Effects of trophic elements and pH on growth rate and lipid productivity of Chlorella zofingiensis cells
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摘要:
以若夫小球藻(Chlorella zofingiensis)为研究对象，考察了不同的营养方式(自养、混养、异养)，不同的氮源、磷(P)质量浓度和pH对其生长和油脂积累的影响。结果表明，若夫小球藻在混合营养方式下藻体质量浓度及油脂质量分数明显高于自养与异养方式，以蔗糖为碳源的混合营养方式下若夫小球藻总脂质量浓度最高(3.14 g · L-1)，分别是自养和异养的4.6和5.0倍。以尿素为氮源时若夫小球藻总脂质量浓度最高(0.79 g · L-1)。在一定范围内增加P质量浓度能提高若夫小球藻总脂质量浓度，其最适P质量浓度为7.0~14.0 mg · L-1。人为改变培养液的pH对若夫小球藻细胞生长影响较大，若夫小球藻能够在pH 4.5~9.5范围内生长，超出此范围时细胞很快裂解死亡。
Abstract:We investigated the biomass productivity and lipid content in Chlorella zofingiensis under different trophic modes (autotrophic, mixotrophic and heterotrophic), with different nitrogen, concentration of phosphorus and pH. The results indicate that the biomass productivity and lipid content of C.zofingiensis under mixotrophic cultivation are higher than that of under autotrophic and heterotrophic cultivation. The lipid productivity of C.zofingiensis is 3.14 g · L-1 under mixotrophic cultivation with sucrose, which is 4.6 and 5.0 folds of those obtained under autophototrophic and heterotrophic conditions. The maximum lipid productivity is 0.79 g · L-1with CON2H4 as nitrogen source. The lipid productivity of C.zofingiensis increases with K2HPO4 concentration at 0~80 mg · L and optimum concentration of phosphorus is 7.0~14.0 mg · L-1. In addition, different pH values have great influence on the growth of C.zofingiensis cells, which live in pH from 4.5 to 9.5, while die soon when pH exceeds this range.
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Keywords:
- Chlorella zofingiensis /
- trophic modes /
- nitrogen sources /
- concentration of phosphorus /
- pH /
- lipid productivity
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虾夷扇贝Patinopecten yessoensis隶属于软体动物门，瓣鳃纲，异柱目，扇贝科，属冷水性贝类，主要分布于俄罗斯萨哈林岛、千岛列岛、日本北海道及本州岛北部和朝鲜半岛北部等纬度较高的海区[1]。自1979年从日本引入中国，现已成为中国北方海域海水贝类的主要养殖对象，并取得了很高的经济效益和社会效益[2]。目前，虾夷扇贝在中国南方养殖以引入大规格贝苗暂养为主，主要原因是南方海区水域的水温较高，在这方面笔者已有研究报道[3]。为了探索养殖密度与生长的关系，以及适宜的养殖密度，为今后南方海区开展虾夷扇贝养殖提供参考依据，此文开展了养殖密度对虾夷扇贝生长影响的研究，而目前关于这方面的研究只见少量零星的报道[2, 4-5]。
1. 材料与方法
1.1 试验地点及理化条件
试验地点位于浙江南麂列岛马祖岙口海区，岙口西北朝向，底质为泥质，大干潮4~10 m，流速0.26 m·s-1。海区多年平均水温18.8℃，试验期间水温10.4~23.3℃，平均16.7℃，多年平均盐度为30.2。全年溶解氧含量4.56~9.71 mL·L-1，pH 7.98~8.36。
1.2 试验材料及试验设计
试验虾夷扇贝贝苗来源于山东烟台，个体平均壳高6.14±0.46 cm，平均体质量31.08±5.72 g。养殖方式为延绳式挂笼养殖，养殖笼是由网目1.0 cm的网片与塑料网盘构成的圆柱型结构，直径30 cm，共10层，层高12 cm。试验设计D1、D2及D3 3个密度组，养殖密度分别为5、10和15 ind·层-1，每组设3个平行试验笼(表 1)，各组之间平均壳高与体质量无显著差异，挂养于同一浮绠上。试验从2003年3月12日开始至6月21日结束，试验周期102 d。
表 1 养殖密度试验设计Table 1. Experiment design of stocking density组别 treatment class 试验笼号 trial cage sign D1 D2 D3 1 2 3 7 8 9 10 11 12 养殖密度/ind·层-1 stocking density 5 5 5 10 10 10 15 15 15 数量/ind quantity 50 50 50 100 100 100 150 150 150 1.3 测量及数据处理
每隔20 d取样测量一次，试验开始时、结束时及结束前一次每笼全部取样，其他阶段固定取样1、3、5、7和9层全部样品，同时记录死亡量，刮去附着物阴干0.5 h，用游标卡尺测量其壳高，用电子天秤称其体质量后放回原笼原层，死亡不补。对所测得的数据采用Excel 2003进行处理，通过方差分析进行显著性检验，用Duncan检验法进行多重比较，P＜0.05为显著，P＜0.01为极显著。所用估计参数如下：
相对壳高生长率(relative growth rate of shell height，GRH)=100× (SHt-SH0)/SH0；
相对体质量生长率(relative growth rate of body mass，GRM)=100× (BMt-BM0)/BM0；
日增壳高(daily shell height gain，DHG)=(SHt-SH0)/t；
日增体质量(daily body mass gain，DMG)=(BMt-BM0)/t；
特定生长率(specific growth rate，SGR)=100× (ln Xt-ln X0)/t；
LE CREN相对状态指数[6](relative condition factor，RCF)=BM/aSHb。
式中SH0和BM0表示开始时的壳高(cm)和体质量(g)；SHt和BMt表示结束时的壳高与体质量；t表示生长时间(d)，X表示壳高或体质量，a和b表示壳高与体质量的关系系数。
线型统计模型(linear statistical model)
Xijk=μ+αi+βj+(α+β)ij+εijk
Xijk某一受测生长性状(壳高、体质量和相对状态指数)来自第i个养殖密度(固定因素)，第j个生长时间(随机因素)，第k个观测值，μ表示常数项，αi养殖密度对生长性状的影响，βj生长时间对生长性状的影响，(α+β)ij表示养殖密度与生长时间对生长性状的交互影响，εijk表示随机观测误差。
2. 结果
2.1 养殖密度对生长参数的影响
通过单因素方差分析(表 2)，结果显示养殖密度对壳高及体质量生长产生极显著影响(P＜0.01)，壳高和体质量及其各参数均随养殖密度提高而降低；多重分析结果表明，D1与D2只有结束时的壳高、体质量及日增壳高存在显著差异(P＜0.05)，其他各生长参数均无显著差异(P＞0.05)；D2与D3除结束时壳高、相对壳高生长率、日增壳高及壳高特定生长率外，其余各生长参数均存在显著差异(P＜0.05)；D1与D3各生长参数均存在极显著差异(P＜0.05)。另外，通过养殖密度与生长时间双因素方差分析(表 3)，结果表明，壳高与体质量随生长时间推移，生长极显著(P＜0.01)，同时受到养殖密度极显著影响(P＜0.01)。
表 2 各密度组生长参数(平均值±标准差)Table 2. Growth parameters at different stocking density (Mean±SD)组别 treatment class D1 D2 D3 开始时壳高/cm SH of initial stage 6.25a±0.11 6.14a±0.11 6.11a±0.11 开始时体质量/g BM of initial stage 32.82a±1.45 30.26a±0.84 31.04a±1.84 结束时壳高/cm SH of terminate stage 7.27a±0.12 6.88b±0.10 6.78b±0.10 结束时体质量/g BM of terminate stage 55.66a±2.96 51.00b±1.72 46.10c±1.30 相对壳高生长率/% GRH 16.45a±1.86 12.07ab±1.91 10.89b±3.46 相对体质量生长率/% GRM 69.71a±9.33 68.61a±7.59 48.95b±11.25 日增壳高/cm·d-1 DHG 0.0101a±0.0011 0.0073b±0.0011 0.0065b±0.0020 日增体质量/g·d-1 DMG 0.22a±0.03 0.20a±0.02 0.15b±0.03 壳高特定生长率/% SGRSH 0.15a±0.02 0.11ab±0.02 0.10b±0.03 体质量特定生长率/% SGRBM 0.52a±0.05 0.51a±0.04 0.41b±0.04 注：同一行中参数上方字母不同代表有显著性差异(P＜0.05)，相同则无显著性差异(P＞0.05)。后同。
Note：Different letters on the parameters in the same row mean significant differences(P＜0.05)；same letters mean insignificant difference(P＞0.05).The same as below.表 3 壳高与体质量双因素方差分析Table 3. Two-factor analysis of variance for stocking density and growth time方差来源
source of variancedf 壳高 shell height 体质量 body mass SS MS F SS MS F 养殖密度 stocking density 2 0.5617 0.2809 23.7098** 129.86 64.93 16.89** 生长时间 growth time 5 3.0617 0.6123 51.6867** 1 488.84 297.77 159.94** 交互影响 interaction 10 0.1185 0.0118 0.9999 38.43 3.84 2.06 误差 error 18 0.2133 0.0118 33.51 1.86 总和 total 35 3.9552 1 690.64 注：* *. 显著差异
Note：* *. significant difference2.2 不同养殖密度生长趋势
虾夷扇贝壳高在前期与后期生长较缓慢，中期生长较快，与生长时间呈显著的“S”型逻辑斯谛生长曲线，反映出了此海区在前期由于水温低和饵料匮乏，后期水温升高接近虾夷扇贝的生理极限，生长均缓慢。各组壳高与生长时间的关系分别为SH1=8.3613/(e-1.0830-0.0069t+1) (R2=0.9757)，SH2=7.6059/(e-1.4293-0.0069t+1) (R2=0.9747)，SH3=7.4744/(e-1.5033-0.0062t+1) (R2=0.9740)。而体质量随生长时间的推移呈极显著的指数函数曲线，各组体质量与生长时间关系分别为BM1=32.2480e0.0054t (R2=0.9957)，BM2=30.3170e0.0050t(R2=0.9977)，BM3=30.6740e0.0041t (R2=0.9923)。各密度组的壳高与体质量生长趋势线明显随养殖密度提高呈降次排列，表明同样的生长时间，养殖密度越大壳高生长越慢(图 1和图 2)。
各组体质量与壳高比随生长时间的推移不断增大，变化极显著(P < 0.01)，表明了体质量生长快于壳高，两者生长不同步。整个试验过程中同时受到养殖密度影响极显著(P < 0.01)，在4月份之前，各组体质量与壳高比无显著差异，而在此之后，各组产生显著差异，明显随养殖密度的提高而下降(表 4)，反映出相同的壳高，养殖密度越高体质量越小。
表 4 各生长阶段的体质量与壳高比(平均值±标准差)Table 4. Ratio of body mass to shell height at different growth stages(Mean±SD)生长阶段
growth stage体质量/壳高 BM/SH D1 D2 D3 2003-03-12 5.14a±0.20 5.12a±0.22 5.14a±0.26 2003-04-01 5.55a±0.04 5.47a±0.01 5.33a±0.03 2003-04-20 6.11a±0.21 5.85ab±0.07 5.66b±0.04 2003-05-10 6.54a±0.06 6.14b±0.004 6.16b±0.04 2003-05-30 6.93a±0.22 6.54b±0.18 6.30b±0.13 2003-06-21 7.49a±0.08 7.39a±0.18 6.89b±0.14 2.3 养殖密度与死亡率关系
在整个试验过程中，总平均死亡率达33.20%，其中D1、D2和D3平均死亡率分别为34.00%、26.00%和36.67%(表 5)。死亡主要集中于5月下旬之后，在此之前死亡率只有12.33%。多重比较分析结果显示，只有在2003年5月30日，D2与D3之间有显著差异(P＜0.05)，其余均无显著差异(P＞0.05)。到6月21日，各组之间出现了很大误差(χ2=12.91＞χ22, 0.01)，导致死亡率无显著差异，此时海区水温已上升至23℃以上，接近虾夷扇贝生理极限，死亡率大增，海区水温升高是造成死亡的主因。
表 5 各阶段死亡率(平均值±标准差)Table 5. Mortality at different stages(Mean±SD)阶段
stage累积死亡率/% accumulated mortality D1 D2 D3 2003-04-01 0a 0a 2.00a±2.83 2003-04-20 2.00a±2.83 2.00a±2.83 5.33a±5.66 2003-05-10 14.00a±2.83 9.00a±4.24 14.00a±5.66 2003-05-30 22.00ab±4.00 15.67a±3.51 26.33b±4.16 2003-06-21 34.00a±5.29 26.00a±10.15 36.67a±13.92 2.4 养殖密度对相对状态指数的影响
通过双因素方差分析(图 3)，5月份前养殖密度对相对状态指数变化无显著影响(P＞0.05)，但生长时间对其影响极显著(P＜0.01)，表明相对状态指数随着生长时间的推移不断变化，整个过程相对状态指数在0.89~1.16之间波动，在5月份前相对状态指数不断增大，反映虾夷扇贝随性腺发育不断积累营养物质的过程；到了5月份各组变化均不显著，此时刚好是精卵大量排放期，相对状态指数保持平衡；6月份之后，此时虾夷扇贝精卵已排放完毕，恢复了体质量生长，又出现一回升现象。通过单因素分析，养殖密度只对6月份的相对状态指数有极显著影响(P＜0.01)，D2居最高位，平均1.16±0.01，D3和D1分居次、末位，平均分别为1.10±0.02和1.08±0.03，D2分别与D1和D3存在显著差异(P＜0.05)，而D1与D3无显著差异(P＞0.05)，结果表明，养殖密度对相对状态指数产生影响只在精卵排放之后恢复体质量生长阶段。
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图 3 不同养殖密度LE CREN相对状态指数变化注：a=0.3590，b=2.4955；同一日期内柱型上字母不同表示有显著差异(P＜0.05)，否则无差异(P＞0.05)Figure 3. Changes of LE CREN-RCF at different stocking densityNote: a=0.3590, b=2.4955;Different letters on the columns on the same date mean significant differences (P < 0.05); same letters mean insignificant difference (P > 0.05).3. 讨论
3.1 养殖密度对生长和死亡的影响
养殖密度是养殖水生动物生长快慢的关键因素之一，前人在这方面也开展了不少的工作，如国内学者研究了养殖密度对泥螺(Bullacta exarata)[7]、西施舌(Coelomactra antiquata)稚贝[8]、凡纳滨对虾(Penaeus vannamei)[9]、细鳞鱼(Brachymastax leno)稚鱼[10]和地图鱼(Astronotus oceuatus)幼鱼[11]等生长的影响。此研究所测定的生长指标壳高和体质量，养殖密度对其影响显著，对进一步统计分析具有实际意义。随养殖密度的提高，各项生长参数不断下降，生长变得缓慢，这与已有的生产实际结果[2, 4]相符，也与邵邻相等[11]、庄平等[12]、李玉全等[13]和刘德经等[8]在其他鱼、虾和贝中的研究结果相一致。
虾夷扇贝壳高随生长时间呈“S”型逻辑斯谛生长曲线，体质量随生长时间呈指数生长曲线，两者均随养殖密度提高呈下降趋势。在前期与后期壳高呈缓慢生长，中期呈快速生长，反映了壳高生长与水温的密切关系，虾夷扇贝最适生长的水温范围为17.1~20.3℃，14.1~17.1℃次之[3]，前期与后期均在最适范围之外，因此生长缓慢。体质量比壳高生长更明显，造成了体质量与壳高比随生长时间推移不断升高。在相同的条件下，养殖密度的提高，等于增加了单位空间内存活个体对饵料的竞争，每个个体得到的饵料数量减少了，因而影响了生长[2]。另一方面，与壳高相比，体质量受饵料影响更明显，从而造成了养殖密度越高，体质量与壳高比越小。
另一反映壳高与体质量关系性状的相对状态指数是表征动物的生理或营养状况的形态生理指数[14]，国内一般将这类形态生理指标称之为肥满度[15]。双壳贝类肥满度测量定方法很多[16-18]，目前一般用软体部的干重(干肉重)与壳干重的比值或用软体部体质量与壳腔容积比值的百分数来表示[19-22]。为了不伤害研究对象，此研究采用相对状态指数，已能反映出形态生理变化关系。从变化结果来看，身体状况指数在5月性成熟前呈现出随营养成分大量积累不断上升，到5月底精卵大量排放后，相对状态指数保持平衡，虾夷扇贝南麂海区性腺成熟期与灵昆岛橄榄蚶(Estellarca olivacea)[19]和乐清泥蚶(Tegillarca granosa)[20]相比，分别提早了2个月和1个月，与养马岛紫彩血蛤(Mutallia olivacea)[22]较一致。到了6月份相对状态指数又迅速回升，养殖密度对其产生了极显著的影响，D2大于另外2组，极有可能表明低密度组个体较大，高密度组受到了局部初级生长力的限制，影响了营养物质的吸收[4]。因此，选择适宜的养殖密度有利于提高收获季节的相对状态指数，从而提高养殖产量。
一般认为养殖密度过高，死亡率增加[2, 4, 23-24]。此研究所选用的几个养殖密度在试验结束时对死亡率无显著影响(P＞0.05)，这与海区水温接近虾夷扇贝生理极限、误差效应很大而养殖密度效应未体现出来有关。但在此之前的5月30日，D2与D3之间存在显著差异，表明了15 ind·层-1的养殖密度已超出极限值。
3.2 养殖密度的确定
养殖密度是否适宜，直接关系虾夷扇贝的养殖效益。虾夷扇贝最高正常生长水温只有23.8℃，而南麂海区水温在6月底就超过这个值[3]，因此，在南方海区养殖虾夷扇贝只能以引入大规格贝苗进行暂养殖。选择适宜的养殖密度，保持较高的生长速度与相对状态指数及较低的死亡率是提高产量与效益的有效办法之一。根据研究结果显示，D3的死亡率显著高于D2，而相对状态指数、体质量及其各生长参数均显著低于D2，此外，各生长趋势也都在D2之下，表明了10 ind·层-1养殖密度明显好于15 ind·层-1。D1与D2相比，除结束时的壳高与体质量及日增壳高存在显著差异外，其余生长参数及死亡率均无显著差异；此外，在收获季节(在南麂海区一般为6月中旬之前)，D2相对状态指数显著高于D3，同时D2有更高的养殖器材利用率，显然10 ind·层-1好于5 ind·层-1。分析结果表明，10 ind·层-1是适宜的养殖密度，与张景山[5]认为在直径34 cm的网盘上二次倒笼10 ind·层-1，一次性分苗8 ind·层-1的结论较相符。当然，适宜养殖密度的确定不是一个简单的问题，正如刘永峰等[25]在海湾扇贝筏式笼养不同放养密度试验中指出的，个体生长潜力的发挥不仅仅由放养密度所支配，影响个体生长的因素众多，如养殖海区的初级生产力水平、水温、流水是否通畅、养成期的长短、养殖器材的透水性以及各年份间的差异等等，此外，还要考虑肉柱规格和单价等问题，此文未做深入的研究，因此，确定合理放养密度必须注意因地制宜，不可生搬硬套。
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图 1 营养方式对若夫小球藻生长的影响
Figure 1. Effects of different trophic modes on the growth of C.zofingiensis
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图 2 不同氮源对若夫小球藻生长的影响
Figure 2. Effects of different nitrogen sources on the growth of C.zofingiensis
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图 3 磷质量浓度对若夫小球藻生长的影响
Figure 3. Effects of different concentration of phosphorus on the growth of C.zofingiensis
表 1 不同营养方式下若夫小球藻细胞藻体质量浓度、油脂质量分数和总脂质量浓度
Table 1 Biomass productivities, lipid contents and lipid productivities of C.zofingiensis cells in different trophic modes
碳源 carbon sources ρ(藻体)/g·L-1 biomass productivity w(油脂)/% lipid content ρ(总脂)/g·L-1 lipid productivity 葡萄糖 glucose 6.1 44.4 2.71 蔗糖 sucrose 7.2 43.6 3.14 甘氨酸 glycine 2.6 39.0 1.01 乙酸钠 sodium acetate 6.8 31.4 2.14 自养 autotrophic 2.3 29.9 0.69 异养(葡萄糖) heterotrophic(glucose) 3.6 34.4 1.24 异养(蔗糖) heterotrophic(sucrose) 1.6 39.2 0.63 
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表 2 不同氮源下若夫小球藻细胞藻体质量浓度、油脂质量分数和总脂质量浓度
Table 2 Biomass productivities, lipid contents and lipid productivities of C.zofingiensis cells in different nitrogen sources
氮源 nitrogen source ρ(藻体)/g·L-1 biomass productivity w(油脂)/% lipid content ρ(总脂)/g·L-1 lipid productivity 硝酸钠 NaNO3 2.0 34.6 0.69 氯化铵 NH4Cl 1.0 27.6 0.28 尿素 CO(NH2)2 2.2 35.9 0.79 空白 blank control 1.1 39.1 0.43
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表 3 不同磷质量浓度下若夫小球藻细胞藻体质量浓度、油脂质量分数和总脂质量浓度
Table 3 Biomass productivities, lipid contents and lipid productivities of C.zofingiensis cells in different concentration of phosphorus
ρ(P)/mg·L-1 ρ(藻体)/g·L-1 biomass productivity w(油脂)/% lipid content ρ(总脂)/g·L-1 lipid productivity 0 1.4 33.9 0.47 3.5 1.8 37.7 0.69 7.0 2.2 35.6 0.78 14.0 2.4 40.6 0.97
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表 4 不同pH下若夫小球藻细胞藻体质量浓度、油脂质量分数和总脂质量浓度
Table 4 Biomass productivities, lipid contents and lipid productivities of C.zofingiensis cells in different pH
pH ρ(藻体)/g·L-1 biomass productivity w(油脂)/% lipid content ρ(总脂)/g·L-1 lipid productivity 10.0 细胞死亡 细胞死亡 细胞死亡 9.5 0.9 37.3 0.34 4.5 1.2 39.1 0.47 4.0 细胞死亡 细胞死亡 细胞死亡 对照(7.0~8.5) blank control 7.6 42.5 3.23
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