HPLC-MS/MS determination of zeranols residues in aquatic products
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摘要:
文章建立用高效液相色谱-串联质谱法(HPLC-MS/MS)测定水产品中玉米赤霉醇类激素药物残留量的方法。用乙腈提取水产品中6种玉米赤霉醇类药物，正己烷脱脂，氨基固相萃取柱净化。采用电喷雾电离，负离子扫描，选择反应监测模式(SRM)监测，外标法定量。该法对6种玉米赤霉醇类药物标准曲线的线性回归系数均在0.99以上，线性范围0~25 μg·kg-1，方法定量限1.0 μg·kg-1。6种玉米赤霉醇类激素药物回收率75.9%~103.8%，相对标准偏差3.90%~13.5%。该法简单、灵敏，结果可靠，可满足实验室批量样品分析的需求。
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关键词:
- 高效液相色谱-串联质谱法 /
- 玉米赤霉醇 /
- 水产品 /
- 残留
Abstract:We developed a method for determining zeranols residues such as α-zearalanol, β-zearalanol, α-zearalenol, β-zearalenol, zearalanone and zearalenone by high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry (HPLC-MS/MS).The samples were extracted with acetonitrile, degreased with hexane and purified with amino solid-phase extraction column. In addition, with electrospray ionization in negative mode, we monitored the samples with selected reaction monitoring (SRM) and quantified them with external standard method. For the 6 zeranols, it shows good linear regression coeffcient in the standard curve (all >0.99); the linear range is 0~25 μg·kg-1; the limit of detection is 1.0 μg·kg-1; the average recovery is 75.9%~103.8%, and the relative standard deviation is 3.90 %~13.5 %. The method, which is simple, sensitive and reliable, can be used to identify and quantify zeranols residues in aquatic products.
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玉米赤霉醇(zearalanol)和玉米赤霉烯醇(zearalenol)属于玉米赤霉菌素，是玉米赤霉菌中二羟苯甲酸内酯的衍生物，为玉米赤霉菌在生长过程中产生的次生代谢产物——玉米赤霉烯酮(zearalenone)的还原产物，属于雷索酸内酯类非甾体类同化激素[1]，是具有雌激素的合成激素。玉米赤霉醇曾作为生长促进剂应用于动物生长，具有促进蛋白质合成、提高饲料转化率的作用。随着人们对同化激素的深入认识，动物性食品中同化激素残留的安全性问题引起人们广泛关注，近年来许多研究机构开始对玉米赤霉醇的危害进行研究。研究发现，玉米赤霉醇在动物组织中的残留会影响人类健康，轻则引起人体性机能紊乱，重则影响第二性征的正常发育，在外部条件诱导下，这类物质可能致癌[2]。此类药物排出动物体外后，还可经饮水和食物造成二次污染及环境污染[3]。欧盟于1998年明确禁止将玉米赤霉醇、己烯雌酚等激素类药物应用于畜禽养殖。2002年国家农业部也明确规定玉米赤霉醇类激素药物禁止用于所有食品动物，在所有食用组织不得检出。
目前，玉米赤霉醇残留量的测定方法有薄层色谱法(TLC)[4-5]、酶联免疫法(ELISA)[6]、气相色谱-质谱法(GC-MS)[7-8]和高效液相色谱法(HPLC)[9-11]等。TLC法成本低，但灵敏度和选择性不高；ELISA法虽然灵敏度很高，但由于其有交叉反应特性，相对而言选择性较差；GC-MS法灵敏度和选择性均好，但需要衍生化，操作繁琐费时；HPLC法虽可直接测定，但选择性较差，通常不能予以定性确证[11]。该研究采用高效液相色谱-串联质谱法(HPLC-MS/MS)，通过MS/MS的选择反应检测模式(SRM)克服背景干扰，显著提高信噪比，建立了水产品中玉米赤霉醇类激素药物残留量测定的分析方法。
1. 材料与方法
1.1 试剂与仪器
α-玉米赤霉醇(α-zearalanol)，β-玉米赤霉醇(β-zearalanol)，α-玉米赤霉烯醇(α-zearalenol)，β-玉米赤霉烯醇(β-zearalenol)，玉米赤霉酮(zearalanone)和玉米赤霉烯酮(zearalenone)购自Sigma公司(纯度>99%)。乙腈、甲醇、正己烷、乙酸乙酯、乙醚和甲酸均为色谱纯；无水硫酸钠为化学纯；氨基固相萃取柱(500 mg，3 mL)；水为Milli-Q制备的超纯水。
Accela TSQ Quantum Access液相色谱串联四级杆质谱联用仪(美国Thermo Fisher公司出品)；SHA-BA水浴恒温振荡器型(常州国华电器有限公司出品)；MS2型旋涡混合器(德国IKA公司出品)；旋转蒸发仪(上海申生科技有限公司出品)；氮吹仪(广州智真生物科技有限公司出品)；PL203型电子分析天平、AB204-E型电子分析天平(Mettler Toledo公司出品)。
1.2 标准溶液配制
1.2.1 储备液
准确称取适量α-玉米赤霉醇，β-玉米赤霉醇，α-玉米赤霉烯醇，β-玉米赤霉烯醇，玉米赤霉酮和玉米赤霉烯酮标准品，用色谱纯甲醇溶液定容于50 mL棕色容量瓶中，溶液质量浓度为100 μg·mL-1，-18 ℃下避光保存，有效期为12个月。
1.2.2 混合标准储备液
分别准确吸取1.0 mL的α-玉米赤霉醇，β-玉米赤霉醇，α-玉米赤霉烯醇，β-玉米赤霉烯醇，玉米赤霉酮和玉米赤霉烯酮标准储备液至10 mL容量瓶中，用甲醇稀释定容，溶液质量浓度为10 μg·mL-1，-18 ℃下避光保存，有效期为6个月。
1.2.3 混合标准工作液
根据检测要求，用乙腈-水溶液[V(乙晴)：V(水)＝20：80]，稀释成相应的标准工作液，以各组分的色谱峰面积对浓度作线性回归，得定量标准曲线。
1.3 色谱条件
色谱柱为Thermo Scientific Hypersil GOLD(2.1 mm×150 mm，5 μm)；柱温为35 ℃；流动相为0.1%甲酸水溶液-乙腈体系(梯度洗脱程序见表 1)，流速0.25 mL·min-1；进样量10 μL。
表 1 HPLC流动相梯度洗脱程序Table 1. HPLC mobile phase gradients时间/min
time0.1%甲酸水溶液
0.1% formic acid in waterw(乙腈)/%
acetonitrile流速/μL·min-1
flow rate0 70 30 250 5 70 30 250 8 10 90 250 12 10 90 250 12.1 70 30 250 14 70 30 250 1.4 质谱条件
电喷雾离子源，负离子检测模式，喷雾电压3 500 V，壳气压力40 units，辅气压力8 units，离子传输毛细管温度350 ℃，源内碰撞诱导解离电压10 V，选择反应监测(SRM)，母离子、子离子和碰撞能量见表 2，Q1半峰宽0.7 Da，Q3半峰宽0.7 Da，碰撞气压力为氩气1.0 mTorr。
表 2 选择反应监测母离子、子离子和碰撞能量Table 2. Optimization parameters of SRM of the analytes化合物
compounds母离子/(m/z)
parent ion子离子/(m/z)
product ion碰撞能量/eV
collision energy保留时间/min
retention time离子丰度/%
abundance of product ionα-玉米赤霉醇
α-zearalanol321 277*
30322
259.02 20.0 β-玉米赤霉醇
β-zearalanol321 277*
30322
258.56 18.5 α-玉米赤霉烯醇
α-zearalenol319 275.2*
30124
309.15 26.2 β-玉米赤霉烯醇
β-zearalenol319 275*
30124
308.66 10.0 玉米赤霉酮
zearalanone319 275*
20523
299.61 36.2 玉米赤霉烯酮
zearalenone317 175*
27328
219.64 88.6 注：*.定量碎片离子
Note: *.quantitative fragment ion1.5 样品前处理
称取均匀样品约5 g(精确至0.01 g)于50 mL塑料离心管，加入3 g无水硫酸钠，涡旋振荡20 s后，加入15 mL乙腈，涡旋振荡1 min，4 000 r·min-1离心10 min，取上层清液至另一离心管中。再加入15 mL乙腈重复提取1次，合并2次提取液。在提取液中加入15 mL乙腈饱和正己烷，剧烈振荡1 min，3 000 r·min-1离心5 min，弃去上层正己烷，再加入10 mL乙腈饱和正己烷重复脱脂1次。下层乙腈溶液转移至100 mL鸡心瓶中，50 ℃旋转蒸发至干，加入5 mL乙酸乙酯，涡旋振荡1 min，静置30 s，上清液转移至50 mL离心管。鸡心瓶中加入10 mL乙腈饱和正己烷，涡旋振荡30 s，静置30 s，上清液转移至同一离心管。再用10 mL乙腈饱和正己烷洗涤鸡心瓶1次，合并3次残余物溶解液，备用。
将氨基固相萃取柱用5 mL乙酸乙酯、5 mL正己烷预淋洗活化。取上述备用液过柱(流速不超过1 mL·min-1)，再依次用5 mL正己烷、5 mL正己烷-乙酸乙酯[V(正已烷)：V(乙酸乙酯)＝60：40]淋洗，4 mL正己烷-乙酸乙酯[V(正已烷)：V(乙酸乙酯)＝20：80]、4 mL乙酸乙酯洗脱。洗脱液于50 ℃下氮气吹干，1 mL乙腈-水溶液[V(乙晴)：V(水)＝20：80]定容，过0.22 μm微孔滤膜后，滤液待测。
2. 结果与分析
2.1 色谱及质谱条件优化
玉米赤霉醇脂溶性较好，因此在反相C18色谱柱上有良好的保留性质。笔者用Hypersil GOLD(2.1 mm×150 mm，5 μm)色谱柱，以乙腈和0.1%甲酸水溶液为流动相，流速0.25 mL·min-1，6种分析物得到良好的分离。以乙腈作为有机修饰剂，对于MS检测的灵敏度和稳定性无明显影响，而甲酸的加入可提高分析物离子化效率，显著增强MS响应。但随着甲酸浓度的增加，灵敏度反而下降。通过多次试验，当甲酸的体积分数为0.1%时可获得较好的保留时间、峰形和离子强度。该研究采用SRM检测方式，在一级全扫描质谱图中，6种玉米赤霉醇类化合物都观察到清晰的[M-H]-准分子离子峰，然后进行相应的子离子Q3全扫描，选取2个丰度较高的子离子作为定性和定量离子，选择结果见表 2。定性分析选择1个母离子及2个子离子，并依据子离子相对丰度比和化合物保留时间定性，符合欧盟委员会指令2002/657/EC对定性分析的要求。保留时间和离子相对丰度见表 2，HPLC-MS/MS标准品色谱图见图 1，加标样品图见图 2。
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图 1 6种玉米赤霉醇类激素药物标准品色谱图1.玉米赤霉烯酮；2.α-玉米赤霉烯醇；3.β-玉米赤霉烯醇；4.玉米赤霉酮；5.α-玉米赤霉醇；6.β-玉米赤霉醇(后图同此)Figure 1. Chromatogram of 6 zeranols standard solution1. zearalenone; 2. α-zearalenol; 3. β-zearalenol; 4. zearalanone; 5. α-zearalanol; 6. β-zearalanol (the same case in the following figure)2.2 样品前处理条件优化
玉米赤霉醇类激素药物为脂溶性物质，不溶于水，溶于多种有机溶剂和碱性溶液。样品前处理过程中提取剂的提取能力有很大差异，该试验分别比较了乙腈、甲醇、乙醚和乙酸乙酯4种提取溶剂的提取效果和提取效率，综合考虑后决定采用乙腈作为提取溶剂，这不仅提高提取效果，而且保证这6种玉米赤霉醇类激素药物在氨基固相萃取柱上的保留能力不受影响。
2.3 标准曲线、线性范围、检出限和定量限
用空白样品制备样品空白提取液，用该提取液将标准液稀释成1、5、10、15、20和25 μg·kg-1溶液，以各组分浓度与其色谱峰面积进行线性回归，呈良好线性关系(表 3)。以3倍信噪比(S/N)计算，α-玉米赤霉醇，β-玉米赤霉醇，α-玉米赤霉烯醇，β-玉米赤霉烯醇，玉米赤霉酮和玉米赤霉烯酮检出限为0.5 μg·kg-1；以10倍信噪比(S/N)计算，α-玉米赤霉醇，β-玉米赤霉醇，α-玉米赤霉烯醇，β-玉米赤霉烯醇，玉米赤霉酮和玉米赤霉烯酮定量限为1.0 μg·kg-1。
表 3 玉米赤霉醇类激素药物回归分析、检出限和定量限Table 3. Regression analysis, limit of detection and limit of quantitation of zeranols化合物
compounds线性回归方程
linear regression equation相关系数(R2)
correlation coefficient检出限/μg·kg-1
limit of detection定量限/μg·kg-1
limit of quantitationα-玉米赤霉醇
α-zearalanolY=7.37×102X-7.69×103 0.992 1 0.5 1.0 β-玉米赤霉醇
β-zearalanolY=5.42×102X-5.07×103 0.990 5 0.5 1.0 α-玉米赤霉烯醇
α-zearalenolY=1.26×102X-2.81×103 0.990 1 0.5 1.0 β-玉米赤霉烯醇
β-zearalenolY=7.69×101X-1.96×103 0.992 4 0.5 1.0 玉米赤霉酮
zearalanoneY=1.85×102X-1.64×103 0.996 4 0.5 1.0 玉米赤霉烯酮
zearalenoneY=1.35×102X-2.55×103 0.990 8 0.5 1.0 2.4 方法回收率和精密度
在添加1.0~20 μg·kg-1水平范围内，测得6种玉米赤霉醇类激素药物的平均回收率为75.9%~103.8%(n=6)，相对标准偏差为3.90%~13.5%(表 4)，表明该法稳定性强、重现性好，能满足水产品中玉米赤霉醇类激素药物残留检测的要求。
表 4 方法的添加回收率和精密度(n=6)Table 4. Recoveries and precisions of HPLC-MS/MS化合物
compounds添加水平/μg·kg-1
added level平均回收率/%
average recovery相对标准偏差/%
RSD化合物
compounds添加水平/μg·kg-1
added level平均回收率/%
average recovery相对标准偏差/%
RSDα-玉米赤霉醇
α-zearalanol1 80.6 9.81 β-玉米赤霉烯醇
β-zearalenol1 75.9 11.6 5 88.2 6.22 5 77.7 7.54 10 93.4 5.14 10 82.7 3.90 β-玉米赤霉醇
β-zearalanol1 77.2 11.3 玉米赤霉酮
zearalenone1 76.5 12.0 5 79.1 7.61 5 78.2 5.57 10 89.3 4.50 10 83.2 4.86 α-玉米赤霉烯醇
α-zearalenol1 79.1 13.5 玉米赤霉烯酮
zearalenone1 81.7 9.12 5 82.8 6.45 5 93.2 5.39 10 94.4 5.37 10 103.8 4.92 3. 结论
文章采用HPLC-MS/MS测定了水产品中玉米赤霉醇类激素药物的残留量。方法精密度高，重现性好，方法的检测限和定量限低，能满足国家现行兽药残留检测分析的要求，适用于水产品中玉米赤霉醇类激素药物残留的确证检测。
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图 1 6种玉米赤霉醇类激素药物标准品色谱图
1.玉米赤霉烯酮；2.α-玉米赤霉烯醇；3.β-玉米赤霉烯醇；4.玉米赤霉酮；5.α-玉米赤霉醇；6.β-玉米赤霉醇(后图同此)
Figure 1. Chromatogram of 6 zeranols standard solution
1. zearalenone; 2. α-zearalenol; 3. β-zearalenol; 4. zearalanone; 5. α-zearalanol; 6. β-zearalanol (the same case in the following figure)
表 1 HPLC流动相梯度洗脱程序
Table 1 HPLC mobile phase gradients
时间/min
time0.1%甲酸水溶液
0.1% formic acid in waterw(乙腈)/%
acetonitrile流速/μL·min-1
flow rate0 70 30 250 5 70 30 250 8 10 90 250 12 10 90 250 12.1 70 30 250 14 70 30 250 
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表 2 选择反应监测母离子、子离子和碰撞能量
Table 2 Optimization parameters of SRM of the analytes
化合物
compounds母离子/(m/z)
parent ion子离子/(m/z)
product ion碰撞能量/eV
collision energy保留时间/min
retention time离子丰度/%
abundance of product ionα-玉米赤霉醇
α-zearalanol321 277*
30322
259.02 20.0 β-玉米赤霉醇
β-zearalanol321 277*
30322
258.56 18.5 α-玉米赤霉烯醇
α-zearalenol319 275.2*
30124
309.15 26.2 β-玉米赤霉烯醇
β-zearalenol319 275*
30124
308.66 10.0 玉米赤霉酮
zearalanone319 275*
20523
299.61 36.2 玉米赤霉烯酮
zearalenone317 175*
27328
219.64 88.6 注：*.定量碎片离子
Note: *.quantitative fragment ion
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表 3 玉米赤霉醇类激素药物回归分析、检出限和定量限
Table 3 Regression analysis, limit of detection and limit of quantitation of zeranols
化合物
compounds线性回归方程
linear regression equation相关系数(R2)
correlation coefficient检出限/μg·kg-1
limit of detection定量限/μg·kg-1
limit of quantitationα-玉米赤霉醇
α-zearalanolY=7.37×102X-7.69×103 0.992 1 0.5 1.0 β-玉米赤霉醇
β-zearalanolY=5.42×102X-5.07×103 0.990 5 0.5 1.0 α-玉米赤霉烯醇
α-zearalenolY=1.26×102X-2.81×103 0.990 1 0.5 1.0 β-玉米赤霉烯醇
β-zearalenolY=7.69×101X-1.96×103 0.992 4 0.5 1.0 玉米赤霉酮
zearalanoneY=1.85×102X-1.64×103 0.996 4 0.5 1.0 玉米赤霉烯酮
zearalenoneY=1.35×102X-2.55×103 0.990 8 0.5 1.0
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表 4 方法的添加回收率和精密度(n=6)
Table 4 Recoveries and precisions of HPLC-MS/MS
化合物
compounds添加水平/μg·kg-1
added level平均回收率/%
average recovery相对标准偏差/%
RSD化合物
compounds添加水平/μg·kg-1
added level平均回收率/%
average recovery相对标准偏差/%
RSDα-玉米赤霉醇
α-zearalanol1 80.6 9.81 β-玉米赤霉烯醇
β-zearalenol1 75.9 11.6 5 88.2 6.22 5 77.7 7.54 10 93.4 5.14 10 82.7 3.90 β-玉米赤霉醇
β-zearalanol1 77.2 11.3 玉米赤霉酮
zearalenone1 76.5 12.0 5 79.1 7.61 5 78.2 5.57 10 89.3 4.50 10 83.2 4.86 α-玉米赤霉烯醇
α-zearalenol1 79.1 13.5 玉米赤霉烯酮
zearalenone1 81.7 9.12 5 82.8 6.45 5 93.2 5.39 10 94.4 5.37 10 103.8 4.92
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