动物界中普遍存在着性别二态性，然而其性别决定机制却多种多样^[1]，有遗传性别决定，环境性别决定，更有两者共同作用的复杂机制。因此，性别决定基因一直是生命科学研究的热点。自从发现人类和小鼠的性别决定基因SRY/Sry以来^[2-3]，已经在很多物种中发现不同的性别决定基因，而且分析发现大多数的性别决定基因集中在转录因子部分，如山羊（Capra hircus）雌性性别决定基因FOXL2^[4]，鸡（Gallus gallus）和半滑舌鳎（Cynoglossus semilaevis）的Dmrt1^[5-6]，两栖类非洲爪蟾（Xenopus laevis）的DM-W^[7]和青鳉（Oryzias latipes）的Dmy^[8]。但是随着研究的深入，发现很多非转录因子对于性别决定也起到非常重要的作用，如吕宋青鳉（O.luzonensis）和裸盖鱼（Anoplopoma fimbria）的gsdf^[9-10]，银汉鱼（Odontesthes hatcheri）的amhy^[11]以及红鳍东方鲀（Takifugu rubripes）的amhrⅡ^[12]等。转化生长因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）是一个拥有众多成员的超家族，这一家族作用广泛，除影响细胞的增殖、分化、凋亡，对组织重塑和免疫功能有重要作用外，同时还在胚胎发育、胞外基质形成、骨的形成和重建等方面也起着重要作用^[13]。在鱼类性别决定基因的研究中，发现TGF-β信号通路成员在鱼类性别决定与分化中起重要作用。

Gsdf（gonadal soma derived factor）和amh（anti-Müllerian hormone）都属于TGF-β超家族成员。Gsdf基因最早在虹鳟（Oncorhynchus mykis）中被发现，在虹鳟性腺发育早期，gsdf基因表达于原始生殖细胞（primordial germ cell，PGC）周围的体细胞中，在性腺发育后期，表达于精巢的支持细胞（Sertoli cells）以及卵巢的颗粒细胞（granulosa cells）中。同时，在受精卵阶段敲降虹鳟gsdf基因的表达后，虹鳟原始生殖细胞PGC的数目降低，表明gsdf基因可能与原始生殖细胞和精原细胞的增殖有关^[14]。此后，在多种硬骨鱼中成功克隆到gsdf基因，如青鳉^[15]、银大麻哈鱼（Oncorhynchus kisutch）^[16]、三斑海猪鱼（Halichoeres trimaculatus）^[17]、斑马鱼（Danio rerio）^[18]、尼罗罗非鱼（Oreochromis niloticus）^[19]等。特别是在罗非鱼的研究中，通过靶向基因敲除技术敲除gsdf基因，发现遗传雄性（XY）个体缺失gsdf基因导致其发生性逆转，性腺发育为卵巢，而在遗传雌性（XX）个体过表达gsdf基因也能使性腺性逆转为精巢，表明gsdf基因在罗非鱼性别决定中起重要作用。在这些研究中，gsdf基因主要在性腺中表达，因此被认为在鱼类性别决定、分化和生殖细胞的增殖过程中发挥重要的作用^{[12, 15-19]}。抗缪勒氏管激素AMH属于TGF-β超家族的分泌型糖蛋白，在哺乳动物中诱导雄性的缪勒氏管退化，维持雄性特征。在雄性小鼠缺失Amh基因导致小鼠部分雌雄同体，出现子宫和输卵管组织^[20]。研究表明，在鱼类中并没有发现缪勒氏管，但却存在amh或其同源基因。在银汉鱼中发现amh基因在Y染色体上有一个特异的复制amhy，且该基因在雄性特异表达，时空表达发现amhy在银汉鱼受精后第6天的胚胎中开始表达于精巢的支持细胞中，通过敲降amhy导致雌性特异基因的表达上调，表明amhy是银汉鱼的性别决定基因^[11]。尽管已有研究表明gsdf和amh基因影响鱼类性别决定与分化过程，但是在大黄鱼（Larimichthys crocea）中还未有gsdf和amh基因的研究报道。

大黄鱼属于鲈形目、石首鱼科、黄鱼属，是中国重要经济海水鱼类，人工育苗关键技术的突破，使大黄鱼成为中国南方沿海网箱养殖面积最大、产量最高的海水鱼类^[21]。与大多海水鱼类相似，大黄鱼生长存在雌雄差异，雌性生长速度快于雄性且达到成熟时的个体通常也比雄性大，使得雌鱼更具有市场价值，有必要在大黄鱼养殖生产中开展全雌鱼培育和养殖。然而，目前关于大黄鱼性别分化的调控网络以及有哪些基因参与到性别决定与分化都了解得很少，大黄鱼的性别决定机制还不够清楚，因此开展大黄鱼性别决定机制相关的研究，探索大黄鱼单性育种技术，对于大黄鱼养殖产业的发展具有重要意义和应用价值。该研究运用生物信息学的方法从转录组中注释到大黄鱼的gsdf及amh基因，采用分子生物学方法克隆了大黄鱼gsdf和amh基因的cDNA序列，同时使用实时荧光定量PCR研究这2个基因在大黄鱼不同组织、不同发育时期性腺的表达规律，并分析它们在雌鱼诱导成伪雄鱼性腺组织中的表达变化，以期为今后研究这2个基因和其他性别相关基因的调控关系及大黄鱼的性别决定与分化奠定基础。

1.   材料与方法

1.1   实验材料

1.1.1   实验样品

实验所用的人工养殖大黄鱼均采自福建省宁德市金陵水产科技有限公司。

1.1.2   实验试剂

DNA提取试剂盒、DNA凝胶回收试剂盒购自上海捷瑞生物工程有限公司；TransZol Up Plus RNA Kit、感受态细胞DH5α购自北京全式金生物技术有限公司；GoScript^TM Reverse Transcription System（Promega）购自上海泰京生物技术有限公司；Taq DNA聚合酶、pMD19-T、SYBR^®Premix Ex Taq ^TM Ⅱ试剂盒购自宝生物工程（大连）有限公司（TaKaRa）；引物在华大基因合成。

1.2   实验方法

1.2.1   样品制备

研究所用大黄鱼样品分别为：1）孵化后第6、第13、第20、第27、第34、第41、第49和第55天分别采集鱼苗样品，将整尾鱼完整浸入RNA保护液中，4 ℃放置1 d，然后更换RNA保护液，-80 ℃保存，用于总RNA的提取；2）分别采集孵化后第69、第84、第98、第112和第123天的大黄鱼样品，用消毒的刀片去掉鱼的首尾，剖开腹部去掉内脏后保存于RNA保护液中，保存方法同上；3）取8月龄、12月龄、16月龄及2年龄的成熟大黄鱼性腺样品保存于RNA保护液中，同时取对应每条鱼的鳍条用于基因组DNA提取。8月龄前的样品每个时期至少取20尾，8月龄后的样品至少有3尾雌鱼和3尾雄鱼；4）分别取成熟的3尾雌鱼和3尾雄鱼的脑、眼、心脏、肝脏、脾脏、肾、头肾、肠、胃、肌肉和性腺共11个组织样品，置于RNA保护液中，-80 ℃保存；5）取3尾成熟的伪雄鱼性腺样品，置于RNA保护液中，-80 ℃冰箱保存，取对应的胸鳍用于基因组DNA提取。所取鱼的鳍条组织置于95%的乙醇，-20 ℃中保存，用于提取DNA进行性别鉴定。

1.2.2   大黄鱼DNA的提取及遗传性别的鉴定

未成熟大黄鱼的性别难以根据其外部形态及性腺进行辨别。根据笔者实验室的研究发现，大黄鱼基因组中存在雌雄差异的DNA片段（未发表），根据该片段开发出的分子标记可以通过PCR扩增及琼脂糖电泳检测准确鉴定大黄鱼的遗传性别。该实验中，首先使用DNA提取试剂盒分别提取不同发育时期的大黄鱼及成熟伪雄鱼鳍条的DNA，所提取的DNA用1.0%琼脂糖凝胶电泳检测其质量并用MULTISKAN GO酶标仪（美国Thermo Fisher Scientific公司）测量DNA溶度，并将DNA溶液稀释至30 ng·μL^-1，-20 ℃保存备用。然后根据笔者实验室开发的性别特异分子标记对大黄鱼进行遗传性别鉴定。PCR扩增体系（共10 μL）为ddH₂O 6.7 μL，10×PCR Buffer 1.0 μL，dNTP Mix（2.5 mmol·L^-1）0.8 μL，上、下游引物（10 μmol·L^-1，序列见表 1）各0.2 μL，Taq DNA聚合酶（5 U·μL^-1）0.1 μL，模板DNA 1.0 μL。PCR反应程序为94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，35个循环；最后72 ℃延伸10 min，于4 ℃保存。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳检测根据电泳条带的不同进行性别的判定。

表  1  相关引物及其碱基序列

Table  1.  Primers and sequences used in the study

引物名 primer name	引物序列（5′-3′） primer sequence	作用 function
mark-F	TGGCTCTGTGAGGCGTCT	性别鉴定
mark-R	ATACAATGATGACATCAATCCTGAT
gsdf-O-F	ATGTCCTTTACGTTCATTGTCATG	开放阅读框扩增
gsdf-O-R	TTACTCTTCGCTGGGCTGCT
amh-O-F	ATGTTGTCGGTGGATGTCTTCTG
amh-O-R	TTAGCGGCATCCGCACTC
gsdf-Q-F	CTGATGGTGGAAACAGTACGAGCC	荧光定量PCR
gsdf-Q-R	AGAGTGCACACTGAACGACAGTC
amh-Q-F	AGCCAACATCAACAACTGCC
amh-Q-R	TTCATCCAAGTCCACCACCT
β-actin-F	TTATGAAGGCTATGCCCTGCC	β-actin内参引物
β-actin-R	TGAAGGAGTAGCCACGCTCTGT

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1.2.3   大黄鱼RNA的提取和cDNA的合成

不同时期的大黄鱼经性别鉴定后，根据Trans Zol Up Plus RNA Kit试剂盒操作说明分别提取不同发育时期大黄鱼的性腺总RNA、雌雄大黄鱼成鱼各个组织中的总RNA及伪雄鱼性腺总RNA，并用Dnase Ⅰ 37 ℃孵育30 min去除基因组DNA。提取的RNA用1.0%琼脂糖凝胶电泳检测其质量并用MULTISKAN GO酶标仪测量RNA浓度和质量。取提取的RNA 2 μg，根据GoScript^TM Reverse Transcription System试剂盒说明书合成cDNA的第一条链，cDNA合成后用内参基因β-actin引物（序列见表 1）对cDNA进行检测。

1.2.4   大黄鱼gsdf和amh基因的克隆

利用笔者实验室已经测序的大黄鱼转录组数据，经生物信息学分析得到大黄鱼gsdf和amh基因片段。根据参考序列，分别在gsdf和amh开放阅读框（ORF）前后各设计1对引物gsdf-O和amh-O（序列见表 1），以大黄鱼精巢cDNA为模板，进行gsdf和amh片段的PCR扩增。20 μL PCR反应体系包括RNase Free dH₂O 13.4 μL、10×Buffer 2 μL、dNTPs 1.6 μL、正反向引物（10 μmol·L^-1）各0.4 μL、模板cDNA 2 μL、Taq DNA聚合酶（5 U·μL^-1）0.2 μL。PCR反应条件为：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，35个循环；最后72 ℃延伸10 min。扩增产物经1.5%的琼脂糖凝胶电泳分离后用DNA凝胶回收试剂盒回收目的片段，纯化后的产物与pMD19-T载体连接，转化到感受态细胞DH5α，经LB平板（含氨苄青霉素）培养后，将筛选的阳性克隆送到华大基因有限公司进行测序。将测序的数据与参考序列进行比对分析，然后根据比对的序列设计荧光定量PCR引物gsdf-Q、amh-Q（序列见表 1）。

1.2.5   序列比较分析

对所获得的gsdf和amh开放阅读框cDNA序列及其推导的氨基酸序列，采用Blast n/p程序进行同源搜索。用CLUSTAL W程序对搜索得到的gsdf和amh核苷酸和氨基酸序列进行多序列比对。利用分析软件MEGA 5.0以Neighbor-Joining法构建系统树，Bootstrap设置为1 000。

1.2.6   实时荧光定量PCR

采用ABI7500 Real-time PCR仪（Applied Biosystems，美国），按照SYBR Premix Ex Taq Ⅱ使用说明，利用引物对gsdf-Q和amh-Q(表 1)进行实时定量PCR反应。以大黄鱼β-actin为内参，应用2^-ΔΔCT法确定各样品中gsdf mRNA和amh mRNA的相对含量。20 μL反应体系包括SYBR^®Premix Ex Taq^TM Ⅱ（2×）10 μL、ROX Reference Dye Ⅱ 0.4 μL、正反向引物（10 μmol·L^-1）各0.4 μL、模板cDNA 50 ng，其余体积用RNase Free dH₂O补齐。反应条件为95 ℃预变性5 min；95 ℃变性10 s，60 ℃退火30 s，荧光采集82 ℃ 10 s，40个循环；熔解曲线反应条件为95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，95 ℃ 15 s。PCR结束后确认扩增曲线及熔解曲线，以确保其特异性。每个样品重复3次。

1.2.7   数据处理

实时荧光定量数据以2^-ΔΔCT法处理，相对表达量以平均值±标准误（X±SE）表示，采用SPSS 19.0软件的t-检验分析法比较不同组织中gsdf和amh基因表达量的差异，显著性水平设为0.05。

2.   结果与分析

2.1   大黄鱼遗传性别的鉴定

利用笔者实验室开发的大黄鱼性别特异分子标记对大黄鱼进行遗传性别鉴定，经琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物后，根据电泳条带的情况便可判定待测个体的遗传性别（图 1）。雄性个体有2个大小不同的片段，而雌鱼仅有1个片段。据此，判定了不同个体大黄鱼的遗传性别。此外，经过人工诱导雌核发育的子代雌性个体，用17α-甲基睾酮处理性逆转成伪雄鱼，其性腺外形与大黄鱼雌鱼卵巢相似，但是成熟的性腺里面生成精子，通过此分子标记进一步确认其遗传性别是雌性。

图  1  大黄鱼遗传性别的鉴定

Figure  1.  Identification genetic sex of large yellow croaker

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2.2   大黄鱼gsdf和amh基因的克隆及序列分析

根据转录组拼接、注释得到的大黄鱼gsdf和amh基因的参考序列，分别设计1对引物，通过PCR对反转录产物进行扩增，经胶回收、克隆、测序及比对分析分别得到了大黄鱼gsdf和amh基因开放阅读框的cDNA序列。大黄鱼gsdf基因ORF为618 bp，可编码205个氨基酸。推导的大黄鱼Gsdf氨基酸序列中含有信号肽和TGF-β结构域，在TGF-β结构域内含有9个保守的半胱氨酸残基（图 2）。使用NCBI的Blastp分析大黄鱼Gsdf氨基酸序列与其他物种的同源性（表 2）。结果显示，大黄鱼Gsdf氨基酸序列与舌齿鲈（Dicentrarchus labrax）同源性最高（69%），与青鳉同源性为52%，与斑马鱼的同源性仅有33%。对鱼类Gsdf氨基酸序列与TGF-β超家族内的其他成员使用MEGA 5.0构建系统发育树。结果显示，鱼类Gsdf单独聚为一枝，与超家族内的其他成员分开，大黄鱼与赤点石斑鱼（Epinephelus akaara）、裸盖鱼的亲缘关系较近，先聚为一枝，然后再与其他鱼类聚在一起（图 3）。大黄鱼amh基因ORF为1 563 bp，可编码520个氨基酸。推导的大黄鱼Amh氨基酸序列中含有信号肽，并包含1个AMH-N区域和TGF-β结构域，在AMH-N区域内含有3个保守的半胱氨酸残基，在TGF-β结构域内含有7个保守的半胱氨酸残基（图 4）。使用NCBI的Blastp分析大黄鱼Amh氨基酸序列与其他物种的同源性（表 3），结果显示，大黄鱼Amh氨基酸序列与舌齿鲈相似性最高（76%），与青鳉相似性为53%，与斑马鱼相似性最低(42%)。使用MEGA 5.0对大黄鱼Amh氨基酸序列与其他脊椎动物的Amh构建系统发育树，结果显示大黄鱼Amh紧密的和其他鱼类Amh聚为一枝，且与鲈形目的亲缘关系最近（图 5）。

图  2  大黄鱼Gsdf氨基酸序列和其他鱼类Gsdf氨基酸序列的比较

箭头代表信号肽切割位点，黑色上画线为TGF-β结构域，9个保守的半胱氨酸残基用星号表示

Figure  2.  Alignment of amino acid of L.crocea gsdf with other vertebrate fishes

The arrow indicates the putative cleavage sites of the signal peptide. The TGF-β domain is labeled with black overline. The nine positions with conserved cysteines are marked by asterisks.

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图  3  大黄鱼Gsdf与其他物种TGF-β超家族成员系统进化分析

Figure  3.  Phylogenetic analysis of L.crocea Gsdf and other species TGF-β superfamily members

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图  4  大黄鱼Amh氨基酸序列和其他鱼类Amh氨基酸序列的比较

箭头代表信号肽切割位点，灰色上画线为AMH-N区域，黑色上画线为TGF-β结构域，10个保守的半胱氨酸残基用星号表示

Figure  4.  Alignment of amino acid of L.crocea Amh with other vertebrate fishes

The arrow indicates the putative cleavage sites of the signal peptide. The AMH-N domain and the TGF-β domain that characterized this family are labelled with gray and black overline, respectively. The ten positions with conserved cysteines are marked by asterisks.

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图  5  基于Amh氨基酸序列的大黄鱼与其他物种系统发育分析

Figure  5.  Phylogenetic analysis based on Amh amino acid sequences in L.crocea and other species

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表  2  大黄鱼Gsdf氨基酸序列的同源性分析

Table  2.  Homology of L.crocea Gsdf amino acid sequence with other species

物种 species	基因 gene	相似性/% similarity
舌齿鲈Dicentrarchus labrax	gsdf1	69
赤点石斑鱼Epinephelus akaara	gsdf	67
舌齿鲈Dicentrarchus labrax	gsdf2	66
黄鳝Monopterus albus	gsdf	63
裸盖鱼Anoplopoma fimbria	gsdf	62
黄鳍棘鲷Acanthopagrus latus	gsdf	61
斑马宫丽鱼Maylandia zebra	gsdf	60
尼罗罗非鱼Oreochromis niloticus	gsdf	60
莫桑比克罗非鱼Oreochromis mossambicus	gsdf	59
大菱鲆Scophthalmus maximus	gsdf	59
三斑海猪鱼Halichoeres trimaculatus	gsdf	58
红鳍东方鲀Takifugu rubripes	gsdf	53
青鳉Oryzias latipes	gsdf	52
虹鳟Oncorhynchus mykiss	gsdf	43
斑马鱼Danio rerio	gsdf	33

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表  3  大黄鱼Amh氨基酸序列的同源性分析

Table  3.  Comparative identity of L.crocea Amh amino acid sequence with other species

物种 species	相似性/% similarity
舌齿鲈Dicentrarchus labrax	76
裸盖鱼Anoplopoma fimbria	71
金钱鱼Scatophagus argus	70
奥利亚罗非鱼Oreochromis aureus	67
银汉鱼Odontesthes bonariensis	61
三斑海猪鱼Halichoeres trimaculatus	60
青鳉Oryzias latipes	53
虹鳟Oncorhynchus mykiss	49
斑马鱼Danio rerio	42

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2.3   大黄鱼gsdf和amh基因在不同组织、不同发育时期及伪雄鱼性腺的表达分析

通过实时荧光定量PCR对雌性和雄性大黄鱼脑、眼、心脏、肝脏、脾脏、肾、头肾、肠、胃、肌肉和性腺共11个组织进行表达分析，结果显示在这些组织中gsdf和amh基因的表达量存在很大差异。Gsdf基因特异表达于大黄鱼性腺中，而且在精巢中高表达，约是卵巢中的6倍，在其他组织未检测到有表达；amh基因同样在精巢中高表达，约是卵巢中的8倍，而在其他组织表达量很低（图 6-a和6-b）。对大黄鱼gsdf和amh基因在性腺不同发育时期的表达分析表明，在雄鱼精巢中gsdf和amh基因都在孵化后第41天（41 dph）检测到微量表达，而在孵化后55 dph表达都明显上调，在孵化后123 dph达到最高峰，此后表达量下降。与此相比，在卵巢中gsdf和amh基因表达量都很低，gsdf基因在卵巢中的表达量也呈现先升高后下降的趋势，且在孵化后123 dph达到最高；而amh基因在卵巢中的表达量一直处于很低的水平（图 7-a和7-b）。此外，对大黄鱼gsdf和amh基因在成熟的正常雌雄鱼和伪雄鱼性腺的表达量分析显示，相对于正常雌鱼，gsdf和amh基因在伪雄鱼性腺的表达量显著上升（图 8-a和8-b）。

图  6  gsdf（a）和amh（b）基因在大黄鱼不同组织中的表达

eye.眼；brain.脑；heart.心脏；liver.肝；spleen.脾；kidney.肾；headkidney.头肾；gonad.性腺；muscle.肌肉；stomach.胃；intestine.肠; *表示性腺表达量差异显著（P<0.05），且标在表达量较高的一侧

Figure  6.  Expressions of gsdf (a) and amh (b) genes in different L.crocea tissues

"*"indicates significant difference between gonads and appears above the higher expression (P<0.05) and was marked on the higher expression value.

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图  7  gsdf（a）和amh（b）基因在大黄鱼不同发育时期性腺中的相对表达

Figure  7.  Expressions of gsdf (a) and amh (b) genes in L.crocea gonads during different post-embryonic stages

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图  8  gsdf（a）和amh（b）基因在大黄鱼正常雌雄鱼和伪雄鱼性腺中的相对表达

Figure  8.  Expressions of gsdf (a) and amh (b) genes in different L.crocea gonads from females, males and pseudo-males

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3.   讨论

从发现虹鳟gsdf基因以来，不断地在斑马鱼、红鳍东方鲀、三刺鱼（Gasterosteus aculeatus）和青鳉等鱼类中发现该基因。然而，此前的研究发现gsdf基因仅限于硬骨鱼类，后来在肉鳍鱼类矛尾鱼（Latimeria menadoensis）^[22]和软骨鱼类象鲨（Callorhinchus milii）^[19]中也发现了gsdf基因，表明gsdf基因不只是存在于硬骨鱼类。目前，在比鱼类更原始的物种中，以及鱼类之后的四足类中都未能发现gsdf的同源基因^[23]，推测gsdf基因可能只特定存在于鱼类，并且该基因的出现有可能是基因组复制的产物。结合主流的基因组复制学说，第一次基因组复制发生在脊椎动物有颌类和无颌类分离前，而第二次基因组复制只发生在有颌类，第三次基因组复制是辐鳍鱼类特有的基因组复制^[24]，推测gsdf基因可能是在第二次基因组复制而产生的新基因，且该基因对于鱼类有特殊的功能。该研究中氨基酸序列分析显示，大黄鱼Gsdf存在TGF-β功能结构域，且在该保守域内有9个半胱氨酸残基。在鱼类中，TGF-β这些半胱氨酸残基相对保守，即其保守半胱氨酸的数量稍有不同。与大黄鱼相比，在三刺鱼Gsdf蛋白的TGF-β保守域内，缺少第6位的半胱氨酸残基；而在虹鳟的Gsdf则缺少第9位的半胱氨酸残基^[17]。TGF-β超家族成员总体上有6个保守半胱氨酸^[14]，这种结构上的保守也可能说明了其在功能上的保守。系统进化分析显示，大黄鱼的Gsdf与其他鱼类的Gsdf聚为一枝，而与TGF-β超家族的其他成员相分离，表明Gsdf是TGF-β超家族一个独特的成员，也可能预示着Gsdf具有系谱特异的功能。

在该研究中，采用实时荧光定量PCR比较了gsdf基因在大黄鱼不同组织的表达量，结果发现，gsdf基因在大黄鱼的性腺特异表达且在精巢高表达，在精巢的表达量约为卵巢的6倍以上，而在大黄鱼的其他组织中不表达，表明gsdf基因主要在大黄鱼的性腺中发挥功能。此结果与其他鱼类的研究结果相似，在尼罗罗非鱼和青鳉中^{[15, 25]}，gsdf基因只特异在性腺中表达，其他组织不表达，而且在精巢中的表达量显著高于卵巢，预示gsdf基因只在性腺中发挥作用，特别是在精巢中发挥重要的功能。此外，通过原位杂交（ISH）发现，在三斑海猪鱼和青鳉精巢的支持细胞中有很强的gsdf基因表达信号，而只在卵巢的颗粒细胞发现微弱的表达信号^{[15, 17]}。在这些鱼中，gsdf表现出明显的性别表达差异模式，表明gsdf基因在鱼类性腺发育过程中发挥独特的作用。

通过荧光定量PCR，最先在孵化后第41天的大黄鱼雄鱼性腺中检测到gsdf基因的表达，而雌鱼性腺中未发现表达，表现出性别差异。根据游秀容等^[26]对大黄鱼性腺分化的研究，大黄鱼卵巢的分化早于精巢，约在孵化后第55天，半数幼鱼性腺中形成成簇发育的卵原细胞群，减数分裂和卵巢腔的形成约在孵化后第60天。因此，该研究中gsdf基因的表达要明显早于大黄鱼性腺的分化。相似的发现在罗非鱼^[25]中报道过，罗非鱼性腺分化在孵化后第25天左右，然而，通过ISH研究发现罗非鱼gsdf基因的表达开始于孵化后第4天未分化的XY鱼苗的性腺，且此时在XX鱼苗性腺中未检测到gsdf信号，表明gsdf基因在未分化的性腺中已经行使其功能。在虹鳟孵化前，即性腺还未分化，通过抑制gsdf基因的翻译，发现原始生殖细胞的增殖受到抑制，推断在性腺分化前gsdf基因对原始生殖细胞的增殖可能起到重要的作用^[14]。第41天后大黄鱼gsdf基因在雄鱼性腺中的表达量逐渐上升，并且在123日龄左右达到最高峰。大黄鱼精巢分化约在95日龄左右，在这段时间gsdf基因的表达升高，结合其他鱼类gsdf基因特异表达于原始生殖细胞周围的体细胞中而且在精原细胞周围体细胞高表达，推测在这一发育阶段gsdf基因的表达水平升高促进体细胞的扩散或者精原干细胞的增殖。Gsdf基因在大黄鱼雌鱼性腺中也有少量表达，推测其对于卵巢的发育有一定的调控作用，但是具体作用还要进一步研究。

Amh是一种分泌性糖蛋白，普遍存在于脊椎动物中，由一个长的N末端和短的C末端组成^[27]。该研究中，通过对大黄鱼Amh氨基酸序列和其他鱼类Amh的同源性比对发现，大黄鱼Amh与舌齿鲈、裸盖鱼和金钱鱼的同源性比较高，超过70%。同时，可以发现Amh在C端保守性较高，含有7个保守的半胱氨酸残基，由于Amh有活性的区域是C末端，而N末端无生物活性, 起到辅助C末端穿过细胞膜并分泌的作用，因此其结构上的保守是必要的。在构建的进化树中，大黄鱼Amh与其他鱼类Amh紧密聚为一枝，且与舌齿鲈的亲缘关系最相近，这与氨基酸序列比对的结果一致，说明在进化过程中该基因具有一定的保守性。

该研究中，采用实时荧光定量PCR方法对大黄鱼amh基因在不同组织的表达量进行分析。结果显示，大黄鱼amh基因主要在大黄鱼的性腺表达且在精巢高表达，其他组织表达很低或者不表达。在很多鱼类的研究中发现amh基因并非性腺特异基因，在舌齿鲈的脑、性腺、垂体和心脏等组织中都有发现amh基因的表达^[28]；半滑舌鳎amh基因除在性腺显著表达，在血液、皮肤和脑中也有表达^[29]。特别的是，大黄鱼脑中amh基因也有一定的表达。在脊椎动物体中，下丘脑-垂体-性腺轴是重要的内分泌调节系统，脑及其分泌的激素在脊椎动物性别分化与性腺发育过程中起着重要的作用，结合其他鱼类在垂体检测到amh基因的表达，推测amh基因可能在下丘脑-垂体-性腺轴中发挥一定作用。

与gsdf基因相似，在对不同发育时期大黄鱼性腺中amh基因的表达量进行分析发现，同样在孵化后第41天的雄鱼性腺中检测到amh基因的表达，在雌鱼的性腺中不表达，此时大黄鱼性腺还未分化。此后amh基因在雄鱼性腺的表达量上升，特别是在55日龄显著上升，可能预示着amh基因在这个时间段的大黄鱼雄鱼性腺中有着重要的作用。这与对斑马鱼和半滑舌鳎的研究相似，斑马鱼中性腺显著分化是在受精后第31天，而在受精后第17天未分化的性腺就发现了amh基因的表达，此后表达逐渐上升，并在第33天的精巢中高表达^[30]；半滑舌鳎中发现amh基因在孵化后第70天之前未分化的雄鱼性腺中有较低的表达，在第70天即性腺分化前后表达水平显著升高且达到最高峰^[29]。许多研究发现，amh基因表达于未成熟精巢的支持细胞中，并且直到性腺成熟，此外，amh基因高表达会抑制雄性精子的形成^[31-32]。该研究中，amh基因在第112天的雄鱼性腺中的表达量达到最高峰后出现下降，并在此后维持较低水平到性腺成熟。在大西洋鲑（Salmo salar）未成熟的精巢中amh基因持续高表达，而在精子快速增殖时开始下降，在精子生成最多时amh基因的表达量最低^[33]。推测在大黄鱼中amh基因的表达量在成鱼期间维持较低的水平，可能是精子的形成抑制了amh基因的表达。通过这些研究表明，amh基因对鱼类性腺的分化和发育，特别是雄鱼精巢的分化和发育有很大的作用。此外，amh基因在大黄鱼卵巢中也有少量表达，相似的结果曾在金钱鱼(Scatophagus argus)^[34]的研究中报道过。Amh基因在金钱鱼Ⅲ、Ⅳ期的卵巢中表达量升高，这2个时期为卵母细胞大生长期和卵黄充满期，表现为滤泡膜细胞分裂增殖，逐渐积累卵黄，因此认为amh基因可能在金钱鱼卵泡发育过程中发挥作用，但其在鱼类卵巢中的作用还需深入的研究。

鱼类性别分化容易受到外界环境的影响，外源性激素对于鱼类的性别分化具有重要的作用，已经有多种鱼类成功用外源激素诱导使其发生性别逆转。为了研究gsdf和amh基因在性别逆转大黄鱼性腺中的表达变化，该研究利用17α-甲基睾酮投喂雌核发育后代的大黄鱼雌鱼幼苗，使得大黄鱼的生理性别出现逆转，变成伪雄鱼。通过荧光定量PCR发现，gsdf基因在伪雄鱼性腺中的表达量显著高于其在雌鱼性腺中的表达量，预示gsdf基因在性别逆转中受到调控，因此表达量发生变化。黄鳝（Monopterus albus）^[35]中gsdf基因在卵巢低表达，在由雌性向雄性逆转的精巢中表达量上升，在卵精巢的后期表达量达到最高峰；相似的结果在三斑海猪鱼^[17]中也有报道，这些结果表明gsdf基因可能在性别逆转中发挥潜在的作用。相比于正常雌鱼，amh基因在大黄鱼伪雄鱼性腺的表达量也显著上升，接近于在雄鱼精巢中的表达量，这与半滑舌蹋^[29]相似。半滑舌蹋中amh基因在伪雄鱼性腺的表达量显著高于正常雌鱼性腺的表达量。由此说明，amh基因可能参与了这些鱼类的性逆转过程，在精巢发育中起到了一定的作用。

Gsdf和amh基因同是TGF-β超家族成员，而TGF-β不仅能影响细胞的增殖、分化，还在胚胎发育等方面起着重要作用。该研究中观察到，gsdf和amh基因都在大黄鱼性腺中显著表达，且在精巢高表达，在性逆转的性腺中表达量发生显著变化，说明gsdf和amh基因在大黄鱼性别分化和性腺发育中起到了重要作用。因此，该研究对大黄鱼gsdf和amh基因的克隆和表达进行分析，为探讨大黄鱼性别决定及分化的机制奠定了基础。但是，更多关于大黄鱼gsdf和amh基因的功能，可通过基因敲除或敲降和过表达，或借助CRISPR/Cas9介导的基因组定点编辑技术进行定向诱变，再配合细胞学方面的研究，来分析它们潜在的功能，从而进一步了解它们在大黄鱼性别调控中的作用，为大黄鱼性别控制及单性育种奠定基础。