HPLC-MS/MS determination of zeranols residues in aquatic products
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摘要:
文章建立用高效液相色谱-串联质谱法(HPLC-MS/MS)测定水产品中玉米赤霉醇类激素药物残留量的方法。用乙腈提取水产品中6种玉米赤霉醇类药物，正己烷脱脂，氨基固相萃取柱净化。采用电喷雾电离，负离子扫描，选择反应监测模式(SRM)监测，外标法定量。该法对6种玉米赤霉醇类药物标准曲线的线性回归系数均在0.99以上，线性范围0~25 μg·kg-1，方法定量限1.0 μg·kg-1。6种玉米赤霉醇类激素药物回收率75.9%~103.8%，相对标准偏差3.90%~13.5%。该法简单、灵敏，结果可靠，可满足实验室批量样品分析的需求。
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关键词:
- 高效液相色谱-串联质谱法 /
- 玉米赤霉醇 /
- 水产品 /
- 残留
Abstract:We developed a method for determining zeranols residues such as α-zearalanol, β-zearalanol, α-zearalenol, β-zearalenol, zearalanone and zearalenone by high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry (HPLC-MS/MS).The samples were extracted with acetonitrile, degreased with hexane and purified with amino solid-phase extraction column. In addition, with electrospray ionization in negative mode, we monitored the samples with selected reaction monitoring (SRM) and quantified them with external standard method. For the 6 zeranols, it shows good linear regression coeffcient in the standard curve (all >0.99); the linear range is 0~25 μg·kg-1; the limit of detection is 1.0 μg·kg-1; the average recovery is 75.9%~103.8%, and the relative standard deviation is 3.90 %~13.5 %. The method, which is simple, sensitive and reliable, can be used to identify and quantify zeranols residues in aquatic products.
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华贵栉孔扇贝(Chlamys nobilis)隶属于扇贝科、栉孔扇贝属，为暖水性双壳贝类，自然分布于日本的本州岛、四国岛、九州岛、中国的南海、泰国及印度尼西亚等地。在广东省沿海的海门、遮浪、大亚湾、大鹏湾及闸坡等地均有分布。其闭壳肌干制品俗称“干贝”，是名贵的海珍品，营养和经济价值很高。华贵栉孔扇贝养殖周期短，一般1~1.5年达到商品规格，是一种有开发前景的经济养殖贝类。华贵栉孔扇贝育苗与养殖生物学的研究促进了其养殖业在福建、广东和广西等地的发展[1]。但在其养殖过程中也存在许多问题，如自发展养殖生产以来，年复一年，几乎都是采用养殖的成贝做亲贝，未进行选择，特别是为了避免精子过多，在生产中只使用少量的雄性个体，这样可能使其遗传结构发生改变、遗传多样性下降[2]，从而在生产中出现种质衰退、活力下降及死亡率升高等现象[3]。通过遗传育种提高华贵栉孔扇贝的种质质量，已取得了一些初步效果[4-7]。选择育种是贝类品种培育极见成效的育种技术，形态性状(壳长、壳高及壳宽)和体质量等产量性状是贝类选择育种及定向培育中常用的指标[8]。阐明形态、体质量等指标的相互关系，将为加快育种工作的进程提供重要的参考资料。
关于华贵栉孔扇贝各形态性状和质量性状间的相关分析已有研究报道[9-11]，可是上述研究只分析了某一特定生长阶段的测量数据，无法反映各个生长或贝龄时期各性状的相关关系。但是选择育种时往往需要在不同的生长阶段进行留种，所以探讨不同贝龄期各个性状指标的相关关系，对于选择育种更具有实际指导作用。该研究对华贵栉孔扇贝进行了约1年的生长测量，对5个贝龄期4个数量性状之间的相关性及影响体质量的因素组成进行了分析，以期为选择育种提供指导。
1. 材料与方法
所用的华贵栉孔扇贝来源于2009年4月人工繁育的苗种，养殖于深圳大亚湾大鹏澳海区。在5个贝龄期(3月龄、6月龄、7月龄、9月龄和15月龄)，分别从该养殖群体中随机取100只扇贝对其壳高(SH)、壳长(SL)、壳宽(SW)和体质量(TW)进行测量，测量前将贝体表面的所有附着物及淤泥清洗干净。体质量用电子分析天平称量，精确到0.01 g，壳形态大小用数显测量尺测量，精确到0.01 mm。
采用SPSS 16.0统计软件进行表型相关分析和通径分析。通径分析参照杜家菊和陈志伟[12]的方法进行，设TW为因变量，SH、SL、SW为自变量，因变量实施正态性检验后，然后进行逐步回归分析，并建立线性回归方程。
2. 结果
2.1 5个贝龄期4个数量性状的表型相关分析
5个贝龄期华贵栉孔扇贝的壳高、壳长、壳宽和体质量的平均值见表 1。4个性状间的表型相关系数见表 2，都呈正相关，并达到极显著水平(P < 0.001)。在6月龄、7月龄、9月龄和15月龄贝中，壳高与壳长之间的相关系数在所有性状间最高(0.967、0.986、0.986和0.948)；3月龄贝中壳长与体质量间的相关系数最高。在形态性状与体质量之间，除6月龄外，其他4个贝龄期的壳长与体质量的相关系数最高，壳宽与体质量的相关系数最小。
表 1 不同月龄华贵栉孔扇贝4个数量性状的大小(n=100)Table 1. Four quantitative traits of C.nobilis at different ages月龄
months of age壳高/mm
SH壳长/mm
SL壳宽/mm
SW体质量/g
TW3 27.65±4.80 24.82±4.35 9.26±1.52 3.74±1.91 6 42.42±6.24 39.58±5.92 13.41±2.11 11.69±4.73 7 46.02±6.32 43.58±6.21 14.40±2.05 14.74±5.46 9 53.33±7.10 50.89±7.00 16.78±2.28 22.43±8.08 15 60.71±5.85 58.00±5.62 21.09±1.95 36.97±8.88 表 2 华贵栉孔扇贝各数量性状间的Pearson相关系数Table 2. Pearson correlation coefficients among quantitative traits of C.nobilis月龄 months of age 性状 trait 体质量 TW 壳高 SH 壳长 SL 壳宽 SW 3 TW - 0.840* 0.923* 0.790* SH - 0.875* 0.785* SL - 0.880* SW - 6 TW - 0.964* 0.953* 0.872* SH - 0.967* 0.837* SL - 0.853* SW - 7 TW - 0.961* 0.964* 0.903* SH - 0.986* 0.885* SL - 0.897* SW - 9 TW - 0.954* 0.958*** 0.861* SH - 0.986*** 0.836* SL - 0.866* SW - 15 TW - 0.916* 0.929* 0.775* SH - 0.948* 0.638* SL - 0.700* SW - 注：*. P < 0.001
Note：*. P < 0.0012.2 壳形态性状对体质量的通径分析
根据通径分析原理，利用性状间的表型相关系数分析结果，得到各性状对体质量的通径系数，进而得到相关指数，6月龄、7月龄、9月龄和15月龄各形态性状对体质量的相关指数分别为0.943、0.936、0.937和0.910。正态分布检验表明3月龄贝的体质量不符合正态分布，因而未对其进行通径分析，其他4个贝龄期壳形态性状对体质量的通径分析结果见表 3。在6月龄贝中壳长对体质量的回归系数不显著。壳高对体质量的通径系数最大为0.783(6月龄)，壳长对体质量的通径系数最大为0.428(7月龄)，壳宽对体质量的通径系数最小为0.158~0.266，除7月龄外，壳高的通径系数都大于壳长的通径系数。在6月龄、7月龄和9月龄，壳宽通过壳高或壳长对体质量的间接作用最大，且明显大于直接作用，15月龄时的间接作用与直接作用的差异较小。
表 3 形态性状对体质量的通径分析Table 3. Path analysis of morphological traits to total weight月龄
months of age形态性状
morphological trait直接作用
direct effect间接作用 indirect effect 壳长 SL 壳高 SH 壳宽 SW 合计 total 6 SH 0.783 - - 0.181 0.181 SW 0.216 - 0.655 - 0.655 7 SL 0.428 - 0.354 0.166 0.520 SH 0.366 0.414 - 0.163 0.577 SW 0.195 0.365 0.306 - 0.671 9 SL 0.382 - 0.439 0.137 0.576 SH 0.445 0.377 - 0.132 0.509 SW 0.158 0.331 0.372 - 0.703 15 SL 0.345 - 0.397 0.186 0.583 SH 0.419 0.327 - 0.170 0.497 SW 0.266 0.242 0.267 - 0.509 从表 4可以看出，除7月龄外，壳高对体质量的直接决定系数最大，其次是壳长，最小为壳宽；壳长通过壳高对体质量的间接决定系数最大。以体质量为依变量，其他3个壳形性状为自变量进行多元回归分析，通过逐步剔除偏回归系数不显著的自变量，建立了4个月龄期的线性回归方程，其线形回归系数都达到显著水平(P < 0.05)。
表 4 形态性状对体质量的决定系数Table 4. Coefficient of determination of morphological traits to total weight月龄
months of age形态性状
morphological trait直接决定系数
direct coefficient of determination间接决定系数 indirect coefficient of determination 壳长 SL 壳高 SH 壳宽 SW 合计 total 6 SH 0.613 - - 0.283 0.896 SW 0.047 - - - 0.047 7 SL 0.183 - 0.309 0.150 0.642 SH 0.134 - - 0.122 0.256 SW 0.038 - - - 0.038 9 SL 0.146 - 0.335 0.105 0.586 SH 0.198 - - 0.118 0.316 SW 0.025 - - - 0.025 15 SL 0.119 - 0.274 0.128 0.521 SH 0.176 - - 0.142 0.318 SW 0.071 - - - 0.071 TW6=-19.948+0.593SH+0.483SW(R2=0.943)
TW7=-23.639+0.317SH+0.376SL+0.521SW(R2=0.936)
TW9=-36.441+0.507SH+0.441SL+0.56SW(R2=0.937)
TW15=-58.855+0.419SH+0.345SL+0.266SW(R2=0.91)
3. 讨论
利用多元回归分析弄清形态性状与体质量之间的关系对于选择育种具有非常重要的现实意义[10]。ROBERT等[13]根据大扇贝(Pecten maximus)双轮幼体形态学特征和幼体脂肪含量与最大形变进行了多元回归分析；AHMED和ABBAS[14]利用多元相关分析了鱼、鲸和贝类幼龄期体长、体质量相关的生长参数。华贵栉孔扇贝作为一种食用贝类，在养殖生产和育种中活体质量是生产性能的直接反映，也是良种选育中最关注的目标性状。然而，与准确测量的形态性状相比，体质量性状准确测量操作的难度较大。因此，分析形态性状(壳长、壳高及壳宽等)与体质量等之间的关系以及作用效果，对制定合适的选育指标和育种策略具有重要的意义。该研究表明，华贵栉孔扇贝的数量性状在其5个贝龄期4个数量性状两两间都呈正相关，并达到极显著水平。在3月龄时因其体质量不符合正态分布，不能建立线性偏回归方程，即在该阶段通过对壳形性状的选择难以达到对体质量的选择。在表型相关分析的基础上，进行通径系数分析和决定系数分析，当相关指数R2≥0.85时，表明影响依变量的主要自变量已经找到。此研究中形态性状(壳高、壳长和壳宽)对体质量的相关指数为0.910~0.943，说明壳形状是影响体质量的主要因素。在6月龄时壳长对体质量的偏回归系数不显著，壳高对体质量的直接作用最大(78.3%)，壳高通过壳宽的间接作用明显大于壳宽的直接作用，表明在该阶段主要以壳高进行选择，就可达到增加体质量的目的。在生长的后几个测量阶段(7月龄、9月龄和15月龄)，壳长、壳高对体质量的直接作用都大于壳宽，壳高对体质量的决定系数大于壳长，壳长通过壳高对体质量的间接决定系数最大，在这些阶段选育指标应以壳高为主，同时可对壳长开展协同选择，就可达到对体质量的选择。郑怀平等[10]对1龄华贵栉孔扇贝的通径分析也表明，以提高活体质量为目标，主要选择壳高，同时加强对壳长的协同选择。闭壳肌肉是扇贝的重要产品形式，如以提高闭壳肌质量为目标，主要选择壳长，同时加强对壳宽的协同选择[10]，而刘志刚等[9]的报道则认为应以壳宽为第一选育目标性状，其次是体质量和壳长。这些研究结果差异产生的原因可能是所分析样品的生长状况或遗传背景有差异，虽然他们所分析的都是1龄的华贵栉孔扇贝，但其形态性状与体质量性状差异较大，如1个群体的活体质量为46.88 g，闭壳肌质量3.88 g，而另一个所分析群体活体质量为57.16 g，闭壳肌质量6.76 g。从此研究的数据也可以看出，由于不同年龄段其大小不同，形态性状对体质量的影响也会随之发生一些变化。而且这些差异原因还可能与所分析的种类有很大的关系，如刘志刚等[15]的研究表明，马氏珠母贝(Pinctada martensii)壳长对体质量的决定效应最大。刘小林[16]的研究指出壳高对栉孔扇贝(C.farreri)活体质量的影响最大，杨彦鸿等[17]的研究指出青蛤(Cyclina sinensis)的壳长对体质量的决定效应最大。因此，形态性状对体质量影响效果的分析要充分考虑所分析样品的遗传背景、年龄和生长状况等因素。
多元回归分析已广泛应用于水产动物数量性状间的相关分析，并对育种实践中选择指标的确立提供了一定的参考价值，对马氏珠母贝壳高进行选择时其体质量也获得了较大的遗传进展[18]。但也存在其他一些情况，有报道表明当对某个性状进行选择时其他性状有时与其呈负相关[19-21]。当对壳高选择时，扇贝(Argopecten ventricosus)后代体质量的相关反应不明显，而当对体质量选择时，壳宽却发生了8%~9%的相关反应[19]。此结果显示在育种实践中，各选育性状的相关性研究需要与各性状的遗传力大小及育种的策略等研究相结合。
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图 1 6种玉米赤霉醇类激素药物标准品色谱图
1.玉米赤霉烯酮；2.α-玉米赤霉烯醇；3.β-玉米赤霉烯醇；4.玉米赤霉酮；5.α-玉米赤霉醇；6.β-玉米赤霉醇(后图同此)
Figure 1. Chromatogram of 6 zeranols standard solution
1. zearalenone; 2. α-zearalenol; 3. β-zearalenol; 4. zearalanone; 5. α-zearalanol; 6. β-zearalanol (the same case in the following figure)
表 1 HPLC流动相梯度洗脱程序
Table 1 HPLC mobile phase gradients
时间/min
time0.1%甲酸水溶液
0.1% formic acid in waterw(乙腈)/%
acetonitrile流速/μL·min-1
flow rate0 70 30 250 5 70 30 250 8 10 90 250 12 10 90 250 12.1 70 30 250 14 70 30 250 
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表 2 选择反应监测母离子、子离子和碰撞能量
Table 2 Optimization parameters of SRM of the analytes
化合物
compounds母离子/(m/z)
parent ion子离子/(m/z)
product ion碰撞能量/eV
collision energy保留时间/min
retention time离子丰度/%
abundance of product ionα-玉米赤霉醇
α-zearalanol321 277*
30322
259.02 20.0 β-玉米赤霉醇
β-zearalanol321 277*
30322
258.56 18.5 α-玉米赤霉烯醇
α-zearalenol319 275.2*
30124
309.15 26.2 β-玉米赤霉烯醇
β-zearalenol319 275*
30124
308.66 10.0 玉米赤霉酮
zearalanone319 275*
20523
299.61 36.2 玉米赤霉烯酮
zearalenone317 175*
27328
219.64 88.6 注：*.定量碎片离子
Note: *.quantitative fragment ion
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表 3 玉米赤霉醇类激素药物回归分析、检出限和定量限
Table 3 Regression analysis, limit of detection and limit of quantitation of zeranols
化合物
compounds线性回归方程
linear regression equation相关系数(R2)
correlation coefficient检出限/μg·kg-1
limit of detection定量限/μg·kg-1
limit of quantitationα-玉米赤霉醇
α-zearalanolY=7.37×102X-7.69×103 0.992 1 0.5 1.0 β-玉米赤霉醇
β-zearalanolY=5.42×102X-5.07×103 0.990 5 0.5 1.0 α-玉米赤霉烯醇
α-zearalenolY=1.26×102X-2.81×103 0.990 1 0.5 1.0 β-玉米赤霉烯醇
β-zearalenolY=7.69×101X-1.96×103 0.992 4 0.5 1.0 玉米赤霉酮
zearalanoneY=1.85×102X-1.64×103 0.996 4 0.5 1.0 玉米赤霉烯酮
zearalenoneY=1.35×102X-2.55×103 0.990 8 0.5 1.0
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表 4 方法的添加回收率和精密度(n=6)
Table 4 Recoveries and precisions of HPLC-MS/MS
化合物
compounds添加水平/μg·kg-1
added level平均回收率/%
average recovery相对标准偏差/%
RSD化合物
compounds添加水平/μg·kg-1
added level平均回收率/%
average recovery相对标准偏差/%
RSDα-玉米赤霉醇
α-zearalanol1 80.6 9.81 β-玉米赤霉烯醇
β-zearalenol1 75.9 11.6 5 88.2 6.22 5 77.7 7.54 10 93.4 5.14 10 82.7 3.90 β-玉米赤霉醇
β-zearalanol1 77.2 11.3 玉米赤霉酮
zearalenone1 76.5 12.0 5 79.1 7.61 5 78.2 5.57 10 89.3 4.50 10 83.2 4.86 α-玉米赤霉烯醇
α-zearalenol1 79.1 13.5 玉米赤霉烯酮
zearalenone1 81.7 9.12 5 82.8 6.45 5 93.2 5.39 10 94.4 5.37 10 103.8 4.92
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