凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)亦称南美白对虾，因其生长快、适应能力强、耐盐性广、抗病力强和产肉率高等特点，已成为国际水产市场的热销品种^[1]。消化率是指动物从食物中所消化吸收的营养物质占总摄入食物总量的百分比，是评价饲料营养价值的重要指标之一^[2]，也反映动物肠道对饲料中营养物质的吸收比例^[3]。目前已有研究表明不同蛋白质原料对凡纳滨对虾的表观消化率存在显著影响^[4-5]。对虾消化液中消化酶的种类主要有蛋白分解酶(胰蛋白酶、梭肽酶A、梭肽酶B等)、脂肪分解酶和糖类分解酶(淀粉酶、纤维素酶)^[6]，而胰蛋白酶在对虾进行蛋白质的消化吸收过程中起着重要的作用^[7]。饲料蛋白水平对凡纳滨对虾^[8]、日本沼虾(Macrobrachium nipponense)^[9]和罗氏沼虾(M.rosenbergii)^[10]等的消化酶活性存在显著性影响；同时，对虾不同生长阶段的消化酶活性也不相同^{[3, 11-14]}。但饲料蛋白水平对不同规格凡纳滨对虾消化酶及蛋白质表观消化率的影响还未见系统的研究，陈义方等^[15]的研究表明，0.6~4.0 g、4.0~10.0 g和10.0~18.0 g这3个规格凡纳滨对虾饲料适宜蛋白质需要量分别为40%、38%和34%。此研究在已有研究的基础上探讨饲料蛋白水平对3个规格凡纳滨对虾消化酶和蛋白质表观消化率的影响，阐明饲料蛋白水平对各个生长阶段凡纳滨对虾消化生理机能的影响。掌握凡纳滨对虾各个阶段生理发育与营养物质消化吸收状况，对凡纳滨对虾养殖过程中配合饲料的开发、应用具有重要的指导意义。

1.   材料与方法

1.1   试验饲料

采用鱼粉、豆粕和花生麸为主要蛋白源，配制蛋白质质量分数为32%、34%、36%、38%、40%、42%和44%的7种饲料，并在每组饲料中添加0.01%的氧化钇(Y₂O₃)作为蛋白质表观消化率测定指示剂。饲料配方和饲料制作方法参考陈义方等^[15]。

1.2   试验用虾及饲养管理

试验所用凡纳滨对虾购自同一苗种场培育的虾苗，在中国水产科学研究院南海水产研究所热带水产研究中心(海南省陵水县新村镇)进行暂养并标粗到合适规格，挑选均匀健壮个体随机分配至容量为500 L的玻璃纤维桶内进行试验。规格Ⅰ从0.6 g养到4.0 g，每组40尾，养殖时间46 d；规格Ⅱ从4.0 g养到10.0 g，每组30尾，养殖时间31 d；规格Ⅲ从10.0 g养到18.0 g，每组20尾，养殖时间36 d。饲养管理方法及生长数据见陈义方等^[15]。

1.3   粪便收集及处理

对虾接近养成规格前1周收集粪便，粪便收集采用虹吸法(参考LIN等^[16])，在投料60 min后进行收集，先将桶中剩余饲料用虹吸管排出，90 min后再通过虹吸管将粪便吸到筛绢网上，粪便用海水冲去泥沙及杂质之后用淡水洗涤，在蒸馏水中浸泡5 s后用滤纸吸干水分，然后把包膜完整并成形的粪便放于50 mL塑料瓶中于－20 ℃冰箱保存。粪便使用冷冻干燥机冻干后过60目筛，使用全自动凯氏定氮仪(FOSS 2300)测定蛋白质质量分数，粪便和饲料Y₂O₃质量分数委托中国广州分析测试中心测定。蛋白质表观消化率计算公式为：

其中A为饲料中蛋白质质量分数(%)，A′为粪便中蛋白质质量分数(%)，B为饲料中Y₂O₃质量分数，B′为粪便中Y₂O₃质量分数。

1.4   肝胰脏采集及酶液制备

对虾长到试验预期规格后饥饿24 h，从每组虾中随机取5尾采集肝胰脏，采集到的肝胰脏保证个体完整，放于液氮罐中带回实验室后于－80 ℃冰箱保存。分析时取0.5 g肝胰脏按其质量加入10倍冰冻0.02 mol·L^-1、pH为7.5的磷酸缓冲液，冰浴中用匀浆机匀浆后将组织悬液低温离心(8 000 r ·min^-1，10 min)，上清液即为制得的酶粗提液(酶液)。

1.5   酶活性测定

酶液蛋白质量分数采用考马斯亮蓝法^[17]测定。采用牛血清蛋白配制蛋白质标准液在595 nm下测定吸光值制定标准曲线，考马斯亮蓝G-250染液与100 μL酶液中蛋白质中的碱性氨基酸(特别是精氨酸)和芳香族氨基酸残基相结合，在595 nm下测定的吸光度值A595，与蛋白质质量浓度成正比，通过标准曲线求得蛋白质质量分数。

蛋白酶测定采用福林-酚法^[18]。1 mL酶液中的蛋白酶分解酪蛋白(底物)，生成含酚基的氨基酸与福林-酚试剂成蓝色反应，从蓝色的深浅测知酶活力多少。酶活力单位定义为在37 ℃下每分钟水解酪素产生1 μg酪氨酸为1个酶活力单位(U)。

淀粉酶测定采用淀粉-碘显示法^[19]。淀粉酶催化淀粉分子中葡萄糖苷键水解，产生葡萄糖和麦芽糖等，在基质充分条件下，反应后加入的碘液与未被水解的淀粉结合成蓝色复合物，其蓝色深浅与未经酶促反应的空白管比较吸光度，推算其淀粉酶活力单位，淀粉酶活力单位定义为37 ℃、30 min内、100 mL酶液中淀粉酶能完全水解淀粉10 mg为1个淀粉酶活力单位(U)。

1.6   数据的统计分析

采用Excel 2003和SPSS 17.0软件对数据进行统计分析，先对数据作单因素方差分析(ANOVA)，处理若有显著差异，再作Duncan′s多重比较，P < 0.05表示差异显著，所有数值用平均数±标准差(X ±SD)表示。

2.   结果

2.1   蛋白质表观消化率

规格Ⅰ32%饲料组凡纳滨对虾蛋白质表观消化率显著低于34%、36%、38%和44%饲料组；规格Ⅱ和规格Ⅲ蛋白质表观消化率随着蛋白质质量分数的升高基本呈现先升高后降低的趋势，且在40%饲料组达到最大并显著高于其他组(图 1-a)。

图  1  饲料蛋白水平对3个规格凡纳滨对虾蛋白质表观消化率(a)、肝胰脏蛋白酶活性(b)和淀粉酶活性(c)的影响

同一图案上标字母不同者之间表示存在显著差异(P < 0.05)

Figure  1.  Effects of dietary protein levels on protein apparent digestibility(a), hepatopancreas protease activity (b) and amylase activity (c) of 3 sizes of Pacific white shrimp, Litopenaeus vannamei

Values in the same pattern with different superscripts are significantly different (P < 0.05).

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2.2   蛋白酶活性

规格Ⅰ和规格Ⅱ凡纳滨对虾随着饲料蛋白水平的升高，肝胰脏蛋白酶活力呈现先升高后下降的趋势，规格Ⅰ40%饲料组具有最高的蛋白酶活力且显著高于44%饲料组(P < 0.05)，规格Ⅱ36%饲料组具有最高的蛋白酶活力，但各组之间无显著性差异。规格Ⅲ凡纳滨对虾肝胰脏蛋白酶活力随着饲料蛋白水平的升高而增大，44%饲料组蛋白酶活力显著高于32%饲料组且与其他组无显著性差异(图 1-b)。

2.3   淀粉酶活性

规格Ⅰ饲料蛋白质量分数低时淀粉酶活性高。32%饲料组淀粉酶活力显著高于34%饲料组，34%饲料组淀粉酶活力显著高于其他组，42%饲料组淀粉酶活力显著高于36%饲料组(P < 0.05)且与38%、40%、44%饲料组无显著性差异。规格Ⅱ肝胰脏淀粉酶活力随着蛋白质水平升高而降低，32%~38%饲料组的淀粉酶活力显著高于40~44%饲料组。随着饲料蛋白水平的升高，规格Ⅲ肝胰脏淀粉酶活力出现上升趋势，42%、44%饲料组淀粉酶活力显著高于32%饲料组且与其他组无显著性差异(图 1-c)。

3.   讨论

3.1   饲料蛋白水平对蛋白质表观消化率的影响

蛋白质表观消化率是决定饲料蛋白被利用与否的重要参考依据^[20]，其高低也反映了饲料对养殖水体环境的污染程度^[21]。此试验中饲料蛋白水平对3个规格凡纳滨对虾蛋白质表观消化率均存在显著性影响。规格Ⅰ32%饲料组凡纳滨对虾蛋白质表观消化率显著低于其他组(40%饲料组除外)，规格Ⅱ和规格Ⅲ的蛋白质表观消化率随着蛋白质的升高基本呈现先升高后降低的趋势，在40%饲料组达到最大且显著高于其他组。此试验规格Ⅰ的研究结果与夏苏东等^[22]对0.2~5.0 g的凡纳滨对虾(养殖水体盐度为30)的研究结果基本一致，但郭冉等^[23]对凡纳滨对虾的研究结果指出，蛋白质水平对凡纳滨对虾蛋白质表观消化率不存在显著性影响(养殖水体盐度为6~14)，这种差异可能是由养殖水体盐度和饲料配方差异所引起。

3.2   饲料蛋白水平对消化酶活性的影响

对克氏原鳌幼虾(Procambarus clarkii Girard)^[24](5.46 g)的研究表明，投喂不同蛋白质量分数(30%、35%、40%和45%)的饲料28 d后，随着饲料蛋白水平的提高，肝胰脏蛋白酶活性呈现先升高后降低的趋势，35%时最高。饲料中蛋白质质量分数为30%~50%时中国对虾(Penaeus chinnsis)^[25]蛋白酶、淀粉酶的活性随蛋白质质量分数的增加而升高；当饲料中蛋白质质量分数高于50%时酶活性下降。饲料蛋白水平对罗氏沼虾^[10]稚虾蛋白酶活性存在显著性影响，但是对淀粉酶的活性影响较小。此试验中饲料蛋白水平对3个规格凡纳滨对虾肝胰脏蛋白酶和淀粉酶活性存在着不同的影响，规格Ⅰ和规格Ⅱ凡纳滨对虾随着饲料蛋白水平的升高肝胰脏蛋白酶活力呈现先升高后下降的趋势，分别在40%、36%饲料组达到最大；而淀粉酶活性则是低蛋白饲料组高于高蛋白饲料组；规格Ⅲ凡纳滨对虾肝胰脏蛋白酶和淀粉酶活力均随着饲料蛋白水平的增加而升高。可以看出，10 g以下的凡纳滨对虾肝胰脏蛋白酶活性变化趋势与克氏原鳌幼虾^[24]、中国对虾^[25]和罗氏沼虾^[10]变化趋势一致，但随着体质量增加蛋白酶呈现出一直升高的趋势。已有很多研究表明，对虾消化酶活性变化与生长阶段有关，如LEE等^[26]对4.0 g、9.8 g和20.8 g这3个规格凡纳滨对虾研究发现，蛋白酶和淀粉酶活性在不同阶段均存在变动；罗氏沼虾^[12]幼体发育的中期类蛋白酶活性和淀粉酶活性最高，发育早期和后期较低，但胃蛋白酶活性则在发育后期较高；在斑节对虾(P.monodon)^[11]生长过程中体长10 cm时肝胰腺的淀粉酶活性最低，胃淀粉酶活性则在体长为10 cm时最高，并随着生长显著下降。对虾消化酶活性受到多方面因素的影响，虽然理论上蛋白酶活性提高会相应地引起蛋白质消化率的增加，但由于此研究中蛋白质水平不同，未能得出蛋白酶活性与蛋白质的消化率的相关性规律。

3.3   消化酶活性对饲料组成的适应性及与生长的关系

甲壳动物幼体摄食不同蛋白质水平的饲料后，为了更好地消化、吸收和利用饲料中的营养物质，幼体消化酶分泌量出现差异，表现出对饲料组成的明显适应性^[14]。JONES等^[27]认为对虾和蟹类后期幼体消化酶活力对饲料组成均具有较高的适应性。此试验中规格Ⅰ和规格Ⅱ对虾随着饲料蛋白水平的升高，肝胰脏蛋白酶活力先升高后下降，40%饲料组具有最高的蛋白酶活力，但是淀粉酶却在饲料蛋白质量分数低时呈现出最高活力。可以看出，当蛋白质量分数低时凡纳滨对虾在一定程度上会选择提高淀粉酶的活性，加大对糖类的消化吸收；10 g以上的凡纳滨对虾蛋白酶活性随着饲料蛋白质量分数增加而一直升高，说明凡纳滨对虾消化酶的活性对投喂的饲料表现出一定的适应性，这与王淑红等^[28]对凡纳滨对虾的研究结果相似。潘鲁青等^[7]指出锯额长臂虾(Palaemon serratus)饲喂可利用蛋白质质量分数和淀粉质量分数分别为45%和2.8%的饵料时，虾体蛋白酶和淀粉酶活性达到最高水平，因此认为消化能力的提高可促进肝胰腺的合成能力；也有研究指出饲料蛋白改变血淋巴中氨基酸和葡萄糖的质量浓度，影响胰蛋白酶和淀粉酶基因的转录进而干预其合成，导致胰蛋白酶和淀粉酶活性的相应变化^[29]。

此研究结果显示，肝胰脏消化酶活力与增重率^[15]之间并未呈现出一定的相关关系。这与日本沼虾^[9]结果不同，但与罗氏沼虾^[10]和日本对虾^[30]结果相似。董云伟等^[10]认为饲料中蛋白水平的提高促使蛋白酶活性升高，吸收到体内的蛋白质随之增加，但是吸收的蛋白质由于代谢的增强而被消耗。对虾对营养物质的吸收达到一定程度时，吸收速度不会再因质量浓度的上升而按比例增加^[2]。因此，如何更科学地评价酶与机体生长之间的关系并阐述其机理，仍有待进一步的探索和研究。