哈维弧菌(Vibrio harveyi)为革兰氏阴性弧形短杆菌，极生单鞭毛，基因组DNA的G+C含量在46% ~48%之间，菌体大小为0.44~1.38 μm，在3%NaCl的营养琼脂平板上形成的菌落呈圆形灰色，TCBS培养基上为黄色，对O/129敏感^[1-2]。哈维弧菌在海洋环境中主要分布于自由水体、浮游动植物体表、海底沉积物中，是一种广泛存在于海洋环境中的条件致病菌，能够感染多种水产经济动物^[3-5]，给海水养殖业带来巨大的损失。

在养殖中抗菌药物的使用致使大量病原菌产生耐药性，对抗生素表现出强烈抗性，病原菌对抗菌药物的耐药性问题日益显露出来^[6-7]。细菌接触抗菌药物可发生变异获得耐药性，其机制主要有4种^[8-10]：1)产生抗生素酶，使抗生素失活；2)作用靶位变异，不应答药物；3)外膜通透性改变，阻断药物进入；4)激活外派体系，加速泵出进入体内的药物。研究发现，哈维弧菌含有多种耐药性质粒基因^[11]，可通过接合的方式传播耐药基因^[12-13]，同时哈维弧菌具有较强的外排泵作用^[14-15]，导致多重耐药的发生。

依据美国临床和实验室标准协会(clinical and laboratory standards institute)抗生素敏感试验标准，将菌株对抗生素的敏感性以抑菌圈直径为变量，划分为敏感(S)、中介敏感(I)和耐药(R)3个类别，使菌株对同一种药物获得统一和可对比性的耐药性，同一菌株对多种抗生素可形成一种特定的耐药谱型。随着宿主和时间的改变，细菌耐药谱也会发生变异^[16]。有研究发现，水产养殖环境中所分离的哈维弧菌对头孢菌素类的头孢噻吩(KF)、头孢氨苄(CEF)、头孢拉定(CEP)和头孢西丁(FOX)以及新型β-内酰胺单酰胺环类的氨曲南(AZT)等多种抗生素耐药^[17-18]。而在海产品中分离的哈维弧菌的耐药谱表现为DOX/AMP/PEN/GEN/CIP/NOR/AK、DOX/AMP/PEN/GEN/CIP^[19]。此外，研究者对马来西亚的斑节对虾(Penaeus monodon)哈维弧菌的耐药性研究发现，对氯霉素(CHL)、四环素(TET)和呋喃唑酮(FUR)敏感菌株高达96.7%，80%菌株对卡那霉素敏感，56.7%菌株对磺胺甲基异哑唑(SMZ)敏感^[20]。不同来源的哈维弧菌的耐药谱研究证实，不同宿主、地点以及时间所分离的菌株耐药谱存在明显差异。

该研究以2012年~2014年南海沿海养殖区域患病鱼体分离得到的90株哈维弧菌为对象，测定其对12种常见抗生素的敏感性，并根据地点、时间以及宿主情况，分析其耐药谱差异。以形成的抑菌圈直径为变量，对各菌株的耐药性情况进行系统聚类，分析耐药谱的聚类关系，为南海地区的哈维弧菌的聚类情况和分析耐药谱的变迁提供依据。

1.   材料与方法

1.1   菌株来源

90株哈维弧菌菌株为笔者实验室保存菌株，于2012年7月至2014年5月分离自广东、广西和海南沿岸养殖的患病鱼(图 1)，其中海南沿岸(包括海南的东海线陵水新村港、文昌烟堆、文昌铺前、三亚红沙、琼海谭门、黎安)分离株56株，其主要的宿主是乌鲳(Formio niger)、棕点石斑鱼(Epinephelus fuscoguttatus)、珍珠龙趸(鞍带石斑鱼♂×棕点石斑鱼♀)、卵形鲳鲹(Trachinotus ovatus)、点篮子鱼(Siganus guttatus)、布氏鲳鲹(T.blochii)、东星斑(Plectropomus leopardus)、青石斑鱼(E.awoara)、军曹鱼(Rachycentron canadum)和川纹笛鲷(Lutjanus sebae)等；广东沿海地区(包括饶平井州、红山码头、欧边、惠东盐州港、流沙港、深圳南澳、珠海桂山岛等)分离株31株，其宿主主要是浅色黄姑鱼(Nibea coibor)、卵形鲳鲹、点篮子鱼、双棘黄姑鱼(N.diacanthus)、珍珠龙趸、青石斑鱼、斜带髭鲷(Hapalogenys nitens)、芝麻斑(Epinephelus sp.)等；广西北海地区棕点石斑鱼分离到菌株3株。

图  1  哈维弧菌采样地点分布

Figure  1.  Sampling sites of V. harveyi

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1.2   药敏试验

采用纸片扩散法(K-B法)进行试验，记录药敏纸片抑菌圈的直径^[21]。药敏纸片为12种常见的抗生素(均购于杭州天和微生物试剂有限公司)：头孢克肟(CEF，5 μg · 片^-1)、庆大霉素(GEN，10 μg · 片^-1)、四环素(TET，30 μg · 片^-1)、环丙沙星(CIP，5 μg · 片^-1)、诺氟沙星(NOR，10 μg ·片^-1)、氯霉素(CHL，30 μg · 片^-1)、复方新诺明(T/S，23.7/1.25 μg · 片^-1)、利福平(RIF，5 μg ·片^-1)、呋喃唑酮(FUR，100 μg · 片^-1)、阿莫西林(AMO，20 μg · 片^-1)、红霉素(ERY，15 μg · 片^-1)和恩诺沙星(ENR，10 μg · 片^-1)。以大肠杆菌ATCC25922为质控菌，参照美国临床和实验室标准协会^[22-24](clinical and laboratory standards institute)抗生素敏感试验标准对耐药谱进行分析。

1.3   耐药谱的分析

统计抗生素所形成的抑菌圈直径大小，将每种抗生素的耐药情况用S、I、R记录，每株菌株对12种抗生素形成唯一的耐药谱。对耐药谱进行统计分类，计算耐药率，并根据地区、时间以及宿主的不同统计分析具有耐3种及以上抗生素的耐药谱型的差异。其中耐药谱统计分类的分析方法如下：

耐药率：某一细菌对抗生素的耐药菌株与检验的总菌株数的比率；

耐药谱型丰富度：菌株具有的耐药谱型数量与菌株数量的比值；

耐药谱型率：部分菌株具有的耐药谱型数量占全部菌株具有的耐药谱型数量的比率。

1.4   哈维弧菌耐药性的聚类分型

采用SPSS 19.0软件对菌株进行聚类分析，以抗生素形成的抑菌圈直径作为变量，采用系统聚类^[25]的方法进行聚类分析，以平方Euclidean距离表示菌株间的耐药性同类关系，结果以树状图的形式显示。

2.   结果

2.1   哈维弧菌的耐药谱型

对90株哈维弧菌抗生素的耐药谱型进行分析，得到A~Z共26种耐药谱型，谱型丰富度为28.9%，各谱型对应的耐药谱见表 1，其中A、I和J的耐药谱型均为抗2种抗生素，且3个耐药谱均抗阿莫西林，包含菌株45株，占总菌数的50%，谱型丰富度为11.5%；C型耐药谱仅抗阿莫西林1种抗生素，包含菌株9株，占总菌数10%，谱型丰富度为3.8%；B、D、G、H、V、Y和Z型耐药谱均抗3种抗生素，除Y和Z外，其他耐药谱的均抗阿莫西林，包含菌株共12株，占总菌数的13.3%，谱型丰富度为27%；K型不抗任何抗生素，共1株；其余的14种耐药谱型均为抗3种以上的抗生素，包含菌株共23株，占总菌数的25.6%，谱型丰富度为53.8%。

表  1  哈维弧菌菌株耐药谱分型

Table  1.  Antibiogram types of V. harveyi strains

谱型 type	菌株数 number of strain	耐药谱 antibiogram	谱型 type	菌株数 number of strain	耐药谱 antibiogram
A	42	FUR/AMO	N	1	T/S/CEF/RIF/TET
B	1	FUR/NOR/AMO	O	1	FUR/T/S/CEF/RIF/TET
C	9	AMO	P	1	FUR/T/S/CEF/RIF/TET/ERY/AMO
D	1	FUR/CEF/AMO	Q	1	FUR/T/S/CEF/RIF/ERY/AMO
E	1	FUR/RIF/ERY/AMO	R	4	FUR/T/S/CEF/RIF/AMO
F	1	FUR/GEN/ERY/AMO	S	1	T/S/CEF/RIF/TET/AMO
G	5	FUR/RIF/AMO	T	4	FUR/T/S/CEF/AMO
H	2	FUR/ERY/AMO	U	1	FUR/T/S/CEF/ERY/AMO
I	1	ERY/AMO	V	1	FUR/GEN/AMO
J	2	RIF/AMO	W	1	FUR/T/S/CEF/TET/ERY/AMO
K	1		X	1	FUR/NOR/RIF/CIP
L	2	FUR/T/S/CEF/RIF/CHL/TET/ERY/AMO	Y	1	FUR/NOR/RIF
M	3	FUR/T/S/CEF/RIF/CHL/TET/AMO	Z	1	T/S/CEF/RIF

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从时间分布上看，2012年、2013年和2014年分别具有10、18和8种耐药谱型，从地区分布上，海南、广东和广西三个地区分别包含17、13和2种耐药谱型。2012年7月~12月分离株22株，具有耐药谱型10种，谱型丰富度38.5%，耐药谱型丰富度45.5%，K型不抗任何抗生素，除Z型一株外其他20株菌株均耐阿莫西林，耐药抗生素种类最多达8种。2013年分离株46株，具有18种谱型，谱型丰富度为69.2%，耐药丰富度为39.1%，耐药广泛，从1种到8种均有，大多包含FUR/T/S/CEF、AMO、FUR/RIF三种之一。2014年1月~5月分离株22株，具有耐药谱型8种，谱型丰富度为30.8%，耐药谱型丰富度为36.4%。宿主间耐药谱差异明显，如珍珠龙趸、棕点石斑鱼和浅色黄姑鱼分离菌株耐药谱分别是17、7和5种，而其他宿主如卵形鲳鲹、点篮子鱼、双棘黄姑鱼、青石斑鱼、军草鱼等耐药谱为1~3种(图 2)。

图  2  90株哈维弧菌耐药谱及其聚类分析

CEF. 头孢克肟；GEN. 庆大霉素；TET. 四环素；CIP. 环丙沙星；NOR. 诺氟沙星；CHL. 氯霉素；T/S. 复方新诺明；RIF. 利福平；FUR. 呋喃唑酮；AMO. 阿莫西林；ERY. 红霉素；ENR. 恩诺沙星；图 3，表 1，表 3同此。

Figure  2.  Antibiogram and cluster analysis of 90 V. harveyi strains

CEF. Cefixime; GEN. Gentamicin; TET. Tetracycline; CIP. Ciprofloxacin; NOR. Norfloxacin; CHL. chloroamphenicol; T/S. Trimethoprim/Sulfamethoxazole; RIF. Rifampicin; FUR. Furazolidone; AMO. Amoxicillin; ERY. Erythromycin; ENR. Enrofloxacin; The same case in Fig. 3, Tab. 1 and Tab. 3.

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90株哈维弧菌对12种抗生素的耐药情况差异较大(图 3)，其中对阿莫西林的耐药率达到93.7%，呋喃唑酮的耐药率也高达82.3%；复方新诺明、头孢克肟和利福平耐药率为22%~30%；庆大霉素、诺氟沙星、氯霉素、四环素、环丙沙星和红霉素的耐药率在10%及以下；而所有菌株均对恩诺沙星不耐药。

图  3  哈维弧菌菌株对抗生素的耐药性情况比较

Figure  3.  Comparison of antibiotic resistance of V. harveyi strains

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2.2   哈维弧菌耐药性的聚类分析

对90株哈维弧菌做样本聚类分析，以12种抗生素的抑菌圈直径具体数值作为变量(图 2)，大部分菌株聚类为i~v 5个亚群；当欧式平方达到2时，亚群ⅰ、ⅱ先合并为Group Ⅰ，ⅳ、ⅴ优先合并为一支；当欧式平方达到3时，亚群ⅲ、ⅳ、ⅴ合并为Group Ⅱ。当欧式平方达到5时Group Ⅰ、Group Ⅱ两个组群聚合。另外4株菌株聚类结果欧式距离平方较大，归于其他类。90株哈维弧菌聚类分析得到Group Ⅰ、Group Ⅱ和其他组群，分别含有11、12和4种耐药谱，耐药谱型率分别为16.9%、57.1%和100%。在同一亚群中，包含多种的耐药谱型，亚群间耐药谱型相差大，菌株数量差异也很大。

2.3   哈维弧菌2个耐药组群的比较分析

总体上，组群Group Ⅱ的耐药率要高于Group Ⅰ(表 3)。2个组群在T/S、CEF、RIF、CHL和TET的敏感性存在明显的差异，且Group Ⅰ明显高于Group Ⅱ。2个组群在FUR、NOR、CIP、ENR和AMO耐药性与敏感性均无明显差异。Group Ⅰ与Group Ⅱ2个组群对FUR、TET、CIP和ENR在中介敏感上存在着明显差异。此外，耐药谱型量Group Ⅱ要多于Group Ⅰ，谱型丰富度更高。

表  2  哈维弧菌耐药亚群的耐药谱分布

Table  2.  Antibiotic resistance patterns of different V. harveyi subgroups

组群 group	亚群 subgroup	菌株数 number of strain	谱型数 number of types	谱型率/% type rate	谱型丰富度/% type abundance	耐药谱(谱型/菌株数) antibiogram (type/number of strains)
Group Ⅰ	ⅰ	58	8	30.7	13.8	C/9，A/40，B/1，D/1，E/1，F/1，G/3，H/2
	ⅱ	7	5	19.2	71.4	K/1，A/1，J/2，I/1，G/2
Group Ⅱ	ⅲ	6	4	15.4	66.7	L/1，M/3，N/1，O/1，
	ⅳ	8	5	19.2	62.5	L/1，P/1，Q/1，R/4，S/1
	ⅴ	7	4	15.4	57.1	T/4，U/1，V/1，W/1
其他other		4	4	15.4	100	X/1，Y/1，Z/1，A/1

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表  3  哈维弧菌耐药菌群对抗生素敏感(S)、中介(I)、耐药(R)情况比较

Table  3.  Comparison of antibiotic resistance from susceptible, intermediate and resistance of V. harveyi

耐药性 results of resistant	耐药菌群 group	耐药率/% resistance
		FUR	T/S	GEN	CEF	NOR	RIF	CHL	TET	CIP	ENR	ERY	AMO
S	Group Ⅰ	1.54	96.92	58.46	92.31	100	66.15	100	95.38	95.38	96.92	15.38	1.54
	Group Ⅱ	9.52	4.76	66.67	0	100	14.29	71.43	38.1	80.95	85.71	14.29	4.76
	其他	25	75	100	75	50	0	75	100	75	50	50	75
I	Group Ⅰ	18.46	3.08	40	6.15	0	20	0	3.08	4.62	3.08	78.46	0
	Group Ⅱ	0	0	33.33	0	0	19.05	4.76	14.29	19.05	14.29	57.14	4.76
	其他	0	0	0	0	0	25	25	0	0	50	50	0
R	Group Ⅰ	80	0	1.54	1.54	0	13.85	0	1.54	0	0	6.15	96.92
	Group Ⅱ	90.48	95.24	0	100	0	66.67	23.81	47.62	0	0	28.57	90.48
	其他	75	25	0	25	50	75	0	0	25	0	0	25

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2.4   哈维弧菌的多重耐药性

多重耐药谱是菌株抗3类及以上抗生素形成的耐药谱，该研究多重耐药谱21种，包含菌株共35株，占总菌数的38.9%，谱型丰富度为80.8%，包括海南20株、广东12株和广西3株(表 4)，分别占该地区菌株总数的21.4%、25.8%和100%。海南地区分离株的多重耐药谱包括FUR/T/S/CEF、以及FUR/GEN/ERY/AMO或FUR/NOR/RIF/CIP两种耐药谱。广东沿海地区的分离株多重耐药谱多数包含T/S/CEF/RIF/TET、RIF/ERY/AMO和RIF/TET/AMO之一。广西沿海地区的分离株耐药谱包括FUR/T/S/CEF/TET/ERY/AMO和FUR/T/S/CEF/AMO两种。

表  4  广东、海南、广西地区抗3种及以上抗生素耐药谱情况

Table  4.  Three or more than three kinds of antibiotic resistance patterns in Guangdong, Hainan, Guangxi Provinces

广东地区Guangdong			海南地区Hainan			广西地区Guangxi
耐药谱型 antibiogram type	菌株数 number of strains		耐药谱型 antibiogram type	菌株数 number of strains		耐药谱型 antibiogram type	菌株数 number of strains
B	1		D	1		T	2
E	1		F	1		W	1
G	2		G	3
M	2		H	2
N	1		L	2
O	1		M	1
P	1		Q	1
R	1		R	3
S	1		T	2
Y	1		U	1
			V	1
			X	1
			Z	1

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3.   讨论

3.1   哈维弧菌的耐药情况

有研究指出，在养殖场中细菌的密度、单位体积内生物量和群落结构等可能会引起细菌耐药性的变化，细菌敏感性试验表明沉积物造就了细菌的高百分比，广谱的耐药性^[26-27]。哈维弧菌的耐药谱会随着环境、人为条件的变化不断改变。有学者对水产致病菌耐药性进行了研究，54个受试菌株检出42个耐药株，耐药率高达77.8%^[28]。对2012年~2014年采集的90株哈维弧菌分离株，试验中选择的12种抗生素包括国标渔药以及以前可用或禁用的药物，后续的研究工作者可用于借鉴分析养殖中抗生素可能的使用情况、抗生素风险及耐药性污染的评估工作。药物敏感性分析结果显示，菌株的耐药谱型丰富度达28.9%，其中多重耐药谱(耐3类及以上抗生素)21种，包含菌株共35株，占总菌数的38.9%，谱型丰富度为80.8%。耐抗生素种类最高达8种，说明从南海地区养殖鱼分离的哈维弧菌具有复杂多样的耐药谱。

3.2   哈维弧菌耐药性的时空分布

随着时间年份递进，哈维弧菌耐药谱种类也发生着变化更新，耐药谱不断扩大延伸。对2012年、2013年和2014年的耐药谱进行分析(图 2，表 1)，3个年份对庆大霉素、诺氟沙星、氯霉素、环丙沙星耐药率低；对利福平的耐药率相近(30%)；对呋喃唑酮、阿莫西林的耐药率高(90%以上)；对头孢克肟、四环素、复方新诺明的耐药率存在明显的差异，如头孢克肟3年耐药率分别是18.2%、32.6%和13.6%，2013年明显高于其他2年；对红霉素均处于中介敏感，没有明显差异；对恩诺沙星的耐药率为0。2006年研究了香港地区的两个自然保护区分离的所有弧菌对氨苄西林、羧苄青霉素、先锋霉素、克林霉素、硫酸粘菌素、红霉素、梭链孢酸、甲氧西林、呋喃妥英和青霉素的耐药性^[29]，结果表明哈维弧菌具有广谱的耐药性，与该研究结果相近，说明地区不同，哈维弧菌菌株均具有多重耐药性。2007年~2012年南海地区分离的哈维弧菌对12种常见抗生素的耐药性试验结果显示，共包含26种耐药谱型，多重耐药谱型数量为13种，占总耐药谱型数量的50.0%^[30]，此试验与2007年~2012年南海地区哈维弧菌多种耐药性比较，哈维弧菌2012年~2014年多种耐药谱数量上升到21种，包含的菌株更多，说明南海地区病原菌的耐药性在增强，抗生素更加广泛，对水产养殖业来说病原菌的危害也更大。

海南、广东和广西3个地区分别包含17种、13种和2种耐药谱型，3个地区的耐药谱型差异明显。地区上也存在共性，例如，海南和广东地区分离株对环丙沙星、恩诺沙星、诺氟沙星抗生素敏感性高，对阿莫西林、呋喃唑酮的耐药率高，含有5个相同的耐药谱型A(FUR/AMO)、C(AMO)、R(FUR/T/S/CEF/RIF/AMO)、M(FUR/T/S/CEF/RIF/CHL/TET/AMO)、J(RIF/AMO)。研究发现伊朗波斯湾的海产品分离的哈维弧菌中97.2%的菌株对氨苄青霉素耐药，83.3%菌株对庆大霉素耐药，77.7%对青霉素耐药^[19]，与该试验得到的耐青霉素的结果一致，但是该试验的菌株对庆大霉素是敏感的，表明地区的差异导致耐药谱的多样性。南海地区养殖鱼类2007年~2012年分离到的哈维弧菌耐药性的研究发现，海南、广东地区的分离株均对沙星类和磺胺类抗生素敏感，对头孢克肟、呋喃唑酮、阿莫西林有较高耐药率^[30]。对比2012年以前，同一地区分离株对呋喃唑酮耐药率升高，而对庆大霉素、四环素敏感性有一定升高。在南海地区海水鱼病原菌对头孢克肟、呋喃唑酮、阿莫西林等药物高度耐药，有可能是早期药物的使用导致高耐药菌的产生，高耐药菌常携带大量耐药基因和质粒，会导致耐药性在养殖海域内扩散，危害海域环境微生态安全，对可持续的水产养殖造成威胁。

从宿主看，同一宿主分离到的哈维弧菌耐药谱也具有多样性，且宿主间耐药谱差异明显(图 2)。然而，在不同宿主间也存在着相同的耐药谱，例如棕点石斑鱼、珍珠龙趸和浅色黄姑鱼有A(FUR/AMO)、C(AMO)和G(FUR/RIF/AMO)3种共同的耐药谱。对军曹鱼养殖水体及肠道弧菌耐药性研究发现，氯霉素和庆大霉素对弧菌的抑制效果最佳^[31]；对海水养殖鱼分离的哈维弧菌耐药性研究发现，青石斑鱼、棕点石斑鱼、卵形鲳鲹和珍珠龙趸耐药谱型分别有6、6、9和10种^[31]。综上，从不同海水养殖鱼宿主上分离的哈维弧菌，对抗生素的耐药性有显著差异，呈现多样的耐药谱型。

3.3   哈维弧菌的耐药谱聚类分析

聚类分析是对于静态数据分析的一门技术^[32]，是把相似的对象通过静态分类的方法分成不同的组别或者更多的子集，让在同一个子集中的成员对象都有相似的一些属性，常见的包括在坐标系中更加短的空间距离等^[33]。例如对15株鱼诺卡氏菌聚类分析结果显示，15个菌株在T=23时可分为2个组群，在T=11时2个组群，分别可分为2个和4个亚群^[34]。该试验以12种抗生素抑菌圈的直径作为变量，采用SPSS 19.0做耐药性的聚类分析。结果显示将90株哈维弧菌分为3个大群，5个亚群。在欧式距离平方为2时，亚群ⅰ、ⅱ聚类为Group Ⅰ；而达到3时，亚群ⅲ、ⅳ、ⅴ聚类为Group Ⅱ；在距离为5时两个大群合在一起。另外还有4株菌相距远，不能完成聚类，归为其他类。

哈维弧菌耐药谱研究表明，耐药谱聚类简单，在欧式平方为1时分为6个亚群，进而合为2个组群^[30]。随着年份的改变，聚类分析更复杂、多样，除了2个主要的组群Group Ⅰ和Group Ⅱ之外，还存在着4株难以聚类的哈维菌株。总体上，组群Group Ⅱ的耐药率要高于Group Ⅰ，而所有菌株对FUR和AMO的抗性均较高。而Group Ⅰ与Group Ⅱ 2个组群对抗生素的敏感性主要在T/S、GEN、CEF、NOR、RIF、CHL、TET、CIP和ENR抗生素存在着明显的差异，且Group Ⅰ明显高于Group Ⅱ。通过对哈维弧菌抗生素敏感性实验研究，利用SPSS软件聚类分析能较好地将耐药性相近的菌株归为一类。