Immune response of enzymes activities in Penaeus monodon serum with WSSV in latent period on reinfection
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摘要:
用含3×103 拷贝·mL-1、6×102 拷贝·mL-1和2×102 拷贝·mL-1的对虾白斑综合征病毒(white spot syndrome virus，WSSV)粗提液和PBS液(对照)注射感染病毒携带量约1×105 拷贝·g-1的斑节对虾(Penaeus monodon)，分别于第15分钟、第30分钟、第1小时、第3小时、第6小时、第12小时、第24小时、第48小时、第72小时取样，研究了WSSV感染对斑节对虾血清内酸性磷酸酶(acid phosphatase，ACP)、碱性磷酸酶(alkaline phosphatase，AKP)、酚氧化酶(phenoloxidase，PO)、过氧化物酶(peroxidase，POD)和超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)活性的影响。结果表明，在3种感染浓度下ACP、AKP、SOD活性总体呈现先上升后下降随后上升的趋势，其中SOD活性后期水平显著高于初期；PO、POD活性总体呈现先下降后上升随后下降最后上升的趋势，但PO后期活性水平与初期相当，而POD后期活性水平显著高于初期。各免疫相关酶的反应强度与WSSV的感染浓度存在一定关系，除ACP外其余4种酶的活性变化均以6×102拷贝·mL-1浓度组最为敏感。PBS组5种免疫酶活性变化幅度均显著小于3种WSSV浓度感染组。
Abstract:We studied the responses of 5 immuno-enzymes [acid phosphatase (ACP), alkaline phosphatase (AKP), phenoloxidase (PO), peroxidase (POD), superoxide dismutase (SOD)] activities in serum of Penaeus monodon (with 1×105 copies·g-1 WSSV) to the injection with crude WSSV solution containing 3×103 copies·mL-1, 6×102 copies·mL-1 and 2×102 copies·mL-1 virus and PBS at 15th minute, 30th minute, 1th hour, 3th hour, 6th hour, 12th hour, 24th hour, 48th hour, 72th hour. The activities of ACP, AKP and SOD first increased then decreased and then increased in the 3 groups of WSSV infection, while SOD activity was higher than the initial level significantly; the activities of PO and POD first decreased then increased then decreased and finally increased in the 3 groups of WSSV infection; the PO activity in later and earlier periods were equally the same, but POD activity was higher than the initial level significantly. The reactions of immuno-enzymes are related with the infection concentrations of WSSV, and the most sensitive changes of 4 enzymes activities except acid phosphatase are in the 6×102 copies·mL-1 WSSV group. The range of variation in the PBS group is smaller than that of 3 groups of WSSV infection.
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Keywords:
- Penaeus monodon /
- WSSV /
- latent infection /
- reinfection /
- immune response
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养殖病害一直是对虾产业中的突出问题，近5年来早期死亡综合症(early mortality syndrome，EMS)、白斑综合征等恶性对虾病害肆虐各国养虾业，形势异常严峻[1]。华南沿海是中国的对虾养殖主产区，但2010年以来对虾严重减产，养殖成活率极低[2]。反观同期选择鱼虾混养模式的养殖者，却大多取得较高的成功率和收益，其配养品种包括草鱼(Ctenopharyngodon idellus)、黄颡鱼(Pelteobagrus fulvidraco)、尼罗罗非鱼(Oreochromis niloticus)等[3]，因此近2年来鱼虾混养模式在珠三角地区的关注度越来越高。鲻(Mugil cephalus)是一种广温广盐性鱼类，具有肉质鲜美、病害少、生长快的优点，素有“底泥清道夫”之称，常以下颌刮食底泥表面的低等藻类和有机碎屑，池塘中适当搭配一定数量的鲻有利于减少有机物浓度，改善水质[4-6]。
然而，就凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)与鲻混养模式而言，多为鱼虾直接接触式混养，未能对鱼虾混养方式及混养搭配比例作深入探讨，相关研究也缺乏系统性。虾池混养少量鲻虽可以减少和消除对虾残饵，但是经济效益增幅不明显；反之如果混养鲻数量过多，鲻就会与对虾争抢饲料，影响对虾养殖效益。有鉴于此，该研究针对传统对虾精养池塘中央区域空间利用率低、有机物积累难去除的问题，在池塘中构建围网，开展新型对虾-鲻网围分隔式混养模式探索，以增强鱼虾混养的优势，提高对虾养殖的成功率。文章综合评估该模式的经济与生态效益，可为混养模式优化和推广应用提供一定的参考依据。
1. 材料与方法
1.1 试验池塘与放养情况
试验于2012年5月~8月在茂名市电白冠利达科技生物养殖有限公司养殖场(21°32′35″ N，111°23′05″ E)进行。养殖池塘面积平均为3 330 m2，平均水深1.5 m，池塘内2台水车式增氧机呈对角分布。从养殖场随机挑选3个区域，每个区域内各有4口池塘(即4个不同的处理组)呈连片分布，不同处理组在上述3个区域内各设置1个重复。每个池塘进排水系统结构相同且各自独立。各组中凡纳滨对虾放养密度均为90尾·m-2，平均规格为0.8 cm·尾-1；而各组池塘内鲻放苗量则依次为0尾(M0)、250尾(M250)、500尾(M500)和800尾(M800)，平均规格为0.3 kg·尾-1，其中M0为对照组。放养鲻的各池塘中均搭建长方形围网(围网内水面约为800 m2)，鲻均放养于围网之内，围网的网孔为方形，规格约2.5 cm×2.5 cm，对虾能自由出入网孔，而鲻则不能，围网的上边缘平齐于增氧机引起的池塘水流的内圈切线。另外，每个池塘围网外放养平均体质量为0.4 kg的埃及革胡子鲶(Clarias leather)150尾。池塘养殖现场效果见图 1。各试验池塘于2012年5月8日清塘，放苗及收获时间见表 1。各组投喂饲料为“粤海”牌凡纳滨对虾饲料。
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图 1 对虾-鲻围网分隔混养现场效果图Figure 1. Real scene shooting of mesh enclosure isolated white shrimp-common mullet pond表 1 各处理组放苗及收获时间Table 1. Stocking time and harvest time for different treatments处理组
treatment池塘
pond No.对虾 L.vannamei 鲻 M.cephalus 放苗日期
stocking time收获日期
harvest time养殖周期/d
culture period放苗日期
stocking time收获日期
harvest time养殖周期/d
culture periodM0 504 2012-05-18 2012-09-05 110 ― ― ― 704 2012-05-18 2012-09-12 117 ― ― ― 1 205 2012-05-18 2012-09-01 106 ― ― ― M250 204 2012-05-18 2012-09-04 109 2012-05-18 2012-09-04 109 805 2012-05-28 2012-09-06 101 2012-05-26 2012-09-06 103 1 109 2012-05-23 2012-09-07 107 2012-05-30 2012-09-07 100 M500 705 2012-05-18 2012-08-29 103 2012-05-21 2012-08-29 101 1 204 2012-05-28 2012-08-19 83 2012-06-01 2012-08-19 80 104 2012-05-18 2012-09-15 120 2012-05-18 2012-09-15 120 M800 1 111 2012-05-23 2012-09-06 106 2012-05-30 2012-09-06 99 706 2012-05-18 2012-08-20 94 2012-05-20 2012-08-20 92 103 2012-05-18 2012-08-11 85 2012-05-18 2012-08-11 85 1.2 样品的采集、测定与计算
分别在2012年6月2日~8月18日采集样品(采样间隔基本为15 d)。用采水器取池塘混合水样5 L，充分混匀后用于水质分析。水体总氨氮(NH4-N)、硝态氮(NO3-N)、亚硝态氮(NO2-N)、活性磷酸盐(PO4-P)、总氮(TN)和总磷(TP)均按《养殖水化学实验》[7]所述方法测定，水体总有机碳(TOC)采用总有机碳分析仪(Vario TOC cube，德国产)测定。表层沉积物样品通过自制的采泥器采集，样品经60 ℃烘干研磨后用元素分析仪(Vario ELⅢ，德国产)测定总碳(TC)与TN，TP采用K2S2O8消解法测定[8]。养殖产出数据由养殖户整理提供。主要计算公式：
总有机碳(TOC)=总碳(TC)-总无机碳(TIC)
成活率(%)=100×终末尾数/起始尾数
饵料系数(FCR)=总投饵量/ 养殖生物体质量增加量
主要养殖成本(104元·hm-2)=(饲料成本+虾苗成本+苗成本)/养殖面积
养殖产值(104元·hm-2)=(对虾价格×对虾产量+鲻价格×鲻产量)/养殖面积
利润(104元·hm-2)=[(鲻产值+对虾产值)-主要养殖成本]/养殖面积
1.3 数据分析
采用SPSS 13.0软件进行数据处理和统计分析。不同处理先做单因素方差分析(One-Way ANOVA)，分析前先进行方差齐性检验。方差较齐的数据(养殖收获数据)通过Duncan比对差异，以P < 0.05作为差异显著水平；方差不齐的数据(水质与底质数据)则经Brown-Forsythe修正后改用Dunnett′s T3比对，以P < 0.05作为差异显著水平。
2. 结果
2.1 不同鲻放养密度下鱼虾成活率和成体规格比较
试验期间对虾成活率为69.70%~77.73%，以对照组(M0)最高，其余组则表现为随鲻放养密度的增大，对虾成活率逐渐上升的趋势，但各组差异不显著(P＞0.05)；各组中鲻成活率为62.00%~65.67%，差异不显著(P>0.05)(图 2-a)。养殖结束时，对照组对虾体质量为12.38 g，而其余组对虾体质量则呈现随鲻放养密度的增大而逐渐下降的趋势(M250>M500>M800)(图 2-b)。此外，鲻成体规格均一性较差，尽管各组平均体质量均接近0.5 kg，但同组内规格从0.30~0.85 kg不等。埃及革胡子鲶成体规格为0.35~0.40 kg，成活率为76.7%~80.0%，组间差异不显著(P>0.05)。埃及革胡子鲶苗种成本及售价均较低，各组放养规格及密度一致，放养量小，且各组内成体规格和成活率相近，对不同处理组的影响微乎其微，因此不参与后续的比较讨论。
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图 2 养殖结束后鱼、虾成活率(a)和对虾体质量(b)Figure 2. Survival of shrimps and mullets (a)and final weight of shrimps (b)2.2 不同鲻放养密度下主要养殖成本及饵料系数比较
就投喂饲料、虾苗、鲻苗3项合计的主要养殖成本而言，饲料成本所占比例最大，达到90%以上，而苗种所占比例则相对甚小。M0和M250两组的饲料成本接近，而M500、M800两组则与前两组相比，分别降低饲料成本约2×104元·hm-2和3×104元·hm-2，即饲料消耗量表现为M250＞M500＞M800，但各组差异仍不显著(P＞0.05)(图 3-a)。放养鲻的各组饵料系数(1.60~1.81)均低于对照组(1.91)，其中M500组饵料系数最低(图 3-b)。
2.3 不同鲻放养密度下鱼虾养殖产量和产值比较
养殖结束时M0组对虾养殖产量为8 630 kg·hm-2，略低于M250组(9 045 kg·hm-2)。鲻放养组对虾养殖产量呈M250>M500>M800趋势，而鲻养殖产量则表现为M250 < M500 < M800，且差异显著(P < 0.05)，鲻及对虾产量均基本呈线性关系(图 4-a)。
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图 4 鱼、虾养殖产量(a)和产值(b)各处理组间不同字母标注表示差异显著(P < 0.05)Figure 4. Farming yield (a) and production value (b) of shrimps and mulletsValues with different superscripts are significantly different (P < 0.05).就产值而言，M250拥有最高对虾产值(30.30×104元·hm-2)及总产值(31.02×104元·hm-2)；M500和M0的对虾产值极为接近(分别为26.12×104元·hm-2和26.63×104元·hm-2)，但辅以1.59×104元·hm-2的鲻产值，整体产值仍高于M0；M800由于对虾产值仅20.96×104元·hm-2，总产值也仅达到23.30×104元·hm-2，低于其他各组的对虾产值。由此计算出的利润也表现为M250＞M500＞M0＞M800，其中M250组的利润超出对照组M0达31.50%(图 4-b)。
2.4 不同鲻放养密度下水质状况比较
各组营养盐数据见图 5。养殖初始鲻放养组NH4-N质量浓度较高(1.720~2.400 mg·L-1)，其后迅速下降(0.073~0.540 mg·L-1)。养殖后期NH4-N质量浓度以M250组最高，M0组次之，而M500和M800则相对较低。
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图 5 水体中氨氮(a)、亚硝态氮(b)、硝态氮(c)、活性磷酸盐(d)、总氮(e)和总磷(f)质量浓度Figure 5. Concentrations of ammonium (a), nitrite (b), nitrate (c), dissolved inorganic phosphorus (d), total inorganic nitrogen (e) and total inorganic phosphorus (f) in water养殖1个月后各组NO2-N质量浓度逐渐升高，但仍低于0.250 mg·L-1；养殖2个月后NO2-N基本呈直线上升趋势，截至8月2日各组质量浓度已超过1.000 mg·L-1，而到8月18日除M0组回落至1.407 mg·L-1外，鲻放养组NO2-N质量浓度已超过1.500 mg·L-1，M250和M500组甚至已接近2.000 mg·L-1。整体而言，M250维持着较低的NO2-N质量浓度(末次采样除外)。养殖的前2个月NO3-N一直保持增长趋势，且在整个养殖过程中均为水体三态氮的主要存在形式，而TN随养殖时间推移而交替升降，变化规律不明显。
养殖初始各组PO4-P质量浓度高低不同，但在养殖1个月之后迅速降低，养殖中期(7月1日)出现一个峰值，此时M250组PO4-P质量浓度为其余组的3倍以上。此后各组PO4-P均趋于下降，整体低于0.025 mg·L-1。越到后期，TP与PO4-P质量浓度的差距越大。
除养殖的第1个月外，养殖水体TOC质量浓度均高于TIC，且为TIC的2倍以上，但差异不显著(P＞0.05)(图 6)。TOC、TIC和TC的组间差异变动规律基本一致。养殖末期对照组M0的TOC质量浓度低于鲻放养组。与养殖初始相比，各组TIC质量浓度均有不同程度的升高；M500和M800的TOC约有20 mg·L-1幅度的下降，M0和M250则变动极小；M0和M250的TC质量浓度约上升20 mg·L-1，而M500和M800则有不同程度的下降。
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图 6 水体中总有机碳(a)、总无机碳(b)、总碳(c)质量浓度Figure 6. Concentrations of total organic carbon (a), total inorganic carbon (b) and total carbon (c) in water2.5 不同鲻放养密度下底质状况比较
养殖开始后，各鲻放养组无论围网内外的TC、TN和TP均有不同程度的升高；围网内的各TC、TN和TP质量浓度及其变动幅度普遍高于围网外部；养殖末期围网内各组TP质量浓度趋于一致。养殖中期M250组TC质量浓度相对较高；养殖后期围网内沉积物TN质量浓度随鲻放养密度的增加而升高；养殖中后期围网内M250组TP质量浓度普遍高于其余各组(图 7)。
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图 7 围网内、外沉积物总碳(内：A1，外：A2)，总氮(内：B1，外：B2)，总磷(内：C1，外：C2)浓度Figure 7. Contents of total carbon (inside: A1, outside: A2), total nitrogen (inside: B1, outside: B2) and total phosphorus (inside: C1, outside: C2) of mesh enclosure3. 讨论
3.1 鲻-对虾混养模式经济效益分析
查广才等[9]发现低盐度养殖的凡纳滨对虾(80尾·m-2)在养殖前期体质量增长缓慢，而在中后期加速增长，加速的拐点一般在养殖的第50~第60天，体质量增长一般在第90~第100天结束；刘少英等[10]则发现拐点日龄出现在第120~第130天。M800组的103和706池塘的对虾养殖周期分别为83 d、85 d和94 d，即在体质量增长的拐点日龄前因出现发病征兆而过早起捕，相应地导致M800的对虾规格(11.02 g)小于其他组，售价也略低，故而养殖产量和产值都受到影响。而M0和M250两组养殖周期均在100 d以上，M500组中的104组更是达到120 d，生长较为充分。混养模式下对虾平均规格范围为12.38~14.30 g，高于对虾(L.vannamei)-罗非鱼(Oreochromis mossambicus)混养[11]和对虾(L.vannamei)-金钱鱼(Scatophagus argus)混养[12]模式，略低于对虾(L.vannamei)-斑点叉尾(Leiocassis temuifurcatus)混养[13]模式，而与对虾-鲻混养[6, 14]模式接近。混养模式下的养殖产量普遍与高密度养殖的对虾-金钱鱼[12]、对虾-斑点叉尾 [13]混养模式相当。
提高鲻放养量可降低对虾饵料系数(M500最低)，减少饲料的投喂，例如M500组和M800组饲料成本降低的幅度分别达2×104元·hm-2、3×104元·hm-2。因此，放养较多的鲻(M500)有利于节约养殖成本，而较少量的鲻(M250)则更有助于对虾规格和产量的提升。通过围网分隔处理，对虾与鲻可以基本避免同期投放而鲻的抢食活动，对虾的放养密度(90尾·m-2)均低于孔谦[6]和郭泽雄[14]的研究，鲻的放养密度(0.075~0.24尾·m-2)也低于其所述的范围。若能在养殖前期放养较多鲻，而在养殖中后期适当分鱼以降低鲻密度，或可形成综合优势，实现更好的养殖经济效益。
3.2 鲻-对虾混养模式下生态效益分析
养殖开始后，池塘中残饵、粪便等有机物质开始积累，且随着增氧机水流到达池塘中央，使该区域成为有机废物富集区，各组围网内外的TC、TN和TP也相应地呈不同程度的升高，且围网内的各元素浓度普遍高于围网外部。由于鲻喜欢刮食沉积物及附生藻类，其摄食活动引起的生物扰动效应[15-16]易于造成颗粒物的再悬浮，加快浅表沉积物的氧化分解，围网内部沉积物TC、TN和TP的变动幅度均高于围网外。
天然水体中TOC质量浓度一般为1~30 mg·L-1，且随着富营养化程度而增高[17-19]。试验池塘中TOC变动幅度较大(10.25~162.28 mg·L-1)，均值＞20 mg·L-1，这可能源于多年的对虾养殖过程中人工饵料的投喂所产生的沉积物有机负荷积累。养殖水体溶解有机碳(DOC)主要源于养殖生物的代谢活动，而颗粒有机碳(POC)则不仅源自养殖生物活动，还包括了溶失的绝大部分饵料。对虾池塘TOC以DOC为主，DOC/POC比值可达到2.62 : 1[20]。放养较多鲻的处理组(M500和M800)的TOC约有20 mg·L-1幅度的下降，而M0和M250则变动极小，表明对虾养殖池塘中央区域围养一定量的鲻，其摄食活动可降低对虾粪便的堆积，减轻残饵的溶失，进而控制养殖水体有机碳的积累。
养殖前期由于池塘浮游植物的快速吸收，造成NH4-N和PO4-P迅速下降。M250组在养殖后期的对虾生物量最大，容易产生大量的粪便等有机物质，其分解易使NH4-N积累，因此该组NH4-N质量浓度高于其余各组；M0组所产生的有机废物缺少鲻的再次利用，养殖后期NH4-N质量浓度也较高。养殖末期M250组的NO2-N质量浓度居于各组最高，M800次之，而M500组则相对较低，表明适量的鲻混养对凡纳滨对虾养殖池塘水质有一定的控制作用，而过多或过少都会适得其反。但养殖末期各组NO2-N质量浓度均超过1.000 mg·L-1，M800组中的706、103两池塘对虾出现发病征兆与可能此有较大关系，充分突出养殖后期水质调控的重要性[26]。由于M250组长期维持较低的NO2-N质量浓度，若能辅以一些环境调控手段[21-24]，提高混养池塘的对虾成活率，则养殖效益将更显著。
3.3 几种鱼虾混养方式比较
根据不同的养殖效果，中国的鱼虾混养的方式可分为3种：1)对虾-杂食性鱼类混养，用于提高对虾饲料利用率；2)对虾-肉食性鱼类混养，用于预防对虾传染性病害；3)对虾-滤食性鱼类混养，用于改善池塘水质。尽管以上几种混养方式在各地都有应用，但仍存在诸多不足之处，例如：1)与杂食性鱼类混养[25]，数量过少则经济效益增幅不明显，过多则会争抢高值的对虾饲料，反而影响对虾正常摄食和生长，且防控对虾传染性病害的效果不明显；2)与肉食性鱼类混养[26]，一旦肉食性鱼的数量或个体大小不当，健康对虾就会被鱼大量捕食，且肉食性鱼类对于对虾残饵的清除效果往往不佳；3)虾池一般混养[27-28]或分隔式混养[29]滤食性鱼可以滤除水中的大颗粒有机物和浮游生物，改善水质，但是不能解决对虾残饵和传染性疾病防控的问题，更难避免对虾精养池塘中央区域空间利用率低的缺陷。
近几年有关分隔养殖在虾塘中的报道较少，赵裕青等[30]发现通过网围分隔方式来混养凡纳滨对虾与鲤(Cyprinus carpio)，可提高产量1.125 kg·m-2以上；孙卫明等[31]发现网围分隔混养凡纳滨对虾与罗非鱼(O.niloticus)时会显著性地抑制池塘浮游生物量的增长，但桡足类除外，这种方式有利于改良池塘水质。因此，进一步细化探索对虾养殖池塘内采用围网分隔混养模式(内养鲻，外养对虾)的混养密度、围网方式、水质调控，无论是从对虾产量的提升还是对虾养殖成本的降低上，都具有重要的研究价值。
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图 1 感染不同浓度的WSSV后不同时间潜伏期斑节对虾血液中ACP活性变化
不同小写字母表示同一WSSV浓度下不同时间点时活性差异显著，n=3，P < 0.05；不同大写字母表示同一时间点不同WSSV浓度间活性差异显著，P < 0.05；下图同此
Figure 1. Change of ACP activity of P.monodon with different concentrations of WSSV solution in different latent periods
Different small letters indicate significant difference among different periods with the same WSSV concentrations, n=3, P < 0.05;different captial letters indicate significant difference in the same period with different WSSV concentrations, P < 0.05. The same case in the following figures.
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图 2 感染不同浓度的WSSV后不同时间潜伏期斑节对虾血液中AKP活性变化
Figure 2. Change of AKP activity of P.monodon with different concentrations of WSSV solution in different latent periods
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图 3 感染不同浓度的WSSV后不同时间潜伏期斑节对虾血液中PO活性变化
Figure 3. Change of PO activity of P.monodon with different concentrations of WSSV solution in different latent periods
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图 4 感染不同浓度的WSSV后不同时间潜伏期斑节对虾血液中POD相对活性变化
Figure 4. Change of POD activity of P.monodon with different concentrations of WSSV solution in different latent periods
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