]研究了外源生长激素与胰岛素样生长因子-Ⅰ处理对合浦珠母贝5种壳基质蛋白基因表达水平的影响，发现激素处理下，N19基因的表达水平下调，认为N19基因的表达受到激素调节通路的抑制作用。SUZUKI等[9-10]从合浦珠母贝贝壳棱柱层中分离得到Prismalin-14，其蛋白大小约为14 kDa，是一种极酸性蛋白。体外碳酸钙结晶试验表明，Prismalin-14能明显影响方解石晶体的表面结构，具有抑制碳酸钙结晶沉降及结合钙离子的功能。Prismalin-14是一种贝壳棱柱层的框架蛋白，与贝壳棱柱层形成有关[10]。TAKEUCHI和ENDO[11]、INOUE等[12-13]发现Prismalin-14在外套膜边缘区(ME)的表达量最大，而在核心区(MC)不表达。但育珠对壳基质蛋白基因N19和Prismalin-14在合浦珠母贝不同组织的表达有何影响尚未见报道。因此，开展育珠对壳基质蛋白基因表达的研究有助于了解影响珍珠养殖质量的内在因素。
1. 材料与方法
1.1 总RNA提取与cDNA合成
合浦珠母贝采集于广东徐闻，育珠贝和非育珠贝各3只，2组贝源自相同的种群，贝龄、性状和生长条件一致。解剖后取闭壳肌、肝胰脏、性腺、鳃、肠、外套膜组织(育珠贝增加珍珠囊组织)快速保存于TaKaRa Sample Protector，－80 ℃冻藏。按照Total RNA isolation NucleoSpin® RNAⅡ试剂盒(Macherey-Nagel)提取总RNA。利用Thermo NanoDrop 2000/2000c微量紫外分光光度计测定RNA浓度，计算光密度OD260/OD280确定RNA纯度，利用0.8%琼脂糖凝胶电泳检测RNA完整性。
cDNA合成按照PrimeSCript® RT reagent Kit With gDNA Eraser (Perfect Real Time)试剂盒(TaKaRa)进行。总RNA样品首先经去除基因组DNA处理：RNA 1μg，5×g DNA Eraser Buffer 2 μL，gDNA Eraser 1 μL，加RNase-free H2O至10 μL，42 ℃温育2 min，冰上冷却。后逆转录合成cDNA：5×PrimeSCript® Buffer 2 (for Real Time) 4 μL、RT Primer Mixture 1 μL、PrimeSCript® RT Enzyme MixⅠ1 μL和RNase-free H2O 4 μL，37 ℃反应15 min，85 ℃保温5 s。反转录产物置于－20 ℃保存备用。
1.2 N19、Prismalin-14基因组织表达的PCR检测
根据基因库(GenBank)提供的N19与Prismalin-14序列设计引物N19-F/N19-R和Prismalin-14-F/Prismalin-14-R(表 1)，引物由上海生工生物工程有限公司合成。以各组织的cDNA为模板，分别用引物N19-F/N19-R和Prismalin-14-F/Prismalin-14-R进行N19和Prismalin-14基因的组织表达差异分析。PCR反应体系为10 μL，包括10×Ex Taq Buffer 1 μL，dNTP Mixture (2.5 mmol · L-1) 0.2 μL，正、反向引物(10 μmol · L-1)各0.25 μL，Ex Taq DNA polymerase 0.05 μL，cDNA 0.25μL，RNase-free H2O 8 μL。反应程序为94 ℃预变性5 min，然后35个循环；94 ℃变性30 s，67.6 ℃(N19)/65.2 ℃(Prismalin-14)退火30 s，72 ℃延伸1 min。最后72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。用琼脂糖电泳对PCR产物进行检测。
表 1 引物序列Table 1. Sequences of primers designed in this study引物primer 引物序列(5′→3′)sequences PCR引物 N19-F CGGAATTCATGGTGTCCCATGCTCACAT primer for PCR N19-R CCCAAGCTTCTACGGCTTACAGCAACGGT Prismalin-14-F CGGAATTCATGCGATCTCTGCTAGTCCT Prismalin-14-R CCCAAGCTTTTAATCATCAAATCCGCCAT Real-Time FQ-PCR引物 N19-F-RT[16-17] TGGCAACAAAGCAGTCATAACCG primer for Real-Time FQ-PCR N19-R-RT[16-17] GGCGTCGTTGTAGCATTGAAGG Prismalin-14-F-RT[17] CAATGCGATCTCTGCTAGTCC Prismalin-14-R-RT[17] ATAGGAGAAACGCGGGAAATA 18S rRNA-F-RT TGTCTGCCCTATCAACTTTC 18S rRNA-R-RT TGTGGTAGCCGTTTCTCA 1.3 N19、Prismalin-14基因表达差异的Real-Time FQ-PCR分析
在预试验中发现18S rRNA在合浦珠母贝各组织中的表达量较GAPDH与β-actin稳定[14-15]，因此选用18S rRNA作为该试验的内参基因并设计引物，其余Real-Time FQ-PCR引物从其他文献中引用(表 1)。按照TaKaRa公司的SYBR® Premin Ex TaqTM (Tli RNaseH Plus)试剂盒说明书，分别用引物N19-F-RT/N19-R-RT和Prismalin-14-F-RT/Prismalin-14-R-RT(表 1)进行N19和Prismalin-14基因的荧光定量表达分析，反应体系为20 μL：2×SYBR® Premix Ex TaqTM 10 μL，正、反向引物(10 μmol · L-1)各0.4 μL，cDNA 1 μL，RNase-free H2O 8.2 μL。反应程序为95 ℃ 30 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，40个循环。采用相对定量CT法(2-ΔΔCT method)分析数据。CT为荧光信号达到阈值时的PCR扩增循环数，ΔCT为目的基因CT值与内参基因CT值的差值，将比较组中ΔCT最小的组作校正样标(笔者试验中所有组均以育珠贝外套膜Prismalin-14的ΔCT为校正样标)，ΔΔCT为各样品ΔCT与校正样标ΔCT的差值，最后求出2-ΔΔCT值，表示各样品表达量相对于校正样标的倍数。运用软件SPSS 19.0进行单因素方差分析(ANOVA)，选用LSD多重比较法分析各组间是否存在显著性差异(P＜0.05为差异显著，P＜0.01为差异极显著)。
2. 结果与分析
2.1 N19、Prismalin-14基因的组织表达谱
所提RNA经电泳检测结果可见清晰的28S rRNA和18S rRNA条带(图 1)，其中闭壳肌、肠和鳃样品中提取的RNA含量较少，肝胰脏、外套膜和珍珠囊提取的RNA含量较高。
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图 1 合浦珠母贝不同组织总RNAa.育珠贝；b.非育珠贝；M.DNA分子质量标准DL2000；1~7. 鳃、性腺、肠、肝胰脏、外套膜、珍珠囊、闭壳肌；8~13.肝胰脏、外套膜、鳃、闭壳肌、性腺、肠Figure 1. Total RNA extracted from P.fucata tissuesa. pearl-culturing oyster (PC); b. oyster without pearl-culture (NPC); M. DNA molecular weight marker (DL2000);1~7. gill, gonad, bowel, liver, mantle, pearl sac and muscle; 8~13. liver, bowel, gill, mantle, muscle and gonadN19与Prismalin-14基因在闭壳肌、肝胰脏、性腺、肠、鳃等组织中表达量极低乃至不表达，在外套膜均有表达。N19在育珠贝珍珠囊表达，Prismalin-14则不表达(图 2和图 3)。
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图 2 合浦珠母贝N19、Prismalin-14基因的组织表达谱[育珠贝(a、b)与非育珠贝(c、d)]M1~M2. DNA分子质量标准DL2000；M3~M4. DNA分子质量标准DL5000；B1~B4.空白对照；1~7(N19).珍珠囊、鳃、性腺、肠、肝胰脏、闭壳肌、外套膜；8~14(Prismalin-14).肝胰脏、肠、外套膜、鳃、珍珠囊、闭壳肌、性腺；15~20(N19).闭壳肌、性腺、鳃、肠、肝胰脏、外套膜；21~26(Prismalin-14).肝胰脏、肠、鳃、闭壳肌、外套膜、性腺Figure 2. The expression of N19 and Prismalin-14 genes in different tissues of P.fucata [PC(a, b) and NPC(c, d)]M1~M2. DNA molecular weight marker (DL2000);M3~M4. DNA molecular weight marker (DL5000);B1~B4. blank control group; lane 1~7 (N19): pearl sac, gill, gonad, bowel, liver, muscle and mantle; lane 8~14 (Prismalin-14). liver, bowel, mantle, gill, pearl sac, muscle and gonad; lane 15~20 (N19). muscle, gonad, gill, bowel, liver, and mantle; lane 21~26 (Prismalin-14).liver, bowel, gill, muscle, mantle and gonad![]()
图 3 育珠贝与非育珠贝不同组织N19和Prismalin-14的表达差异Figure 3. Expression differences of N19 and Prismalin-14 genes in different tissues of P.fucata (PC and NPC)2.2 N19、Prismalin-14 mRNA的荧光定量表达差异
实时荧光定量PCR结果显示，试验重复性良好，Tm值与预期一致，表明反应体系和条件都得到很好的优化。同时，PCR扩增结束后所得的溶解曲线为单峰，无杂峰，表明试验无污染，引物的特异性高，Real-Time FQ-PCR的验证结果可信。
育珠贝Prismalin-14 mRNA在外套膜的表达量最高，是非育珠贝Prismalin-14的1.23倍，差异极显著(P＜0.01)，是育珠贝珍珠囊N19表达量的2.16倍，是育珠贝外套膜N19的25.04倍(P＜0.01)，是非育珠贝外套膜N19的41.04倍。育珠贝珍珠囊N19的表达量为外套膜N19的11.58倍(P＜0.01)，是非育珠贝外套膜N19表达量的18.97倍；育珠贝外套膜N19的表达量是非育珠贝的1.64倍。非育珠贝外套膜Prismalin-14表达量是N19的33.30倍(P＜0.01)。
3. 讨论
笔者试验中育珠贝与非育珠贝的闭壳肌、肝胰脏、性腺、肠、鳃等组织中N19和Prismalin-14的表达量极低，可看作均无表达，与SUZUKI等[9]用Northern杂交及原位杂交结果一致。在育珠贝中，N19与Prismalin-14基因在外套膜组织中的表达量均大于非育珠贝，表明育珠可能对某些壳基质蛋白的表达具有一定的促进作用。但不管育珠贝还是非育珠贝，N19 mRNA在外套膜的表达量均远小于Prismalin-14，表明珍珠贝在生长过程中对Prismalin-14的需求量可能比N19大。Prismalin-14是棱柱层特有的壳基质蛋白基因，N19是珍珠层特有的壳基质蛋白基因，且在贝壳的组成中，棱柱层较珍珠层所占比重大，这2个基因表达水平的差异可能与棱柱层和珍珠层在贝壳所占比重的不同有关。ZHANG等[17]在研究壳基质蛋白基因与贝壳生长性状的关系时发现，Prismalin-14在体积大的贝壳中的表达量相应较高，而N19的表达量与壳高壳质量呈负相关，认为棱柱层基质蛋白基因与贝壳的长度大小(延伸)有关，而珍珠层壳基质蛋白基因主要与贝壳的厚度有关[17-18]。表明棱柱层基因的表达量高低可能是珍珠贝壳生长的重要限制性因素。但壳基质蛋白基因的表达水平与贝壳生长之间的关系、作用机制还有待进一步研究。
N19基因与珍珠质的形成及其质量密切相关。在育珠贝中，N19基因在珍珠囊中的表达量显著高于外套膜，是其外套膜表达量的11.58倍(P＜0.01)，是非育珠贝外套膜的18.97倍(P＜0.01)。表明珍珠形成过程中对N19的需求量比贝壳自身生长的需求量大得多，与WANG等[16]结果一致。WANG等[16]研究了包括N19在内的6种壳基质蛋白基因在外套膜与珍珠囊中的表达差异，发现仅有N19基因在珍珠囊中的表达量显著大于外套膜，表明N19可能对珍珠的形成具有重要作用，但其作用机理还有待进一步研究。而珍珠的品质与珍珠囊壳基质蛋白基因的表达差异[13, 19-20]和珍珠的结构组成[21-24]有着非常密切的关系。低品质珍珠(LP)由珍珠层与棱柱层组成，相比之下，高品质珍珠(HP)只有珍珠层[19, 21]。对于光泽较好的珍珠而言，棱柱层仅出现于珍珠的核心区域，其近表面区域未发现有类似的棱柱结构[21-24]。因此，珍珠质形成基因的高表达与棱柱层形成基因的低表达有利于提高珍珠的品质[13, 19]。笔者在采样开贝时也发现所产的珍珠品质都很好，而结果也显示珍珠囊N19大量表达而Prismalin-14没有表达，证明珍珠质形成相关基因的高表达和棱柱层形成相关基因的不表达确实有利于高品质珍珠的形成。但壳基质蛋白基因的表达水平与珍珠品质之间的关系、作用机制还有待进一步研究。在外套膜小片形成珍珠囊的过程中，棱柱层形成相关基因的表达是如何被关闭的也值得深入研究。如果能找到抑制棱柱层形成相关基因表达的机制或物质，在插核过程中对外套膜细胞小片进行预处理，将对提高养殖珍珠的品质具有重要作用。
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图 1 合浦珠母贝不同组织总RNA
a.育珠贝；b.非育珠贝；M.DNA分子质量标准DL2000；1~7. 鳃、性腺、肠、肝胰脏、外套膜、珍珠囊、闭壳肌；8~13.肝胰脏、外套膜、鳃、闭壳肌、性腺、肠
Figure 1. Total RNA extracted from P.fucata tissues
a. pearl-culturing oyster (PC); b. oyster without pearl-culture (NPC); M. DNA molecular weight marker (DL2000);1~7. gill, gonad, bowel, liver, mantle, pearl sac and muscle; 8~13. liver, bowel, gill, mantle, muscle and gonad
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图 2 合浦珠母贝N19、Prismalin-14基因的组织表达谱[育珠贝(a、b)与非育珠贝(c、d)]
M1~M2. DNA分子质量标准DL2000；M3~M4. DNA分子质量标准DL5000；B1~B4.空白对照；1~7(N19).珍珠囊、鳃、性腺、肠、肝胰脏、闭壳肌、外套膜；8~14(Prismalin-14).肝胰脏、肠、外套膜、鳃、珍珠囊、闭壳肌、性腺；15~20(N19).闭壳肌、性腺、鳃、肠、肝胰脏、外套膜；21~26(Prismalin-14).肝胰脏、肠、鳃、闭壳肌、外套膜、性腺
Figure 2. The expression of N19 and Prismalin-14 genes in different tissues of P.fucata [PC(a, b) and NPC(c, d)]
M1~M2. DNA molecular weight marker (DL2000);M3~M4. DNA molecular weight marker (DL5000);B1~B4. blank control group; lane 1~7 (N19): pearl sac, gill, gonad, bowel, liver, muscle and mantle; lane 8~14 (Prismalin-14). liver, bowel, mantle, gill, pearl sac, muscle and gonad; lane 15~20 (N19). muscle, gonad, gill, bowel, liver, and mantle; lane 21~26 (Prismalin-14).liver, bowel, gill, muscle, mantle and gonad
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图 3 育珠贝与非育珠贝不同组织N19和Prismalin-14的表达差异
Figure 3. Expression differences of N19 and Prismalin-14 genes in different tissues of P.fucata (PC and NPC)
表 1 引物序列
Table 1 Sequences of primers designed in this study
引物primer 引物序列(5′→3′)sequences PCR引物 N19-F CGGAATTCATGGTGTCCCATGCTCACAT primer for PCR N19-R CCCAAGCTTCTACGGCTTACAGCAACGGT Prismalin-14-F CGGAATTCATGCGATCTCTGCTAGTCCT Prismalin-14-R CCCAAGCTTTTAATCATCAAATCCGCCAT Real-Time FQ-PCR引物 N19-F-RT[16-17] TGGCAACAAAGCAGTCATAACCG primer for Real-Time FQ-PCR N19-R-RT[16-17] GGCGTCGTTGTAGCATTGAAGG Prismalin-14-F-RT[17] CAATGCGATCTCTGCTAGTCC Prismalin-14-R-RT[17] ATAGGAGAAACGCGGGAAATA 18S rRNA-F-RT TGTCTGCCCTATCAACTTTC 18S rRNA-R-RT TGTGGTAGCCGTTTCTCA 
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期刊类型引用(6)
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